Erfelijkheidsleer les 5: Mutaties en functionele effecten van mutaties

Een mutatie = een verandering in een DNA-sequentie die bijdraagt aan het ontstaan van een ziekte (= pathogenese) => fouten in de DNA-structuur

Hoe ontstaan mutaties?

Verandering in het DNA die bijdraagt aan het ontstaan van een ziekte (pathogenese)

OF Verandering in het DNA leidt tot een veranderend (of geen) eiwit met een andere

(of geen) functie

Germinaal/constitutioneel/gonadaal(= in alle cellen aanwezig, inclusief de voortplantingscellen) kan doorgegeven worden naar volgende generatie

OF Somatisch

(= slechts aanwezig i.e. beperkt aantal cellen in het lichaam) post-zygotisch ontstaan en wordt bijgevolg niet doorgegeven aan een volgende generatie

Polymorfisme (= het voorkomen van verschillende fenotypen of variaties binnen een soort, het leidt dus niet tot een ziekte maar zorgt er wel voor dat we er verschillend uitzien)

OF Pathogene mutatie = ziekteveroorzakende mutatie = causale mutatie (= wanneer

een variant leidt tot een fenotype of erfelijke ziekte)

De genetische basis van ziekten – classificatie (3 categorieën)

cytogenetische afwijkingenChromosomale herschikkingen~ 10 MbKaryotypering

moleculair cytogenetische afwijkingenSubmicroscopische chromosomale herschikkingen~ 100 KbFISH, arrayCGH

moleculaire veranderingen/ puntmutaties of genmutaties hier gaan we het vandaag over hebben~ 1 bp (d.w.z. dat er 1 nucleotide verschilt)mutatieanalyse

Classificatie van mutaties (3 categorieën)

Genoom mutaties= een verandering van het aantal intacte chromosomen in een cel (chromosoom missegregatie tijdens meiose of mitose)Bv. aneuploidie

Chromosoom mutaties= een verandering van de structuur van de individuele chromosomen (“chromosome rearrangement”)Bv. translocatie, duplicatie, deletie, inversie

Puntmutaties/genmutaties= veranderingen in de DNA-sequentie van een gen, gaande van 1 enkele nucleotide tot duizenden baseparen(steeds te klein om op te sporen met hoge resolutie cytogenetisch onderzoek) hier gaan we het deze les over hebben !!!

Classificatie van mutaties

Basepaarsubstituties (= vervangingen)(substitutie = DNA niveau)

Een substitutie = vervanging van 1 nucleotide door een andere nucleotide(Bv. vervanging van A door C)

Onderscheid tussen transitie (pu-pu; pyr-pyr) transversie (pu-pyr; pyr-pu)⬌ Indeling is afhankelijk van hun effect op eiwitniveau

- Missense- Nonsense- Silent( deze 3 = eiwitniveau)

1. Missense mutatie(= aminozuursubstitutie)= wanneer er een verandering optreedt van één enkel aminozuur

! Een speciale (weinig voorkomende) locatie van een missense mutatie is op de positie van het stopcodon, wanneer het stopcodon door een missense mutatie verandert in een coderend codon krijgt men een abnormaal verlengd eiwit !

bv. T wordt C => aminozuur tyrosine wordt het aminozuur histodine

bv. G wordt A => aminozuur arginine wordt het aminozuur lysine

2. Nonsense mutatie= wanneer een coderend codon in 1 van de 3 stopcodons verandert

Stopcodons zijn:- UAA- UAG- UGA

Wanneer dit gebeurt, krijg je een prematuur getrunceerd (= verkort) eiwit.

bv. C wordt T => CGA wordt TGA en TGA (= UGA) is een stopcodon!=> je krijgt een verkort eiwit!

bv. A wordt T => AGA wordt TGA en TGA (= UGA ) is een stopcodon!

3. Silent = silentieuze of synonieme verandering= wanneer er géén aminozuurverandering optreedt, er wijzigt wél een nucleotide maar het aminozuur blijft hetzelfde

WANT sommige mutaties geven geen fenotype (=> ieder van ons heeft mutaties)

Bv. T wordt C , MAAR tyrosine blijft tyrosine

Wat hebben we tot nu toe gezien? substitutie (dus vervangingen) in coderende codons!

Nu: substitutie in niet-coderende codons!

Splice site mutaties

= wanneer een mutatie in splice donor of acceptor leidt tot aberrante RNA splicing.

Het mature mRNA (= het messengerRNA dat we gebruiken) bestaat enkel uit exonen, dit vraagt dus om een uitsplitsing van intronen.

`

Waar zitten belangrijke sequenties?Aan het einde van een exon en het begin van een intron + zéker de rode!

De splice donor is de 5’ splice site met als voornaamste consensus sequentie ‘GT’. De splice acceptor is de 3’ splice site met als voornaamste consensus sequentie ‘AG’ (GT en AG zijn de voornaamste sequenties). de overgrote meerderheid van intronen start met GT en eindigt met AG.

‘Splice site mutaties’ kunnen het resultaat zijn van substituties/deleties/inserties in de intron-exon boorden of “boundaries”.

Verschillende effecten zijn hier mogelijk:

zie cursus

Deletie/insertie

Deletie = verlies van 1 of meer nucleotidenInsertie = aanwinst van 1 of meer nucleotidenDuplicatie = de verdubbeling van een DNA-fragment (het is een speciale vorm van een insertie)( kan gaan van subtiele intragenische veranderingen tot partiële of totale gendeleties of –duplicaties)

“in frame” = een deletie/insertie van een veelvoud van 3 nucleotiden. het leesraam wordt niet verstoord ze zijn niet noodzakelijk pathogeen

“out of frame’/frameshift” = een deletie/insertie van een aantal nucleotiden dat geen veelvoud van 3 is. frameshift = een verschuiving in het leesraamframeshift mutaties resulteren meestal in de introductie van een prematuur stopcodon, wat leidt tot premature terminatie van translatie een getrunceerd (= verkort) proteïne (of eiwit) omwille van vorig pijltje zijn frameshift mutaties meestal pathogeen

Voorbeeld van een frameshift: deletie/insertie van een aantal nucelotiden dat geen veelvoud is van 3.Voorbeelden:-out of frame-

-in frame-

Mooie illustratie!

Triplet repeat expansies

Triplet repeats zijn herhalingen van 3 nucelotiden.

- bv. (CAG)n, (CGG)n, (CTG)n, (GAA)n- kunnen voorkomen op verschillende locaties in het genoom (5’UTR + de

coderende regio + 3’UTR, intronen)- ze worden gekenmerkt door hun variabele lengte- onderscheid tussen

dynamische mutaties ( meerderheid!!)= de repeat gedraagt zich instabiel tijdens de meiose.Bij een normaal individu: 20 à 30 repeatsBij een ziek individu: +100 of zelfs +1000 repeats Bv. meer dan 200 repeats : fragile X syndroomAfhankelijk van de plaats van die repeats in het genoom, kan dit dus leiden tot een fenotype (ziekte).Als je een dynamische mutatie doorgeeft naar een volgende generatie kunnen ze korter of langer worden (meestal langer!)

stabiele mutaties- een fenotype dat veroorzaakt wordt door een triplet repeat expansie in

opeenvolgende generaties, wordt gekenmerkt door het fenomeen van anticipatie

- anticipatie = de aanvangsleeftijd (“age of onset”) van de aandoening daalt en de ernst van de aandoening stijgt in opeenvolgende generaties

- Voorbeelden v. dit fenomeen: Fragiele X syndroom – de ziekte van Steinert – myotone dystrofie – ziekte van Huntington

(Myotone dystrofie = slappe spieren, die geen kracht hebben)

Nomenclatuur voor mutaties (internationaal!)

Je kan benoemen op 2 niveau’s:- Nucleotideniveau: de cDNA notatie wordt voorafgegaan door een ‘c’ : cDNA

referentie transcript A van ATG = +1 & de voorgaande base komt overeen met positie -1 (geen 0!!)

- Eiwitniveau/proteïneniveau: ‘p’ : proteïne

Type of changeDNA

(examples shown relate a to coding DNA reference sequence)

protein(NOTE, change deduced only !)

substitution

c.-7A>Cc.3G>T

c.88+2T>Gc.89-1G>T

p.Trp26Cys(p.W26C)

p.Trp26*(p.W26*)

deletion

c.13del(c.13delT)

c.13_16del   (c.13_16del4)

c.120_123+4del8

c.13-?_300+?

p.Gly4del(p.G4del)

p.Gly4_Gln6del(p.G4_Q6del)

p.Gly4Valfs*14(p.Gly4fs)

duplication

 c.13dup(c.13dupT)

c.92_94dup   (c.92_94dupGAC)

p.Gly4dup(p.G4dup)

p.Gly4_Gln6dup( p.G4_Q6dup)

insertion  c.51_52insTc.51_52insGAGA

p.Lys2_Leu3insGlnSer(p.K2_L3insQS)

recessive disease (changes in different alleles)

c.[76C>T];[87G>A]c.[76C>T];[?]c.[76C>T];[=]

p.[Trp13*];[Cys28Arg]p.[Trp13*];[?]p.[Trp13*];[=]

frame shift    (protein only) -

p.Gly44Valfs*14(p.Gly4fs)

p.Leu30Serfs*3(p.Leu30fs)

In deze tabel wordt onder DNA de notatie weergegeven van substituties, deleties, duplicaties en inserties op cDNA niveau.

Notatie op eiwitniveau wordt voorafgegaan door een ‘p’.

Functionele effecten van mutaties; wat zijn de effecten v.e. mutatie?

Er zijn 4 mechanismen waardoor een mutatie de functie van een eiwit kan verstoren:

- ‘loss of function’-mutaties- ‘gain of function’-mutaties- haploinsufficiëntie- dominant negatief effect

Loss of function mutaties

= veroorzaken een vermindering in de hoeveelheid of de functionele activiteit van een eiwit (genproduct is verminderd, afwezig of niet-functioneel).

meest frequente van de 4 mechanismen

Mogelijke oorzaken zijn: inactiverende mutaties in coderende of regulerende gensequenties totale gendeleties chromosomale deleties somatische mutatie mutaties die leiden tot introductie van een prematuur stopcodon

(bv. nonsense mutaties of frameshift mutaties)

Mutante boodschapper RNA’s waarin dergelijke premature stopcodons voorkomen, zijn onstabiel en worden gedegradeerd => ‘nonsense-mediated mRNA decay’Dit gebeurt enkel en alleen wanneer nonsense codons minstens 50 baseparen 5’ van het finale exon van het gen gelegen zijn.

Bij ‘loss of function mutaties’ wordt de ernst van het fenotypisch effect bepaald door de hoeveelheid overblijvend eiwit dat functioneel actief is.

Vben van aandoeningen die het gevolg zijn van loss of function mutaties:Mucoviscidose & osteogenesis imperfecta type 1,..

Gain of function mutaties = leiden tot een toename van de normale eiwitfunctie.

Mogelijke oorzaken zijn: toename in het aantal kopieën van een gen (=> vermeerderde

gendosage) trisomie (bv. Down) genduplicatie (bv. Charcot-Marie-Tooth) mutaties die leiden tot een intrinsieke verhoging van de normale

eiwitactiviteit (bv. FGFR3 in achondroplasie)

Zeldzaam:

Mutaties die leiden tot het verwerven van een nieuwe eigenschap voor het gen (bv. Sickle cel anemie)

Mutaties die geassocieerd zijn met een foutieve expressie in tijd of ruimte ( dit is wel frequent in kanker = oncogenen)

Vben. van aandoeningen met een gain of function: Huntington’s chorea, Charcot-Marie-Tooth,..

Haploinsufficiëntie

= een verlies van 50% van het eiwit is niet meer voldoende voor normale functie en leidt tot ziekte.

Dominant negatief effect

= verlies van normale eiwitfunctie + antagonisme van mutant genproduct met normale genproduct (bij heterozygoten).

Wordt typisch/vaak gezien in genen die coderen voor eiwitten die di- of multimeren vormen.

Illustratie in collageen genmutaties

mutatie

verstoring RNAstabiliteitcoderende regio regulerende regio

heterochronische ofatopische expressie

‘loss of funtion’

‘gain of funtion’

nieuwe eiwit functie

nonsense mediated RNA decay

eiwit abnormaal eiwit normaal

↑ hoeveelheid

↓hoeveelheid

mutatie

verstoring RNAstabiliteitcoderende regio regulerende regiocoderende regio regulerende regio

heterochronische ofatopische expressie

‘loss of funtion’

‘gain of funtion’

nieuwe eiwit functie

nonsense mediated RNA decay

eiwit abnormaal eiwit normaaleiwit abnormaal eiwit normaal

↑ hoeveelheid

↓hoeveelheid

Type 1 collageen bestaat uit 3 helicale subunits - 2 alfaketens gecodeerd door het COL1A1 gen - 1 alfa2-keten gecodeerd door het COL1A2gen

Null allelen in COL1A1 zijn minder erg dan missense mutaties die incorporatie toelaten in “triple” helix met als gevolg verkeerde opvouwing: null allelen leiden tot haploinsufficientie (Ol type 1)&missense mutaties leiden tot een dominant negatief effect (Ol type 2,3 en 4 geassocieerd met een ernstiger fenotype)

Dit fenomeen wordt benoemd als pleiotropisme / allelism: de verschillende allelen van een gen leiden tot verschillende fenotypes.

Osteogenesis imperfecta

= ‘brittle bone disease’ patiënten met broze botten, die heel gemakkelijk hun botten breken.

Classificatie: Type 1: mild Type 2: lethaal Type 3: ernstig Type 4: matig

Genen: COL1A1 & COL1A2

Type 1 (zie hierboven!):- 2 alfa1 chains (COL1A1)- 1 alfa2 chain (COL1A2)

Kwantitatief defect:Wanneer er nonsense optreedt leidt dat tot een stopcodon muur is minder stevig dus het bot is minder sterk.

Kwalitatief defect:Mutaties die de structuur van het eiwit vervormen

Je hebt 2 eiwitten:- 1 is recht

- het andere niet gevolg: bouwstenen passen niet !

VOORBEELD EXAMENVRAGEN

Antwoorden zie cursus!