Felhasznált és ajánlott irodalom
Felhasznált és ajánlott irodalom
Klinikai kémia
Szarka, András
Keszler, Gergely
Szerkesztette Szarka, András
Klinikai kémia
írta Szarka, András, Keszler, Gergely, és Szarka, András
Publication date 2014
Szerzői jog © 2014-2019 Dr. Szarka András, Dr. Keszler Gergely,
Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmeilweis
Egyetem
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Tartalom
Klinikai kémia 0
I. Laboratóriumi diagnosztika 0
Előszó 0
1. Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk 0
1.1. Mintagyűjtés 0
1.1.1.1.1. Vér (minta) 0
1.1.1.1.1.1.1.1.1. Vénás vérvétel 0
1.1.1.1.1.1.1.1.2. Kapilláris vérvétel 0
1.1.1.1.1.1.1.1.3. Artériás vérvétel 0
1.1.1.1.1.1.1.1.4. A vérvételt befolyásoló tényezők 0
1.1.1.1.2. Vizelet 0
1.1.1.1.2.1.1.2.1. Gyűjtött vizeletminták 0
1.1.1.1.3. Széklet 0
1.1.1.1.4. Gerincfolyadék (liquor cerebrospinalis) 0
1.1.1.1.5. Ízületi folyadék 0
1.1.1.1.6. Magzatvíz (amniotikus folyadék) 0
1.1.1.1.7. Mellhártya, szívburok és hasűri folyadékok
(pleurális, perikardiális folyadékok és ascites) 0
1.1.1.1.8. Specifikus sejtek 0
1.2. A minták kezelése 0
1.2.1.2.1. A minták minőségének megőrzése a szállítás, tárolás
során 0
1.3. Preanalitikai variabilitások 0
1.3.1.3.1. Kontrollálható variabilitások 0
1.3.1.3.1.1.3.1.1. Élettani variabilitások 0
1.3.1.3.2. Nem-kontrollálható variabilitások 0
1.3.1.3.2.1.3.2.1. Biológiai hatások 0
1.3.1.3.2.1.3.2.2. Környezeti hatások 0
1.3.1.3.2.1.3.2.3. Alapvető egészségügyi állapot 0
2. Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett
betegségek diagnosztikájában 0
2.1. A DNS, a humán DNS főbb jellemzői 0
2.2. DNS izolálás 0
2.2.2.2.1. A sejt feltárása 0
2.2.2.2.2. A sejt saját nukleázainak inaktiválása 0
2.2.2.2.3. Szennyező alkotók eltávolítása 0
2.2.2.2.4. A DNS szelektív kinyerése 0
2.3. A DNS méret szerinti elválasztása gélelektroforézissel
0
2.4. Hibridizáció, Southern blot 0
2.5. Polimeráz láncreakció (PCR) 0
2.6. Real-time PCR, a DNS mennyiségi meghatározása 0
2.7. A PCR technika klinikai diagnosztikai alkalmazásai 0
2.7.2.7.1. Hosszúságpolimorfizmus okozta betegségek és
vizsgálatuk PCR-rel 0
2.7.2.7.1.2.7.1.1. Huntington-kór 0
2.7.2.7.2. SNP-k okozta betegségek vizsgálata PCR-re 0
2.7.2.7.2.2.7.2.1. Leiden mutáció 0
2.7.2.7.2.2.7.2.2. Sarlósejtes anémia 0
2.7.2.7.3. SNP-k és hosszúságpolimorfizmus okozta betegségek
0
2.7.2.7.3.2.7.3.1. Cisztikus fibrózis 0
2.7.2.7.4. STR lókuszok, DNS ujjlenyomat 0
2.8. DNS chip 0
3. Klinikai enzimológia 0
3.1. Izoenzime 0
3.2. Az enzimaktivitás meghatározásának körülményei 0
3.3. Kreatin-kináz 0
3.4. Laktát dehidrogenáz (LDH) 0
3.5. Aminotranszferázok 0
3.6. Gamma-glutamiltranszferáz 0
3.7. Alkalikus foszfatáz 0
3.8. Kolinészteráz 0
3.9. Amiláz 0
3.10. Lipáz 0
4. A vese laboratóriumi diagnosztikája 0
4.1. A vesefunkció klinikai kémiai tesztjei 0
4.1.4.1.1. A Glomerulus Filtrációs Ráta (GRF) meghatározása
0
4.1.4.1.2. Plazma urea 0
4.1.4.1.3. Cisztatin C 0
4.1.4.1.4. Glomeruláris permeabilitás, fehérje ürítés 0
4.2. A vese megbetegedései 0
4.2.4.2.1. Akut veseelégtelenség 0
4.2.4.2.2. Krónikus vesebetegség 0
4.2.4.2.3. Urémia szindróma 0
4.2.4.2.4. Vesekövek 0
5. Vizeletvizsgálat 0
5.1. Vizeletcukor 0
5.2. Ketontestek a vizeletben 0
5.3. Vizelet bilirubin 0
5.4. Urobilinogén 0
5.5. Vizelet fehérje 0
5.6. Vizelet pH 0
5.7. Vizelet vér/hemoglobin 0
5.8. Vizelet sűrűség 0
5.9. Vizeletüledék 0
6. Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata 0
6.1. A máj anatómiája 0
6.2. A máj biokémiai funkciói 0
6.3. Bilirubin lebontás, a bilirubin enterohepatikus körforgása
0
6.4. Máj funkciózavar és hiperbilirubinémiák 0
6.4.6.4.1. Nem konjugált hiperbilirubinémia 0
6.4.6.4.2. Konjugált hiperbilirubinémia 0
6.5. A máj megbetegedései 0
6.5.6.5.1. A károsodás mechanizmusa és mintázata 0
6.5.6.5.2. Vírusos májgyulladások 0
6.5.6.5.3. Akut hepatitisz 0
6.5.6.5.4. Toxikus hepatitisz 0
6.5.6.5.5. Isémiás hepatitisz (Májsokk) 0
6.5.6.5.6. Reye szindróma 0
6.5.6.5.7. Krónikus hepatitisz 0
6.5.6.5.8. Cirrózis 0
7. A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata 0
7.1. A diabetes mellitus klasszifikációja 0
7.1.7.1.1. I. típusú diabetes mellitus 0
7.1.7.1.1.7.1.1.1. Az I-es típusú diabétesz tüneteinek háttere
0
7.1.7.1.1.7.1.1.2. Az I-es típusú diabétesz patogenezise 0
7.1.7.1.2. II-es típusú diabétesz 0
7.1.7.1.2.7.1.2.1. A II-es típusú diabetes mellitus patogenezise
0
7.1.7.1.3. Gesztációs diabetes mellitus 0
7.2. A diabetes mellitus diagnosztikája,
differenciáldiagnosztikájuk 0
7.2.7.2.1. Glukóz meghatározások 0
7.2.7.2.2. Inzulinszint meghatározás 0
7.2.7.2.3. C-peptid meghatározás 0
7.2.7.2.4. Glikált szérumfehérjék, hemoglobim A1c 0
8. Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata
0
8.1. Lipidek emésztése, felszívódása 0
8.2. Lipidek szállítása 0
8.3. Triglicerid szint meghatározása 0
8.4. Koleszterin meghatározás 0
8.5. Nagy sűrűségű (HDL) koleszterin meghatározása 0
8.6. Könnyű lipoprotein frakciókban található koleszterin
meghatározása 0
8.7. A koleszterin referenciatartományával kapcsolatos polémia
0
8.8. Hiperlipidémiák 0
9. Hematológia 0
9.1. A vér sejtjei és a vérképzés élettana 0
9.2. A vér, illetve a vérképzés sejtes elemeinek vizsgálatára
szolgáló eljárások 0
9.3. A vörösvérsejteket érintő legfontosabb kórképek 0
9.4. A fehérvérsejtek rendellenességei 0
10. A véralvadás laboratóriumi vizsgálata 0
10.1. A vérlemezkék (trombociták) szerepe a hemosztázisban 0
10.2. A véralvadás szerin-proteáz-rendszere és annak
szabályozása 0
10.3. A trombinaktivitás kontrollja 0
10.3.10.3.1. Plazma proteáz-inhibitorok 0
10.3.10.3.2. A protein C/protein S-rendszer 0
10.4. A véralvadék feloldása 0
10.5. A véralvadás legfontosabb zavarai és azok laboratóriumi
vizsgálata 0
10.5.10.5.1. A vérlemezkék rendellenességei és vizsgálatuk 0
10.6. A plazmatikus fázis (alvadási kaszkád) zavarai
(koagulopátiák) és kimutatásuk 0
10.6.10.6.1. A vérzékenység differenciáldiagnosztikája 0
10.6.10.6.1.10.6.1.1. Protrombin-idő (PI; Quick-teszt) 0
10.6.10.6.1.10.6.1.2. Aktivált parciális tromboplasztin-idő
(aPTI) 0
10.6.10.6.1.10.6.1.3. A fibrinolízis sebességének meghatározása
0
10.6.10.6.1.10.6.1.4. A trombinidő mérése 0
10.6.10.6.1.10.6.1.5. A XIII-as faktor vizsgálata 0
10.7. A trombózisok laboratóriumi diagnosztikája 0
10.7.10.7.1. Az alvadási faktorok aktiválódásának kimutatása
0
10.7.10.7.2. A hiperfibrinolízis kimutatása 0
10.8. Az aktivált protein C (APC) rezisztencia kimutatása 0
II. Endokrinológia 0
11. Immunanalitikai eljárások 0
11.1. Kompetitív immunanalitikai eljárások 0
11.2. Immunometrikus, vagy nem kompetitív immunanalitikai
eljárások 0
12. A pajzsmirigy funkciók laboratóriumi vizsgálata 0
12.1. Pajzsmirigy hormonok 0
12.1.12.1.1. Biológiai funkciójuk 0
12.1.12.1.2. Bioszintézis 0
12.1.12.1.3. Szállítás 0
12.1.12.1.4. Szabályozás 0
12.2. Hipotireózis 0
12.2.12.2.1. Primer hipotireózis 0
12.2.12.2.2. Másodlagos (szekunder) hipotireózis 0
12.3. Hipertireózis 0
13. Mellékpajzsmirigy 0
13.1. PTH szint reguláció 0
13.2. A PTH hatása 0
13.3. Primer hiperparatireózis 0
13.4. Szekunder hiperparatireózis 0
13.5. PTH hiány 0
13.6. Kalcitriol – D-vitaminok 0
13.7. Kalcitonin 0
14. Mellékvesekéreg rendellenességek laboratóriumi vizsgálata
0
14.1. ACTH-mellékvese tengely, glükokortikoidok 0
14.2. Selye János stressz elmélete és annak továbbfejlesztése
0
14.3. Az ACTH-kortizol napszaki ingadozása, fontosabb
szabályozókörök 0
14.4. Glükokortikoidok 0
14.5. Mineralokortikoidok 0
14.6. A mellékvesekéreg rendellenességei 0
14.6.14.6.1. A mellékvesekéreg hipofunkciói 0
14.6.14.6.2. A mellékvesekéreg hiperfunkciói 0
14.6.14.6.3. Congentitalis adrenális hiperplázia 0
15. Reproduktív rendellenességek laboratóriumi vizsgálata 0
15.1. Férfi nemi működés (reprodukció) 0
15.1.15.1.1. A hipotalamusz-hipofízis-gonád tengely szerepe
0
15.1.15.1.2. Androgén transzport a vérben 0
15.1.15.1.3. A tesztoszteron metabolizmusa 0
15.1.15.1.4. Férfi nemi fejlődés 0
15.1.15.1.5. Szabad és gyengén kötött tesztoszteron
meghatározások 0
15.1.15.1.6. 17-Ketoszteroidok meghatározása vizeletből 0
15.1.15.1.7. Anabolikus szteroid meghatározások 0
15.1.15.1.8. Abnormalitások a férfi reprodukcióban 0
15.2. Női reprodukciós biológia 0
15.2.15.2.1. Élettani összefoglaló 0
15.2.15.2.2. A hipotalamusz-hipofízis-gonád tengely szerepe
0
15.2.15.2.3. Ösztrogének 0
15.2.15.2.4. Biokémia, élettan 0
15.2.15.2.5. Női nemi fejlődés 0
15.2.15.2.6. Normális menstruációs ciklus 0
15.2.15.2.7. Női reprodukciós abnormalitások 0
16. Utószó 0
17. Felhasznált és ajánlott irodalom 0
Klinikai kémia
Klinikai kémia
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az ábrák listája
1.1. Vákumos vérvétrli cső 0
1.2. Vérvételi hely, előkészített vérvételi eszközökkel. 0
1.3. Vénás vérvétel helye. 0
1.4. Vérvételi eszközök 0
1.5. A sejtes elemek és a plazma/szérum centrifugálással történő
elválasztást követően. A két fázis között látható a mechanikai
határvonalat képező gélréteg 0
1.6. Kapilláris vérvételi helyek csecsemők esetében 0
1.7. Újszülöttek szűrővizsgálata 0
1.8. Hemolizált (jobb oldalt) és nem hemolizált (bal oldalt)
plazma. 0
2.1. DNS minták (agaróz) gélelektroforézise. 0
2.2. DNS minták kapilláris elektroforézise. 0
2.3. Polimeráz láncreakció 0
2.4. A polimeráz láncreakció lépései, hőprogramja 0
2.5. Real time PCR TaqMan próbával 0
2.6. Real time PCR eredménygörbék és kiértékelésü 0
2.7. A kiindulási DNS kópiaszámának logaritmusa és a PCR
küszöbciklusszámok között meglévő lineáris összefüggés 0
2.8. PCR primerek a Huntingtinben található CAG ismétlődések
meghatározására 0
2.9. PCR termékek analízise kapilláris elektroforézissel 0
2.10. Allél specifikus PCR primerek 0
2.11. Allél specifikus PCR gélelektroforézis eredmények 0
2.12. STR lókuszok PCR analízise 0
2.13. STR lókuszok gélelektroforetogramja (DNS ujjlenyomat).
0
2.14. DNS chip. 0
3.1. 0
3.2. A kreatin-kináz aktivitásának meghatározása. 0
3.3. LDH enzim aktivitásának meghatározása. 0
3.4. Aminotranszferáz aktivitások meghatározása. 0
3.5. A GGT meghatározása. 0
3.6. Az alkalifus-foszfatáz meghatározása 0
3.7. A kolin-észteráz meghatározása. 0
4.1. A vese mint magas nyomású szűrő. 0
4.2. Transzportfolyamatok a vesében, a vesetubulusok működése.
0
4.3. A Kreatin kreatinin átalakulás. 0
4.4. a kreatinin clearance és a plazma kreatinin szint között
fennálló kapcsolat. 0
4.5. A kreatinin meghatározása szarkozin-oxidáz segítségével.
0
4.6. A Trinder-reakció. 0
4.7. Az urea enzimes meghatározása. 0
5.1. Vizelet tesztcsík több reagenspárnával. 0
5.2. Vizelet tesztcsík leolvasása remissziós fotométerrel. 0
5.3. Vizeletcukor meghatározása glükóz-oxidáz, peroxidáz
kálium-jodid próbával. 0
5.4. Vizelet ketontest meghatározás 0
5.5. Vizelet bilirubin meghatározás. 0
5.6. Vizelet fehérje meghatározás. 0
5.7. Vizelet vér (hemoglobin) kimutatása 0
6.1. A máj mikroszkópikus felépítése. 0
6.2. A máj és az epeutak makroszkópikus anatómiája. 0
6.3. A fázis I. reakciók 90%-át kitevő oxigenáció folyamata.
0
6.4. A hem gyűrű felnyílása 0
6.5. a biliverdin redukálódása bilirubinná 0
6.6. A bilirubin UDP-glukuronsavas konjugálása 0
6.7. A szérum bilirubin meghatározása diazotálással 0
7.1. A GLUT4 transzporterek inzulin hatásra történő
plazmamembránba helyeződése 0
7.2. Az inzulin jelpálya.
http://1.bp.blogspot.com/-ntbIEMesVZE/ThccKz70EAI/AAAAAAAAAUU/xYiWPRC0QuM/s1600/Insulin_Receptor.jpg
0
7.3. 0
7.4. 0
7.5. A vércukorszint meghatározása glükóz-oxidáz enzimmel. 0
7.6. A glükóz-oxidáz enzim által generált peroxidáz bontása
peroxidázzal, valamint a keletkezett nascens oxigén detektálása
Trinder-reakció segítségével. 0
7.7. Vércukor meghatározása hexokináz segítségével 0
7.8. Orális glükóz tolerancia teszt lehetséges eredményei 0
7.9. Korai glikáció, Amadori termékek képződése 0
7.10. Késői glikációs termékek képződése 0
8.1. A triglicerid és alkotói: glicerin és zsírsav. 0
8.2. A koleszterin. 0
8.3. A foszfolipidek. 0
8.4. A trigliceridek emésztése. 0
8.5. A foszfatidil-kolin emésztése. 0
8.6. A lipoproteinek felépítése. 0
8.7. Lipidek emésztése és felszívódása 0
8.8. A kilomikron életútja. 0
8.9. Triglicerid és koleszterinszállítása a májból a
perifériára. 0
8.10. A koleszterin felvétele apo B 100 receptorokon keresztül.
0
8.11. A koleszterin bioszintézise és annak gátlása statinokkal.
0
8.12. A koleszterinszintézis szabályozása, esetleges
beavatkozési lehetőségek. 0
8.13. Reverz koleszterintranszport, a HDL életútja. 0
8.14. A lipdszállítás összefoglalása. 0
8.15. A koleszterin enzimes meghatározása. 0
9.1. Bürker-kamra. 0
9.2. Coulter-számláló. 0
9.3. Optikai elven működő áramlási citométer 0
9.4. Hematológiai automata 0
9.5. Bazofil granulociták meghatározása fényszórás méréssel
0
9.6. Az egyes fehérvérsejt frakciók meghatározása fluoreszcens
technikával 0
9.7. A hematológiai automata által szolgáltatott eredmények
0
9.8. Vérkenet készítése 0
9.9. A glukóz-6-foszfát-dehidrogenáz szerepe a reaktív
oxigénvegyületek eltávolításában 0
9.10. Agglutináció 0
10.1. A fehér trombus létrejötte 0
10.2. Gla-kalcium-foszfatidil-szerin kapcsolat 0
10.3. K-vitamin és warfarin 0
10.4. A véralvadási kaszkád 0
10.5. A fibrinogén 0
10.6. A heparin hatásmechanizmusa. 0
10.7. 0
10.8. A fibrinolítikus rendszer szabályozása 0
10.9. Összecsapzódott vérlemezkék 0
10.10. A protrombin idő által jellemzett véralvadási
komponensek. 0
10.11. A DIC kialakulásának mechanizmusa 0
11.1. Kompetitív immunanalitikai eljárás 0
11.2. Az immounometrikus eljárás 0
12.1. Pajzsmirigyhormonok és szintézisük. 0
12.2. A TRH: tireoid releasing hormone 0
12.3. 0
13.1. A PTH szekréció szabályozása (Az ábra az alábbi link
alapján készült:
http://dualibra.com/wp-content/uploads/2012/04/037800~1/Part%2015.%20Endocrinology%20and%20Metabolism/
Section%202.%20Disorders%20of%20Bone%20and%20Mineral%20Metabolism/346.htm)
0
14.1. A POMC és hasítási termékei 0
14.2. A CRH-ACTH-glükokortikoid tengely (Az ábra az alábbi link
alapján készült:
http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/endocrine/adrenal/gluco.html)
0
14.3. Szteroid hormon szintézis (Az ábra az alábbi link alapján
készült:http://en.wikipedia.org/wiki/File:Steroidogenesis.svg)
0
14.4. 21-hidroxiláz defektus a szteroid hormon szintézisben. (Az
ábra az alábbi link alapján
készült:http://en.wikipedia.org/wiki/File:Steroidogenesis.svg)
0
15.1. a tesztoszteron metabolizmusa 0
15.2. Az ösztrogének 0
15.3. Normális menstruációs ciklus 0
Klinikai kémia
Klinikai kémia
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Klinikai kémia
Szarka András, Keszler Gergely
Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis
Egyetem, 2014
© Szarka András, Keszler Gergely
Typotex Kiadó
ISBN: 978-963-279-176-0
Creative Commons NonCommercial-NoDerivs 3.0 (CC BY-NC-ND 3.0) A
szerzők nevének feltüntetése mellett nem kereskedelmi céllal
szabadon másolható, terjeszthető, megjelentethető és előadható, de
nem módosítható.
Készült a TÁMOP-4.1.2/A/1-11/1-2011-0079 számú, „Konzorcium a
biotechnológia aktív tanulásáért” című projekt keretében.
Klinikai kémia
Klinikai kémia
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
I. rész - Laboratóriumi diagnosztika
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Tartalom
Előszó 0
1. Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk 0
1.1. Mintagyűjtés 0
1.1.1.1.1. Vér (minta) 0
1.1.1.1.1.1.1.1.1. Vénás vérvétel 0
1.1.1.1.1.1.1.1.2. Kapilláris vérvétel 0
1.1.1.1.1.1.1.1.3. Artériás vérvétel 0
1.1.1.1.1.1.1.1.4. A vérvételt befolyásoló tényezők 0
1.1.1.1.2. Vizelet 0
1.1.1.1.2.1.1.2.1. Gyűjtött vizeletminták 0
1.1.1.1.3. Széklet 0
1.1.1.1.4. Gerincfolyadék (liquor cerebrospinalis) 0
1.1.1.1.5. Ízületi folyadék 0
1.1.1.1.6. Magzatvíz (amniotikus folyadék) 0
1.1.1.1.7. Mellhártya, szívburok és hasűri folyadékok
(pleurális, perikardiális folyadékok és ascites) 0
1.1.1.1.8. Specifikus sejtek 0
1.2. A minták kezelése 0
1.2.1.2.1. A minták minőségének megőrzése a szállítás, tárolás
során 0
1.3. Preanalitikai variabilitások 0
1.3.1.3.1. Kontrollálható variabilitások 0
1.3.1.3.1.1.3.1.1. Élettani variabilitások 0
1.3.1.3.2. Nem-kontrollálható variabilitások 0
1.3.1.3.2.1.3.2.1. Biológiai hatások 0
1.3.1.3.2.1.3.2.2. Környezeti hatások 0
1.3.1.3.2.1.3.2.3. Alapvető egészségügyi állapot 0
2. Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett
betegségek diagnosztikájában 0
2.1. A DNS, a humán DNS főbb jellemzői 0
2.2. DNS izolálás 0
2.2.2.2.1. A sejt feltárása 0
2.2.2.2.2. A sejt saját nukleázainak inaktiválása 0
2.2.2.2.3. Szennyező alkotók eltávolítása 0
2.2.2.2.4. A DNS szelektív kinyerése 0
2.3. A DNS méret szerinti elválasztása gélelektroforézissel
0
2.4. Hibridizáció, Southern blot 0
2.5. Polimeráz láncreakció (PCR) 0
2.6. Real-time PCR, a DNS mennyiségi meghatározása 0
2.7. A PCR technika klinikai diagnosztikai alkalmazásai 0
2.7.2.7.1. Hosszúságpolimorfizmus okozta betegségek és
vizsgálatuk PCR-rel 0
2.7.2.7.1.2.7.1.1. Huntington-kór 0
2.7.2.7.2. SNP-k okozta betegségek vizsgálata PCR-re 0
2.7.2.7.2.2.7.2.1. Leiden mutáció 0
2.7.2.7.2.2.7.2.2. Sarlósejtes anémia 0
2.7.2.7.3. SNP-k és hosszúságpolimorfizmus okozta betegségek
0
2.7.2.7.3.2.7.3.1. Cisztikus fibrózis 0
2.7.2.7.4. STR lókuszok, DNS ujjlenyomat 0
2.8. DNS chip 0
3. Klinikai enzimológia 0
3.1. Izoenzime 0
3.2. Az enzimaktivitás meghatározásának körülményei 0
3.3. Kreatin-kináz 0
3.4. Laktát dehidrogenáz (LDH) 0
3.5. Aminotranszferázok 0
3.6. Gamma-glutamiltranszferáz 0
3.7. Alkalikus foszfatáz 0
3.8. Kolinészteráz 0
3.9. Amiláz 0
3.10. Lipáz 0
4. A vese laboratóriumi diagnosztikája 0
4.1. A vesefunkció klinikai kémiai tesztjei 0
4.1.4.1.1. A Glomerulus Filtrációs Ráta (GRF) meghatározása
0
4.1.4.1.2. Plazma urea 0
4.1.4.1.3. Cisztatin C 0
4.1.4.1.4. Glomeruláris permeabilitás, fehérje ürítés 0
4.2. A vese megbetegedései 0
4.2.4.2.1. Akut veseelégtelenség 0
4.2.4.2.2. Krónikus vesebetegség 0
4.2.4.2.3. Urémia szindróma 0
4.2.4.2.4. Vesekövek 0
5. Vizeletvizsgálat 0
5.1. Vizeletcukor 0
5.2. Ketontestek a vizeletben 0
5.3. Vizelet bilirubin 0
5.4. Urobilinogén 0
5.5. Vizelet fehérje 0
5.6. Vizelet pH 0
5.7. Vizelet vér/hemoglobin 0
5.8. Vizelet sűrűség 0
5.9. Vizeletüledék 0
6. Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata 0
6.1. A máj anatómiája 0
6.2. A máj biokémiai funkciói 0
6.3. Bilirubin lebontás, a bilirubin enterohepatikus körforgása
0
6.4. Máj funkciózavar és hiperbilirubinémiák 0
6.4.6.4.1. Nem konjugált hiperbilirubinémia 0
6.4.6.4.2. Konjugált hiperbilirubinémia 0
6.5. A máj megbetegedései 0
6.5.6.5.1. A károsodás mechanizmusa és mintázata 0
6.5.6.5.2. Vírusos májgyulladások 0
6.5.6.5.3. Akut hepatitisz 0
6.5.6.5.4. Toxikus hepatitisz 0
6.5.6.5.5. Isémiás hepatitisz (Májsokk) 0
6.5.6.5.6. Reye szindróma 0
6.5.6.5.7. Krónikus hepatitisz 0
6.5.6.5.8. Cirrózis 0
7. A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata 0
7.1. A diabetes mellitus klasszifikációja 0
7.1.7.1.1. I. típusú diabetes mellitus 0
7.1.7.1.1.7.1.1.1. Az I-es típusú diabétesz tüneteinek háttere
0
7.1.7.1.1.7.1.1.2. Az I-es típusú diabétesz patogenezise 0
7.1.7.1.2. II-es típusú diabétesz 0
7.1.7.1.2.7.1.2.1. A II-es típusú diabetes mellitus patogenezise
0
7.1.7.1.3. Gesztációs diabetes mellitus 0
7.2. A diabetes mellitus diagnosztikája,
differenciáldiagnosztikájuk 0
7.2.7.2.1. Glukóz meghatározások 0
7.2.7.2.2. Inzulinszint meghatározás 0
7.2.7.2.3. C-peptid meghatározás 0
7.2.7.2.4. Glikált szérumfehérjék, hemoglobim A1c 0
8. Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata
0
8.1. Lipidek emésztése, felszívódása 0
8.2. Lipidek szállítása 0
8.3. Triglicerid szint meghatározása 0
8.4. Koleszterin meghatározás 0
8.5. Nagy sűrűségű (HDL) koleszterin meghatározása 0
8.6. Könnyű lipoprotein frakciókban található koleszterin
meghatározása 0
8.7. A koleszterin referenciatartományával kapcsolatos polémia
0
8.8. Hiperlipidémiák 0
9. Hematológia 0
9.1. A vér sejtjei és a vérképzés élettana 0
9.2. A vér, illetve a vérképzés sejtes elemeinek vizsgálatára
szolgáló eljárások 0
9.3. A vörösvérsejteket érintő legfontosabb kórképek 0
9.4. A fehérvérsejtek rendellenességei 0
10. A véralvadás laboratóriumi vizsgálata 0
10.1. A vérlemezkék (trombociták) szerepe a hemosztázisban 0
10.2. A véralvadás szerin-proteáz-rendszere és annak
szabályozása 0
10.3. A trombinaktivitás kontrollja 0
10.3.10.3.1. Plazma proteáz-inhibitorok 0
10.3.10.3.2. A protein C/protein S-rendszer 0
10.4. A véralvadék feloldása 0
10.5. A véralvadás legfontosabb zavarai és azok laboratóriumi
vizsgálata 0
10.5.10.5.1. A vérlemezkék rendellenességei és vizsgálatuk 0
10.6. A plazmatikus fázis (alvadási kaszkád) zavarai
(koagulopátiák) és kimutatásuk 0
10.6.10.6.1. A vérzékenység differenciáldiagnosztikája 0
10.6.10.6.1.10.6.1.1. Protrombin-idő (PI; Quick-teszt) 0
10.6.10.6.1.10.6.1.2. Aktivált parciális tromboplasztin-idő
(aPTI) 0
10.6.10.6.1.10.6.1.3. A fibrinolízis sebességének meghatározása
0
10.6.10.6.1.10.6.1.4. A trombinidő mérése 0
10.6.10.6.1.10.6.1.5. A XIII-as faktor vizsgálata 0
10.7. A trombózisok laboratóriumi diagnosztikája 0
10.7.10.7.1. Az alvadási faktorok aktiválódásának kimutatása
0
10.7.10.7.2. A hiperfibrinolízis kimutatása 0
10.8. Az aktivált protein C (APC) rezisztencia kimutatása 0
Laboratóriumi diagnosztika
Laboratóriumi diagnosztika
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Előszó
A klinikai kémia tankönyv elkészítése során, célunk az
örömszerzés volt. Annak az örömnek az átélését szeretnénk minden
egyes olvasónknak megadni, amit akkor érez az ember, ha betekintést
nyerhet sejtjeink, szöveteink, szerveink és egész szervezetünk
működésébe, a fiziológiástól eltérő működés hátterébe, a patológiás
működésből fakadó eltérések meghatározásába. Természetesen az egyes
eltérések nemcsak egy szövet, vagy szerv működését befolyásolják,
további eltéréseket is generálhatnak, így nagyon fontos, hogy (bár
a tankönyv különálló fejezetekre tagolódik) mindig az
összefüggésekre helyezzük a hangsúlyt. A klinikai kémia
sajátosságából adódik, hogy tárgyalásakor közel egyenlő súlyt kell
kapnia a patobiokémiai és a kórélettani szemléletnek. Ezt az
egyensúlyt igyekeztünk fenntartani, míg a tankönyv mindkét szerzője
patobiokémiai gyökerekkel rendelkezik, addig a lektora egy gyakorló
laboratóriumi szakorvos.
Egy gyakorlati ismereteket nyújtó könyv esetében a jó ábraanyag
nélkülözhetetlen. Nincs ez másként jelen könyv esetében sem. A
szerkesztő ezúton is szeretne köszönetet mondani Balogh Tibornak és
Lőrincz Tamásnak az ábraanyag elkészítésében nyújtott segítségért.
A tankönyvben szereplő fényképeket a szerkesztő készítette a Szent
Imre Oktatókórház központi laboratóriumában.
Budapest, 2013. november 13.
Szarka András
Előszó
Előszó
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
1. fejezet - Mintavétel, preanalitikai folyamatok és
variabilitásuk
A megfelelő mintavétel, feldolgozás és tárolás létfontosságú a
megfelelő mérési eredményhez. Számtalan hiba forrása lehet,
amennyiben nem megfelelően végezzük ezeket a folyamatokat. A
felsorolt folyamatok elégtelen elvégzése okozhatja az úgynevezett
preanalitikai variabilitást.
A preanalitikai variabilitásokat két nagy csoportra oszthatjuk a
kontrollálható és a nemkontrollálható variabilitásra. A
kontrollálható variabilitások közé tartoznak a mintagyűjtés,
–szállítás, illetve az adott páciens fiziológiás állapotával
kapcsolatos tényezők, mint például a neme, kora, szóban forgó
betegsége stb.
Egy jó „laborosnak” tudnia és értenie kell mind a
kontrollálható, mind a nemkontrollálható változékonyság
testfolyadékokra gyakorolt hatását ahhoz, hogy értel-mezni tudja az
eredményeket.
1.1. Mintagyűjtés
Lássuk csak, milyen mintákat vizsgál egy klinikai laboratórium:
teljes vér, szérum, plaz-ma, vizelet, széklet, nyál, spinális
(gerincvelői), szinoviális (ízületi) folyadékot, magzatvizet
(amniotikus folyadék), különböző szilárd szövettípusokat, illetve
specifikus sejteket. Az egyes mintavételi eljárások jól
sztenderdizáltak. Tekintsük át, a legfontosabb mintákat,
mintavételi eljárásokat.
1.1.1.1.1. Vér (minta)
A vizsgálathoz szükséges vért vénából, artériából és
kapillárisból nyerhetjük. Leggyakrabban a vénás vért vizsgáljuk,
amelyet vérvétellel nyerünk. Csecsemőktől, illetve „ágy melletti”
(point of care) vizsgálatokhoz kapilláris vért vehetünk. Artériás
vérvételre leggyakrabban vérgáz analízishez kerül sor. A vérvételi
eljárás latin elnevezése phlebotomia és kizárólag gyakorlott
szakember végezheti. (Az angolszász területen és szakirodalomban
külön phlebotomist végzi.) A mintavételt követően lehetőségünk
adódik, hogy megvizsgáljuk a teljes vért, a plazmát, amelyet az
alvadás gátlóval kezelt vér lecentrifugálása révén kapunk. Itt a
kiülepedett csapadék a sejtes elemeket, a felülúszó pedig a plazmát
tartalmazza. Ezen kívül vizsgálhatjuk a szérumot, amelyet úgy
kapunk, hogy hagyjuk megalvadni a vért és ezt követően
centrifugálással eltávolítjuk a sejtes elemeket. Ez utóbbi esetben
tehát a vérvételi cső nem tartalmaz semmiféle alvadás gátló
anyagot.
1.1.1.1.1.1.1.1.1. Vénás vérvétel
Minden olyan mozzanatot magában foglal, amely során megfelelő és
beazonosított vér-mintát nyerünk a beteg vénájából.
1.1. ábra - Vákumos vérvétrli cső
1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1. Megelőző lépések
Mielőtt bármit tenne a vérvételt végző személy a legfontosabb és
legelső dolga a beteg azonosítása. A folyamat során legalább
két-három paraméterre ki kell térnie (ilyenek lehetnek például a
név, a TAJ szám, születési idő stb.), amelyeket a mintavételi
eszközö-kön a mintavétel előtt fel kell tüntetni (1.1. ábra).
Ennél a pontnál kell kérdést intézni az esetleges allergiáról. A
legfontosabb a jódérzékenység tisztázása, mert allergia esetén nem
alkalmazható jódos fertőtlenítőszer, ezen kívül fontos a latex
allergia tisztázása is (az egészségügyben általában latex kesztyűt
használnak, illetve a véna elszorítására használt strangulátor is
tartalmazhat latex elemeket). A mintavétel előtt a vérvételt végző
személy megfelelő védő öltözéket és védő eszközöket kell, hogy
felvegyen. Nagyon fontos, hogy magát, illetve a többi beteget is
megóvja az esetleges fertőzésektől. A védőöltözetnek mindig része a
köpeny (egyes esetekben ez teljesen áthatolhatatlan folyadékok
számára) és a gumikesztyű. Különleges esetekben természetesen,
különleges védőruházatra is szükség lehet (pl.: maszk, szemüveg). A
betegnek a mintavétel előtt, során kényelmesen kell elhelyezkednie.
Kényelmesen le kell ültetni, esetleg fektetni, amennyiben nem
lehetséges az ülő pozíció (1.2. ábra). Fontos, hogy annyi ideig
legyen ebben a kényelmes helyzetben (a vérvételt megelőzően)
ameddig csak lehetséges és a helyzet megkívánja. Járó beteg
esetében tanácsos már a személyazonosítást leültetve a későbbi
helyzetben végezni, így a relaxáció ideje meghosszabbítható. Álló
helyzetben sohasem szabad vért venni! A beteg karját a válltól a
csuklóig egyenesen kell, hogy tartsa. El kell kerülni a vérvételt
olyan karból, amelyben intravénás kanül, vagy kiterjedt hematóma,
seb, vágás található. A vérvételt végző személynek le kell
ellenőriznie a kiírt vizsgálatokat, meg kell becsülnie a levenni
kívánt vér mennyiségét, illetve ki kell választania a megfelelő
számú és típusú mintavételi csövet a vér, a plazma és a szérum
számára.
A megfelelő csöveken kívül a megfelelő tűt is ki kell
választania. A leggyakrabban 19-22-gauge-s (G-s) tűket használnak
(minél nagyobb a G érték annál kisebb átmérőjű a tű). Minél nagyobb
a tű, annál kisebb a folyadék, áramlási sebessége, a nyíróerő (ami
például a vörösvértesteket károsíthatja). Egy normális vénákkal
rendelkező felnőtt esetében általában 20 G-s tűt használnak.
Amennyiben a véna összeesésre, kollapszusra hajlamos inkább 21
G-st. Nagyobb mennyiségű (30-50 ml) vér vételére a megfelelő
véráramlást biztosítandó G 18-ast (igaz ez a méret a vákuumos
csöveknél már nem használatos). A tű általában 3,7 cm (1,5
hüvelyk), vagy 2,5 cm (1 hüvelyk) hosszú. Az utóbbi méretűekhez
általában szárnyas, vagy más néven pillangós tű csatlakoznak.
Természetesen mindegyik tűnek, sterilnek, hegyesnek, sorjamentesnek
kell lennie.
1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.2. A vérvétel helye
Legyakrabban a vena cubitalis-ból vesznek vért (1.3. ábra),
mivel ez a véna nagy és közel fut a bőrfelszínhez. A kézfej és a
boka vénái is alkalmasak lehetnek speciális esetekben, ámbátor ezek
kevésbé preferáltak és kifejezetten kerülni kell rossz keringéssel
rendel-kező személyek (pl. cukorbetegek) esetén.
1.2. ábra - Vérvételi hely, előkészített vérvételi
eszközökkel.
1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.3. A vérvétel helyének
előkészítése
A vérvételi hely környékét meg kell tisztítani. Erre a célra
leggyakrabban négy különféle anyagot használnak: előrecsomagolt
alkoholos vattát, 70%-os izopropanollal átitatott gézlapkát,
benzalkonium-klorid oldatot, illetve hemokultúra vétele esetén
jódos lemo-sásra is szükség van. Benzalkonium-klorid oldatot
használnak abban az esetben, ha a mintából alkohol meghatározás
történik. A vérvételi hely megtisztítása bentről kifelé irányuló
körkörös mozdulatokkal kell, hogy történjen. A bőrnek meg kell
száradnia, el kell kerülni, hogy alkohol, vagy más fertőtlenítőszer
maradjon a bőrön, mert az hemolízist okozhat és meghamisíthatja a
vizsgálatok eredményét. Amennyiben már egy-szer a bőrfelületet
megtisztítottuk, akkor azt nem szabad megérinteni, tapogatni,
nyomkodni.
1.3. ábra - Vénás vérvétel helye.
1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.4. Időzítés
A laboratóriumi vizsgálatokhoz ideálisan a vérvétel reggel,
éhgyomorra történik. A mintavétel időpontja kritikus azokban az
esetekben, amikor olyan alkotót vizsgálunk, amelyek hangsúlyos
diurnális ingadozással bírnak (mint például a kortikoszteroidok és
a vas). Szintén fontos azokban az esetekben, amikor a mérendő
paraméter alapján állítanak be egy adott gyógyszerterápiát. Ezen
kívül fontos lehet alkohol és drog meghatározásnál.
1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.5. Vénás vérvétel
Az alapos nekikészülődést követően tekintsük át magát a vérvétel
folyamatát. Miután a bőrfelületet fertőtlenítettük, egy
vérnyomásmérő mandzsettát, vagy strangulátort he-lyezzünk 10-15
cm-rel a tervezett vérvételi pont fölé (felnőttek esetén érvényes
távol-ság) (1.3. ábra). Ez a vénás elszorítás megakadályozza, hogy
a vénás vér visszaáramoljon a szívbe és kitágítja a vénákat. Amikor
vérnyomásmérő mandzsettát használunk a célra nagyjából 60 Hgmm
körüli nyomásra szokás felfújni. A strangulátorok puha, gumis
anyagból készült textilcsíkok. Általában egy percnél rövidebb ideig
szokás fent tartani a strangulátort. Ez alatt az időperiódus alatt
a vér összetételbeli változása elhanyagolható, azonban három percet
követően már egész jelentős mértékű lehet. Az elsőként levett vér
(a vér, amely a strangulátorhoz legközelebb található) összetétele
áll a legközelebb a keringő vérhez. Ebből az okból kifolyólag az
elsőként levett mintát, olyan meghatározásokra kell felhasználni,
mint például a Ca2+ szint meghatározása, amelyek így megfelelőek a
kritikus orvosi döntésekhez. A későbbiek során levett vér egyre
inkább magában hordozza a keringés hiányából, a vénás pangásból
eredő hatásokat. Ezen változásokat figyelembe véve kell
meghatározni a mintavétel sorrendjét. A vénás pangással a víz és a
kismolekulák visszaszivárognak (abszorbeálódnak) a sejtbe, ezáltal
megnövelve az oldhatatlan anyagok, mint a fehérjék és fehérjékhez
kötődő anyagok koncentrációját. Így az első csőben még mindössze
5%-os, addig a sorban harmadjára levett csőben már 10% körüli
fehérjekoncentráció növekedéssel kell számolnunk. Hosszabb tartamú
vénás pangás során akár 15%-os növekedést is tapasztalhatunk a
fehérjékhez kötött anyagok koncentrációjában. A vérvételt
megelőzően az ököl pumpálása elkerülendő, mivel a plazma kálium,
foszfát és laktát szintjének megemelkedését okozhatja.
1.4. ábra - Vérvételi eszközök
A vérvételt leggyakrabban vákuumos vérvételi csőbe végezzük,
mert így a vérvétel zárt rendszerben történhet, amivel a
fertőzésveszély csökkenthető. Ez a módszer általá-ban olcsóbb,
kényelmesebb és egyszerűbb, mint a fecskendővel történő vérvétel.
Számos fajtájuk létezik, amelyek térfogatukban, illetve az
alkalmazott adalékanyagban térnek el egymástól. A kupak színe utal
az adalékanyag minőségére. A különböző csövek tartal-mát, az
esetleges keresztreakció miatt sohasem szabad keverni,
összeönteni.
Egy tipikus vákuumos vérvételi cső a hozzá való tűvel az 1.4.
ábrán látható. A tűt, vagy szárnyas (pillangó) tűt a vérvételi cső
tartójába csavarják. Használat előtt érdemes óvatosan megkocogtatni
a csövet, hogy az esetlegesen a kupakjába került adalékanyagokat
eltávolítsuk, mielőtt a tűt a vénába szúrnánk. Ezáltal elkerülhető,
hogy esetlegesen a beteg vénájába kerüljön az adalékanyag. A
bőrfertőtlenítést követően tehát óvatosan a beteg vénájába kell
tolni a tűt, amikor a tű a helyére került, a csövet a tartóba
nyomjuk, hogy átszúrja a kupakot a tű (belső fele) és a vákuum
kifejthesse hatását. Amikor a vér elkezd a csőbe áramlani a
strangulátort ki kell oldani anélkül, hogy megmozdítanánk a tűt. A
cső addig telik, amíg a vákuum tart. Az kritikus, hogy a vákuumcső
teljesen megteljék. Az adalékanyagok mennyiségét aszerint
számították ki, hogy teljesen megtelt csővel kalkuláltak. Amikor a
cső teljesen megtelt lehúzzuk a tartóról és óvatosan összekeverjük
úgy, hogy nem hirtelen mozdulattal a feje tetejére fordítjuk, majd
vissza (a keverő mozdulatot a cső fajtájától függően néhányszor
megismételjük). Ezt követően, amennyiben szükséges kicseréljük egy
üres csőre. A soron következő csövet ugyanezzel a technikával
megtöltjük, oly módon, hogy a csőtartó végig a helyén marad. A
vérvételi eszközben egy gumis visszacsapó szelep biztosítja, hogy a
csövek cseréjekor ne folyjon ki a vér. Tekintve, hogy különböző
metabolikus változások játszódnak le, amennyiben az alvadék, vagy a
sejtes elemek közvetlenül érintkeznek a szérummal, illetve a
plazmával. Szeparációs gyűjtő csövek alkalmazásával elkerülhető ez
a probléma. Mindegyik cső tartalmaz egy tixotróp polimer gélt,
amely sűrűsége 1,04 g/cm3 körül van. Ez a sűrűség pont a plazma,
vagy szérum és a sejtes elemek sűrűsége között van.
Centrifugáláskor ez a gélszerű anyag felemelkedik a cső aljáról és
egy réteget képez a folyékony fázis és a sejtes elemek között. A
centrifugálást követően tehát a gél képezte mechanikai határoló
réteg révén elkerülhető a fent említett metabolikus változás
lejátszódása. A centrifugálásnál alkalmazott relatív nehézségi
gyorsulásnak 1100 g körül kell lennie a gél felemelkedéséhez. Az
így létrejött mechanikai határréteg több órán, akár néhány napon
keresztül is műkö-dőképes.
Fecskendővel meglehetősen ritkán vesznek vért, manapság szinte
kizárólag olyan betegektől, akik vénájából igen nehézkes a
vérvétel, illetve vérgáz analízis céljából. Fecskendővel történő
vérvétel esetén a tűt 15º-os szögben szúrjuk a vénába és a
fecskendővel finoman szívjuk le a vért. A fecskendőt cserélgetjük,
amelyből rögtön vérgáz analízisre kell vinni a mintát, illetve
áttölteni egy előre elkészített csőbe. Áttöltéskor különösen
figyelni kell, hogy a vér kifecskendezése finoman történjen meg,
nehogy hemolizáljon a minta (a vörösvértest membrán sérülésekor
tartalma a plazmába kerül és további vizsgálatra alkalmatlanná
teszi, meghamisítja az eredményeket).
1.5. ábra - A sejtes elemek és a plazma/szérum centrifugálással
történő elválasztást követően. A két fázis között látható a
mechanikai határvonalat képező gélréteg
Amikor a vérvétel befejeződik a vérszivárgás valószínűségét
csökkentendő, megkérjük a beteget, hogy legalább 5 percig szorítson
a szúrás helyére egy száraz gézlapkát és tartsa a karját nyújtott
állapotban. Ezt követően egy újabb gézdarabkát fel lehet
ragasztani, amit nagyjából 15 perc elteltével távolíthat el.
Amennyiben a vérvétel hagyományos tűvel történt a csőtartóval
együtt kidobjuk a használt tűket gyűjtő edénybe. Amennyiben
szárnyas (pillangó) vérvételi eszközzel vettük a vért a szárnyakat
előre nyomva befedjük a tűt, az újabb eszközökön található egy
gomb, amelyet megnyomva egy rugót old, amely visszahúzza a tűt.
Minden csövet az intézeti rendnek megfelelően feliratozni kell
(lehetőleg még a vérvétel előtt). A kesztyűket, potenciálisan
szennyezettnek kell tekinteni minden esetben, a veszélyes
hulladéktárolóba dobjuk. Ezt követően kezet kell mosni mielőtt új
kesztyűt húzunk az újabb vérvétel előtt.
1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.6. Vénás vérvétel gyerek esetében
A vénás vérvétel technikája gyerek és felnőtt páciensek esetén
teljesen hasonló. A gyerekek azonban hajlamosabbak váratlan
mozdulatokra, így plusz odafigyelés és a mozdulatlanul tartásuk
kívánatos lehet.
1.1.1.1.1.1.1.1.2. Kapilláris vérvétel
A kapilláris vérvétel során a bőrt (nyitott rendszerben) egy kis
lándzsával megszúrjuk és e kicseppenő kis mennyiségű vért egy kis
gyűjtőedénykébe fogjuk fel. A gyakorlatban ezt a módszer
alkalmazzuk, amennyiben 1. a mintatérfogat limitált (pl. csecsemők,
kisgyerekek esetében), 2. az ismételt vénás vérvételsúlyos
vénakárosodással járna, 3. a beteg megégett, vagy be van kötözve és
így a vénás vérvétel nem lehetséges. Szintén ezt a technikát
alkalmazzák ágy melletti, point of care tesztek esetén. A
leggyakrabban ujjbegyből vesznek vért. Ebben az esetben a gyakori
használat miatt a hüvelyk és a mutatóujjat, a mérete miatt pedig a
kisujjat kizárjuk és a középső és gyűrűs ujj két oldalát (nem
középen) szoktuk megszúrni. Amennyiben ez a vérvételi hely
akadályba ütközik kapilláris vér vehető a fülcimpából, illetve
csecsemők esetén a sarok két oldalából, vagy a nagylábujjból (1.6.
ábra).
1.6. ábra - Kapilláris vérvételi helyek csecsemők esetében
Természetesen a vénás vérvételhez hasonlóan, ez esetben is a bőr
fertőtlenítésével kezdődik a konkrét vérvételi procedúra. Amikor a
bőrfelület már megszáradt, egy hegyes lándzsával megszúrjuk. A
szúrás mélysége maximum 2,5 mm lehet, hogy elkerüljük az esetleges
csontsérüléseket. Amennyiben ujjbegyből történik a vérvétel, úgy
kell azt tartani, hogy a gravitáció révén az ujjak végébe áramoljon
a vér és a szúrást valamelyik oldalon a körömhöz közel (de nem
veszélyesen közel) kell megejteni. Az ujjak véráramlást fokozó
masszírozását el kell kerülni, mivel ebben az esetben sérülhetnek a
sejtek, szövetek és a szöveti folyadék kiáramolhat. Tekintve, hogy
ennek összetétele eltér a plazmáétól meghamisíthatja a mérési
eredményt. A véráramlás fokozásának szabályos módja, ha az
ujjbegyet, vagy a csecsemők sarkát egy meleg vizes ruhával, vagy
speciális eszközzel megmelegítjük. Az első kicseppenő vércseppet
letöröljük és az ezt követő(ke)t töltjük éppen csak a vérvételi cső
falához érintve. A csőbe töltésnek gyorsnak kell lennie az alvadást
elkerülendő, illetve figyelni kell, nehogy levegőbuborék kerüljön a
mintába. A kapilláris vérvételi csőbe a kapilláris hatás
eredményeképpen kerül a vér. Számos vérvételi kapilláris van
kereskedelmi forgalomban, különböző véralvadás gátló anyagokkal,
mint a nátrium- és az ammónium-heparin, illetve fényérzékeny
anyagok vizsgálatához, mint a bilirubin rendelkezésre áll barna
üvegből készült kapilláris is. Az utóbbi időben kezdenek elterjedni
a kevésbé törékeny műanyag, vagy műanyag bevonatú vérvételi
kapillárisok.
Az újszülöttek szűrővizsgálatánál, illetve az egyre gyakoribb
genetikai vizsgálatoknál alkalmazott szűrőpapírra történő
mintavétel során a szűrőpapírt óvatosan egy nagyobb vércsepphez
érintjük és hagyjuk, hogy az felszívja és kitöltse az előre
kijelölt kört (1.7. ábra). A procedúrát körönként külön-külön kell
elvégezni, ugyanazzal a cseppel több kört nem szabad kitölteni. a
szűrőpapírt a levegőn kell megszárítani, figyelve a gombás és
bakteriális befertőződés elkerülésére. Ez nagyjából 2-3 óra alatt
bekövetkezik és egy előre feliratozott papír borítékban tároljuk.
Vérvételi kapillárisba gyűjtött vért sohasem szabad a szűrőpapírra
áttranszferálni, mivel a kapillárisban már az részben, vagy
teljesen megalvadhatott, így a minta minősége bizonytalan
lehet.
1.7. ábra - Újszülöttek szűrővizsgálata
1.1.1.1.1.1.1.1.3. Artériás vérvétel
Az artériás vérvétel speciális hozzáértést és képességeket
igényel és gyakran kizárólag orvos, vagy az erre kiképzett
technikus, vagy nővér végezheti. Az artériás vérmintákat elsősorban
vérgáz analízisre használják. Az artériás vérminta vétele
leggyakrabban a 1. csuklói radiális artériából, 2. a felkari
brachialis artériából, vagy 3. a lágyéki femoralis artériából
történik. Tekintve, hogy a femoralis artériából (elsősorban idős
embereknél) a vér kiáramlása jóval nagyobb mértékű a karból történő
mintavétel jóval gyakoribb.
1.1.1.1.1.1.1.1.4. A vérvételt befolyásoló tényezők
A vérvételt befolyásoló tényezők közé tartoznak az
alvadásgátlók, tartósítószerek használata, a vérvétel helye és a
hemolízis.
1.1.1.1.1.1.1.1.4.1.1.1.4.1. Alvadásgátlók és
vértartósítószerek
Plazmát és bármilyen alvadásmentes vérkészítményt kizárólag
különböző alvadás gátlók teljes vérhez történő adagolásával
nyerhetünk. Számos alvadásgátló készítmény van forgalomban, mint
például a heparin, EDTA, savas citrát dextróz (ACD), citrát,
nátrium-fluorid, oxalát és a jodoacetát.
Heparin: A heparin a legáltalánosabban használt alvadásgátló
kémiai és hematológiai vizsgálatok esetén, de nem alkalmazható
polimerázláncreakció (PCR) esetén, mivel ez a nagy fehérje molekula
gátolja a polimeráz enzimet. A heparin egyik legnagyobb hátránya,
magas ára, illetve, hogy kék hátteret ad Wright festéssel készített
vérminták esetében. A heparin gátolja a savas foszfatáz aktivitását
és interferál a kalcium EDTA kötésével. Szintén befolyásolja a
trijódtironin (T3) és a tiroxin (T4) hordozó fehérjéjükhöz kötését,
ily módon megnöveli ezen hormonok szabad formájának
koncentrációját.
EDTA (etilén-diamin-tetraacetát): Az EDTA, mint jó kelátor
kétértékű kationokat köt, mint például a Ca2+ és a Mg+. Elsősorban
hematológiai vizsgálatok és teljes genomi DNS izolálása esetén
használják. Az EDTA-t dinátrium, dikálium, illetve trikálium só
formájában alkalmazzák, az utóbbi kettő jobb vízoldhatósággal
rendelkezik. Az ICSH (International Council for Standardization in
Haematology) ajánlása alapján a hematológiai mérésekhez K2-EDTA-t
kell használni.) Általában 1-2 g/l-es koncentrációban használatos,
az ettől magasabb koncentráció hatására zsugorodnak a
vörösvértestek. Az alvadást a Ca2+ megkötése révén éri el.
ACD (savas citrát dextróz): Elsősorban molekuláris diagnosztikai
célokra szánt minták esetében alkalmazzák, mivel mind a sejtes
elemek formáját (citogenetikai tesztek), mind funkcióját
megőrzi.
Nátrium-fluorid: gyenge alvadásgátló. Tekintve, hogy gátolja a
glikolízist a glukózt igen jól konzerválja a vérmintában. Az urea
meghatározást zavarja, mivel gátolja az ureáz enzimet is.
Citrát (nátrium-citrát): 34-38 g/l-es koncentrációban
alkalmazzák 1 rész citrát, 9 rész vér arányban (3,2%-os citrátot
kell használni a véralvadási vizsgálatokhoz). Igen széles körben
alkalmazzák koagulációs (véralvadási) tesztekben, mivel hatása
könnyen visszafordítható Ca2+ hozzáadásával. Tekintve, hogy a
citrát megköti a Ca2+-t, nem alkalmazható antikoagulánsként, olyan
esetekben, amikor ezen elem meghatározása a cél.
Oxalát (nátrium-, kálium-, ammónium-,litium-oxalát): oly módon
gátolja meg az alvadást, hogy viszonylag oldhatatlan komplexet
alkot a Ca2+-kal. Leggyakrabban a kálium oxalátot alkalmazzák 1-2
g/l-es koncentrációban.
Nátrium-jodoacetát: Igen gyakran helyettesítik a
nátrim-fluoridot vele, olyan minták esetében, amelyekből mind
glukóz, mind urea tesztet akarnak végezni, mivel ez nem gátolja az
ureázt. A legtöbb klinikai teszttel nem interferál.
1.1.1.1.1.1.1.1.4.1.1.1.4.2. A mintavétel helye
A különböző helyekről vett vérminták összetétele eltérő. A
kapilláris vér összetétele sokkal inkább az artériás vér
összetételéhez hasonlít, mint a vénás véréhez. A szabadon folyó
kapilláris vér és az artériás vér pH, PCO2, PO2 és oxigén
szaturációja között gyakorlatilag nincs eltérés, míg a vénás vér
PCO2 értéke 6, 7 Hgmm-rel (8, 9 kPa) magasabb. A vénás vér glukóz
koncentrációja legalább 0,4 mM-rel alacsonyabb a szöveti
metabolizmus következtében. A kapilláris vérvétel során a vér
intersticiális, illetve intracelluláris folyadékkal szennyeződik,
aminek következtében a vénás vérhez képest megnő a glukóz és kálium
koncentrációja, illetve lecsökken a bilirubin, a Ca2+, a Cl-, a Na+
és a teljes fehérje koncentrációja.
Amennyiben centrális vénás katéteren, vagy artériás vonalon
veszünk vért, meg kell bizonyosodnunk afelől, hogy a páciens
szervezetébe juttatott folyadék nem befolyásolja a minta
összetételét.
1.1.1.1.1.1.1.1.4.1.1.1.4.3. Hemolízis
A hemolízis a vörösvértestmembrán kiszakadását és a hemoglobin,
illetve más sejtalkotók kijutását jelenti. A szérum már szemmel
látható változásokat szenved, a hemolízis nyilvánvaló, amennyiben a
hemoglobin koncentrációja meghaladja a 200 mg/l-es értéket (1.8.
ábra). Az enyhe hemolízis a legtöbb mért paraméter értékét nem
befolyásolja jelentős mértékben. A komolyabb mértékű hemolízis, a
leggyakoribb kémiai tesztekre enyhe hígítási hatást gyakorol azon
összetevők esetében, amelyek szintje az eritrociták belsejében
alacsonyabb, mint a plazmában. Sokkal nagyobb a jelentősége azoknak
az összetevőknek, amelyek szintje az eritrociták belsejében
magasabb, mint a plazmában, ilyenek a laktát-dehidrogenáz (LDH), a
kálium, a magnézium és a foszfát.
1.8. ábra - Hemolizált (jobb oldalt) és nem hemolizált (bal
oldalt) plazma.
1.1.1.1.2. Vizelet
A gyűjtött vizeletfajta milyensége attól függ, hogy milyen
vizsgálatokat szeretnénk elvégezni.
Általában adott időtartamon keresztül (1, 4, 24 óra) gyűjtött
vizeletet szoktunk vizsgálni, mivel a random vett vizeletminta csak
erősen korlátozott mértékű kémiai vizsgálatra alkalmas. A tiszta,
korán reggel, éhgyomorra, felkelés után vett minta általában a
legkoncentráltabb minta ezért ez a legalkalmasabb a mikroszkópos,
abnormális anyagok, mint például a fehérjék jelenlétének, illetve
szokatlan anyagok, mint a hCG (humán Chorio Gonadotropin)
vizsgálatára.
Az ürített vizelet első 10 ml-ének bakteriális vizsgálata a
legmegfelelőbb az urethritis (húgycsőgyulladás), a középsugaras
vizelet pedig a legmegfelelőbb a húgyhólyag rendellenességek
megállapítására. A különböző metabolikus rendellenességek
vizsgálatára leginkább a rendellenesség tüneteinek jelentkezésével
egyidejűleg, vagy közvetlen utána gyűjtött vizelet a
legmegfelelőbb. A betegnek tanácsos a genitáliáit megmosni
vizeletürítés előtt, hogy a minimálisra csökkentse a felületéről a
vizeletbe jutó baktériumok számát.
1.1.1.1.2.1.1.2.1. Gyűjtött vizeletminták
A gyűjtési időnek elegendően hosszúnak kell lennie ahhoz, hogy a
rövid idejű biológiai változékonyságot minimálisra csökkentsük. A
gyűjtött vizeletminták esetében nagyon fontos, hogy a beteg a
mintagyűjtési szabályokat maximálisan betartsa (igen komoly hiba
forrása lehet a szabálytalan mintavétel). A gyűjtési periódus
kezdetekor a hólyagját teljesen ki kell ürítenie, az így nyert
vizeletet ki kell önteni, majd az összes vizeletet fel kell fogni
egészen a kijelölt gyűjtési időpont végéig. Amennyiben a betegnek
széklete van az ürítési időszak alatt vigyázni kell, nehogy
keresztszennyezze a mintát vele. Amennyiben hosszabb időn keresztül
tart a gyűjtés a mintát ideálisan 4 °C-on kell tárolni. Amennyiben
több edénybe történik az ürítés, azok tartalmát egyesíteni kell,
hogy homogén minta kerüljön a laboratóriumba.
Egyes esetekben kívánatos lehet különböző tartósítószereket (pl.
savat) adni a gyűjtött vizelethez.
Amint a vizeletgyűjtési idő lejárt a vizeletet rögtön a klinikai
laboratóriumba kell vinni analízisre.
1.1.1.1.3. Széklet
A széklet vizsgálata szinte kizárólag különböző
mikroorganizmusokra, a hasmenés kiváltó okának tisztázására és a
vér jelenlétére terjed ki, amelyből a gasztointesztinális fekélyes
és rosszindulatú elváltozásaira következtethetünk. Gyerekek
székletének triptikus aktivitását cisztás fibrózis diagnózisához
szokták vizsgálni. Felnőttek esetében a széklettel ürített nitrogén
és zsír meghatározása a felszívódási zavarok (malabszorpció)
súlyosságát mutathatja, illetve egyes esetekben a fekális porfirin
meghatározása hozzájárulhat a porfiria típusának
meghatározásához.
Tartósítószert nem szoktunk a székletmintához adni, de a
hűtésről egyes esetekben gondoskodni kell, illetve el kell kerülni
a vizelettel történő keresztszennyezést.
1.1.1.1.4. Gerincfolyadék (liquor cerebrospinalis)
A gerincfolyadékot leggyakrabban a lumbális régióból szoktak
venni, de esetenként előfordul, hogy műtétek esetében más
területről is. A következő betegségek gyanúja indikálhatja a
gerincfolyadék vizsgálatát: 1. cerebrovaszkuláris sérülés 2.
meningitisz 3. demielinizációval járó betegségek, 4. malignus
betegség agyi áttéttel. A lumbális punkciót kizárólag orvos
végezheti. A mintavevő edényeknek sterilnek kell lenniük,
különösen, ha mikrobiológiai tesztre kerül sor. Tekintve, hogy az
elsőként levett minta szöveti törmelékkel szennyezett lehet ezt
kizárólag kémiai és szerológiai vizsgálatokra használhatjuk fel, a
másodikat mikrobiológiai, a harmadikat pedig mikroszkópikus és
citológiai vizsgálatokra.
1.1.1.1.5. Ízületi folyadék
A vizsgálati céllal végzett ízületi folyadékvételi technikát
arthrocentesisnek nevezik. Az ízületi folyadékvétel segítségével
megállapíthatjuk az arthritis (ízületi gyulladás) típusát,
mibenlétét. Normálisan csak igen csekély mennyiségű folyadék
található az ízületekben, azonban gyulladás esetén ennek mennyisége
igen jelentős mértékben is megnőhet. A mintavételi eljárást orvos
végzi steril körülmények között és ő állítja fel limitált
mintamennyiség esetén a vizsgálatok prioritási sorrendjét is. A
mintavételi eljárás esetenként és ízületenként jelentős
variabilitást mutat. Sima steril csövet használunk molekuláris
diagnosztikához, tenyésztéshez, glukóz és fehérje
meghatározásokhoz, EDTA-s csövet teljes leukocita, differenciál és
eritrocita számláláshoz.
1.1.1.1.6. Magzatvíz (amniotikus folyadék)
Analóg módon a magzatvízgyűjtési eljárást amniocentézisnek
nevezik. Ezt is kizárólag orvos végezheti, a következő esetekben:
1. veleszületett betegség prenatális diagnózisa, 2. a magzat
érettségének megállapítása, 3. Rh-izoimmunizáció, vagy intrauterin
fertőzés gyanúja esetén. A mintavétel általában altatásban
történik, a lefertőtlenített bőrfelületet egy hosszú tűvel szúrják
át és 10 ml folyadékot szívnak le egy fecskendővel. A mintát steril
tárolóedénybe töltik és küldik a laboratóriumba analízisre.
Amennyiben a magzati tüdő fejlettségét kívánják megállapítani a
surfactant, albumin, vagy a lecitin-szfingomielin arány alapján,
akkor a mintavételt követően rögtön jégre helyezik. A fényérzékeny
anyagokat barna csőbe veszik és így továbbítják a laborba.
1.1.1.1.7. Mellhártya, szívburok és hasűri folyadékok
(pleurális, perikardiális folyadékok és ascites)
Normálisan ezen szerózus folyadékok a velük szemben található
membránfelületeken történő könnyebb csúszás végett nedvesítési
funkciókat töltenek be. Gyulladás esetén térfogatuk jelentős
mértékben megnőhet.
1.1.1.1.8. Specifikus sejtek
A szájüregből vehető bucca sejtekből kiválóan lehet genomi DNS-t
izolálni. Két módon szokás mintát venni: 1. speciális összetételű
szájvízzel alaposan átöblíti a száját a beteg, majd egy
gyűjtőedénybe köpi azt, 2. egy kis darab steril vattával (mint a
fülpiszkáló) megdörzsöli a szájüreg belsejét és a vattára tapadt
sejtekből izolálunk DNS-t.
A másik egyedi sejtgyűjtés a CVS (Chorionic Villus Sampling),
azaz a korionboholy mintavétel. A mintavétel során egy katétert,
vagy egy tűt tolnak a placentába és (a magzatburokból a placentába
nyúló érképződményekből a) korionbolyhokból lecsípnek egy kicsit. A
korionbolyhok a magzattal megegyező genetikai háttérrel
rendelkeznek, így kiválóan alkalmas genetikai rendellenességek
vizsgálatára. Előnye, hogy a 10-12 héten már elvégezhetőek ezen
vizsgálatok, míg a magzatvízből történő hasonló vizsgálatok csak a
terhesség 15-20 hetét követően.
1.2. A minták kezelése
A megfelelő vizsgálati eredmény csak reprezentatív, megfelelő
módon gyűjtött és megfelelő módon kezelt minta révén érhető el. A
megfelelő kezelésnek szerves része az egyértelmű mintajelölés,
mintaazonosítás.
1.2.1.2.1. A minták minőségének megőrzése a szállítás, tárolás
során
Minden hőérzékeny minta esetében a szérum és plazma
preparálásához szükséges centrifugálást hűtött centrifugában kell
elvégezni. Néhány fényérzékeny alkotót, mint például a bilirubint
és a karotint óvni kell a napfénytől és a mesterséges fénytől
egyaránt. A vérmintákat a szállítás során óvni kell a hemolízist
okozó rázkódástól. Amennyiben pneumatikus csőrendszerben történik a
szállítás, ezt úgy kell kialakítani, hogy az ne tartalmazzon
hirtelen kanyarokat és megállásokat. Amennyiben ez nem
biztosítható, vagy a beteg olyan kezelést kap, aminek következtében
sejtjei sérülékenyebbek lesznek, a centrifugálást a szállítást
megelőzően el kell végezni.
Eleve a szérum és plazma sejtes elemektől történő szeparálását,
olyan gyorsan el kell végezni, amilyen gyorsan csak lehet, de
mindenképpen két órán belül. Amennyiben ez nem lehetséges inkább
szobahőmérsékleten tároljuk a mintát, mint 4 °C-on, mivel így
csökkenthető a hemolízis mértéke. Számos bomlékony analit esetében,
mint például sok hormon a szérumot, plazmát rögtön a centrifugálást
követően le kell fagyasztani. A mintatartó csöveket kupakkal együtt
kell centrifugálni, hogy megelőzzük a minta összetételének
megváltozását, illetve csökkentsük a fertőzésveszélyt.
1.3. Preanalitikai variabilitások
1.3.1.3.1. Kontrollálható variabilitások
A fent részletezett mintavétellel kapcsolatos tényezők mind a
kontrollálható preanalitikai variabilitások közé tartoznak. Szintén
ebbe a csoportba sorolhatjuk az élettani variabilitásokat, továbbá
a diétával, életvitellel, stimulánsokkal, gyógyszerekkel,
gyógynövényekkel és a roboráló szerekkel kapcsolatos
tényezőket.
1.3.1.3.1.1.3.1.1. Élettani variabilitások
Testhelyzet: Egy átlagos felnőtt szervezetében nagyjából 10%-kal
(600-700 ml) csökken a vértérfogat, ha fekvő testhelyzetből álló
helyzetbe kerül. Tekintve, hogy kizárólag fehérjementes folyadék
halad át a kapillárisok falán a szövetekbe ez a plazma
mennyiségének csökkenését és a plazma fehérjekoncentráció
(8-10%-os) emelkedését jelenti. Normális esetben ez a
térfogatváltozás 10 perc alatt lejátszódik, azonban ha valaki
hosszú távon ágynyugalomra volt kárhoztatva ez az idő hosszabb is
lehet.
Fekvőbetegek esetén első körben a plazma és az extracelluláris
folyadéktérfogat csökken, ami természetesen növekedett fehérje és
fehérje-kötött anyag koncentrációval jár együtt. Hosszabb távú
fekvés esetén viszont a folyadék visszatartás megnövekszik és a
hígítási hatás miatt a plazma albumin és a fehérjekötött anyagok
koncentrációja csökken. A hosszan tartó fekvés kihatással van a kis
molsúlyú anyagok és számos ion koncentrációjára is. Ezt, valamint
azt a tényezőt, hogy csak jóval később (néhány héttel) a hosszú
távú fekvőállapot megszűntét követően normalizálódik a helyzet
fontos figyelembe venni az eredmények értékelésekor.
Fizikai aktivitás: Természetesen figyelembe kell venni, hogy
milyen mértékű és időtartamú az aktivitás. Általánosságban csak
annyit érdemes megjegyezni, hogy 1. az aktivitással erőteljes
folyadékáramlás indul be az intravaszkuláris és interstíciális
kompartimentumok között, 2. az aktivitásbeli különbség, jelentős
hormonszint változást okoz, 3. a verejtékezéssel jelentős
folyadékvesztés jár együtt.
A konkrét metabolikus, enzimszintbeli változásokra az aktuális
paraméterek tárgya-lásánál fogunk kitérni.
Cirkadián változások: A cirkadián változások az analitek 24 óra
alatt leírt termelési, szekréciós és koncentráció mintázatát,
görbéjét jelenti. A testfolyadékok megannyi alko-tója mutat ilyen
ciklikus napi változást. Ehhez a ciklikussághoz számos tényező
járulhat hozzá, mint a testhelyzet, aktivitás, táplálkozás,
stressz, napfény és sötétség, az ébredés és alvás. Egyes esetekben
igen kifejezett is lehet, figyelmen kívül hagyásuk komoly
értékelési problémákhoz vezethet, ezeket az adott esetekben
feltétlenül meg fogjuk említeni.
Menstruációs ciklus: Nők esetében a nemi és más hormonok
szintjét is igen jelentős mértékben befolyásolja a menstruációs
ciklus. Erre külön fejezetben (reproduktvív en-dokrinológia) is ki
fogunk térni.
A fent részletezett élettani variabilitásokon kívül még számos
kontrollálható variabilitással kell az eredmények kiértékelésekor
számolnunk, ilyenek az utazás, a diéta, a különböző táplálkozási
szokások (pl. vegetáriánus), a malnutrició, az éhezés és
jóltápláltság, az életstílus, amiben fontos szerepet kap a
dohányzás és alkoholfogyasztás. A különböző gyógyszerek, táplálék
kiegészítők fogyasztása.
1.3.1.3.2. Nem-kontrollálható variabilitások
A nem-kontrollálható variabilitások körét a 1. biológiai, 2.
környezeti, 3. hosszú távú ciklikus befolyások és az 4. alapvető
egészségügyi helyzet adja.
1.3.1.3.2.1.3.2.1. Biológiai hatások
A beteg kora, neme és a rassz, amelybe tartozik, mind
befolyásolják laboratóriumi tesztjeinek eredményét. Igen gyakran
oly mértékben, hogy különböző referencia tartományokat kell
felállítani ezek figyelembevételével.
Életkor: Az életkor igen jelentős mértékben befolyásolja a
referencia intervallumokat, elsősorban a hormonok esetében.
Általában négy korcsoportba szoktuk osztani a betegeket: újszülött
és csecsemő (1 éves korig), gyerekek és kamaszok (pubertás),
szexuálisan érett felnőttek és idősek.
Nem: Egészen a pubertásig csak igen kevés különbség
tapasztalható a fiúk és a lányok laboratóriumi paraméterei között.
Ezt követően a nemi hormonok és a következményes fiziológiai
változások, mint például a férfiak esetében általában előforduló
nagyobb izomtömeg már igen jelentős eltéréseket is okozhat.
1.3.1.3.2.1.3.2.2. Környezeti hatások
A laboratóriumi paramétereket befolyásoló környezeti tényezők
közé tartozik a 1. tengerszint feletti magasság, a 2. környezeti
hőmérséklet, a 3. földrajzi hely, lakhely, illetve az 4. évszaki
befolyások.
1.3.1.3.2.1.3.2.3. Alapvető egészségügyi állapot
A következő általános egészségügyi állapotot befolyásoló
tényezők bizonyosan befolyással vannak a testfolyadékok
összetételére: 1. elhízás, 2. vakság, 3. láz, 4. sokkos állapot,
trauma, 5. transzfúzió és infúzió.
Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk
Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
2. fejezet - Molekuláris biológiai módszerek az örökletes,
veleszületett betegségek diagnosztikájában
2.1. A DNS, a humán DNS főbb jellemzői
A sejtjeink DNS állománya által kódolt fehérjék határozzák meg
sejtjeink szerkezetét és funkcióját. Amennyiben a DNS állományunk
megváltozik, sérül, megváltozhat az általuk kódolt fehérje
szerkezete, ezáltal funkciója is, amely igen gyakran betegségekhez
vezethet. Vegyük szemügyre kicsit alaposabban genetikai
háttértárunkat, sejtjeink DNS állományát.
A humán sejtek két kompartimentumban tartalmaznak örökítő
anyagot, DNS-t a sejtmagban (nukleáris DNS) és a
mitokondriumban.
Nukleáris DNS: A sejt DNS állományának legnagyobb része kettős
magmembránnal védve, a sejtmagban található. A sejtmagban található
DNS mintegy hárommilliárd (3,2*109) bázispárból áll. Ez a
hárommilliárd bázispárnyi DNS 46 db (23 pár) kromoszómán oszlik
meg, nagyjából 25000 önálló transzkripciós egységet, gént
tartalmazva. Az ivarsejtek és még néhány sejt kivételével minden
egyes humán sejt minden kromoszómából két kópiát, egy apai és egy
anyai eredetű kópiát tartalmaz. 2001-re ismertté vált a humán genom
első, még kissé kiforratlan szekvenciája, 2004-re pedig a finom
szekvencia is. A humán genom megismerésével az örökletes, genetikai
betegségek diag-nosztikája is nagy lendületet kapott. A hihetetlen
adathalmaz több jelentős direkt felfedezést is hozott. Az első
közülük az volt, hogy a genom mindössze igen csekély része
(1-1,5%-a) a fehérjét kódoló szakasz. Egy átlagos gén mintegy 27000
bázispárból (bp) áll. Ha ezt összevetjük azzal, hogy egy átlagos
méretű fehérjelánc kódolásához mindössze 1300 bp-ra van szükség,
akkor láthatjuk, hogy valóban jelentős méretű a nem kódoló részek
aránya. Mi lehet ezen szekvenciák szerepe? Az exon és intron
szekvenciákon kívül jelentős méretű regulációs szekvencia is társul
minden egyes génhez, amelyek feladata, hogy a megfelelő időben be
(vagy ki) kapcsolt állapotban legyen az adott gén, illetve
biztosítják, hogy a megfelelő mértékben fejeződjék ki és csak is
kizárólag a megfelelő sejttípusban.
A teljes genom szekvenciájának ismeretében megválaszolhatjuk a
sokakat érdeklő kérdést, hogy mekkora különbség van két különböző
fajhoz tartozó élőlény és mekkora két ember DNS szekvenciája
között.
Egy csimpánz és egy ember DNS szekvenciája mindössze nagyjából
1%-os különbséget mutat. Ha két ember ugyanazon DNS szekvenciáját
vizsgáljuk meg, akkor pedig kevesebb, mint 0,1% különbséget
találunk. Nyílván az egyes fajok közötti különbség, mint egy adott
egyed különbsége (mutációja) jelenik meg először. Az, hogy az adott
mutáció megragad-e a populációban és így a fajra jellemzővé válik-e
az azon múlik, hogy milyen funkcionális következményekkel jár.
Amennyiben a mutáció egyértelműen súlyos, káros következményekkel
jár, akkor kiszelektálódik és nem ragad meg a populációban
(hordozója méhen belül, vagy születést követően, a legtöbbször
utódok nélkül meghal). Következésképp, ha egy egyértelműen előnyös
reprodukciót érintő tulajdonságról van szó, az nagyon gyorsan
elterjedhet a populációban. A mutációk legnagyobb része se nem
káros, se nem előnyös. Ezen szelekciósan neutrális mutációk szintén
megragadhatnak és elterjedhetnek, így hozzájárulhatnak a különböző
genomok evolúciós változásához.
Az emberek között egyik leggyakrabban jelentkező különbség,
nagyobb DNS blokkok (melyek mérete nagyjából 1 kilobázispártól
néhány megabázispárig terjed) duplikációja, illetve deléciója. Ha
egy találomra kiválasztott ember DNS állományát összehasonlítjuk a
genom adatbázisban található szekvenciával, nagyjából 100
különbséget (CNV – copy number variation) találhatunk, az ilyen
hosszú szekvencia blokkok között. Néhány ilyen „kópia számbeli
különbség” gyakrabban, míg mások csak az emberek kis hányadában fog
előfordulni. Az egyes fajok, egyedek között fennálló különbségek
közül az egy bázis cseréjével járó SNP-k (single nucleotid
polimorphism) a legjobban karakterizáltak. Ahogy a nevük is
mutatja, mindössze egyetlen nukleotidot érintenek a genomban,
amelyben az emberek egy nagyobb populációja egyféle, míg másik
jelentős részük egy másik féle nukleotidot tartalmaz. Ha két ember
genomját összehasonlítjuk, akkor azok 2,5 millió ilyen helyen (1 az
1300 nukleotid párból) fognak különbözni. Néhány szekvencia részlet
kiemelkedik magas mutációs rátájával. Erre jó példát szolgáltatnak
a néhány nukleotidból álló ismétlődések, például a CA
ismétlődés(ek), amelyek igen gyakoriak a humán genomban (ahogy az
összes eukarióta genomban). A (CA)n motívumot tartalmazó DNS
részletek viszonylag alacsony fokú hűséggel replikálódnak, mivel a
templát és az újonnan szintetizálódott lánc között csúszás van, így
az n pontos értéke az egyes genomok között meglehetősen széles
skálán változhat. Ezek az ismétlődések, így ideális genetikai
markerek, tekintve, hogy minden ember heterozigóta – két különböző
n értéket hordoznak minden egyes CA ismétlődésre, egyféle hosszt
örökölve az anyától (n) és jó eséllyel egy másfajta ismétlődést,
hosszúságot örökölve az apától. Így az adott szakasz két kópiájában
az ismétlődések hossza egyedre jellemző, és kiválóan felhasználható
molekuláris markerként például kriminalisztikai vagy apasági
ügyekben. Habár a legtöbb hosszúság polimorfizmus és SNP a
fenotípust nem befolyásolja, egy kis hányaduk egyértelműen
felelőssé tehető az emberi sajátságok örökletes aspektusaiért. A
klinikai kémikus szemével nézve pedig igen nagy a jelentősége, hogy
akár egyetlen SNP, vagy akár a DNS hosszának (egy adott szekvencia
ismétlődési számának megváltozása: hosszúság polimorfizmusa) olyan
fehérjeszerkezetbeli különbséget idézhet elő, amely igen súlyos
kórképek kialakulásához vezethet.
Mitokondriális DNS: A mitokondriális DNS (mtDNS) jóval kisebb
méretű, mint a nukle-áris mindössze 16569 bp-ból áll. A lineáris
nukleáris DNS-sel ellentétben cirkuláris (a bakteriális DNS-hez
hasonlóan), ezzel is bizonyítékot szolgáltatva a mitokondrium
bakteriális eredetére. A mtDNS kizárólag anyai ágon öröklődik,
kizárólag a petesejtekben található mtDNS-ek határozzák meg a
születendő gyerek mtDNS-ét. A kisméretű mtDNS összesen 37 gént
tartalmaz. A 37 gén közül 13 gén fehérjét kódol, 2 gén rRNS-t, 22
gén tRNS-t. Az mtDNS által kódolt fehérjék a mitokondriális
elektron transzfer lánc fontos alkotói. A II-es komplex kivételével
mindegyik komplex rendelkezik egy, vagy több mtDNS által kódolt
alegységgel (I: 7 db, III: 1 db, IV: 3 db, ATP-szintáz: 2 db). A
mtDNS által kódolt RNS-ek pedig a mitokondriális transzlációs
apparátus alkotói. A mtDNS-ben bekövetkezett mutációk, éppen ezért
a sejtek energiatermelő folyamataira lesznek ha-tással. Ezért
különösen a nagy energiaigényű szövetek (ideg, szívizom, vázizom,
máj) esetében kell súlyos következményekkel számolnunk.
A mtDNS pedig különösen magas mutációs rátával rendelkezik,
aminek oka lehet rossz hibajavító apparátusa, a mitokondriumban
termelődő nagy mennyiségű reaktív oxigénvegyület, a mtDNS nem
rendelkezik klasszikus hiszton fehérjékkel, ez tovább fokozza
védtelenségét. Mindezek hozzájárulhatnak ahhoz, hogy jelenleg több
mint 5000 különféle mtDNS mutációt ismerünk. Az mtDNS mutációk
száma a kor előrehaladtával nő, így az idősebb korosztályt
hangsúlyosabban érinti.
2.2. DNS izolálás
A klinikai kémiában egyre növekvő szerepet kapnak a molekuláris
biológiai módszerek. Felhasználjuk őket: 1. örökletes, genetikai
hátterű betegségek diagnosztizálására. Ebben az esetben az előző
fejezetben leírtak szerint ismert SNP-ket, vagy a DNS hosszúságának
megváltozását keressük. 2. Kórokozók kimutatására. Ebben az esetben
ismert idegen eredetű, az adott kórokozóra jellemző szekvenciájú
DNS jelenlétét mutatjuk ki. Amennyiben ezt a DNS részletet ki
tudjuk mutatni azzal meghatároztuk az adott élőlényt (vírust,
baktériumot, gombát, személyazonosítás esetén embert). 3. Egyre
nagyobb súlyt kapnak (a személyre szabott gyógyszeres terápia
térnyerésével) a farmakogenetikai vizsgálatok (pl. CYP2C9
polimorfizmusok), 4. Végül, de nem utolsó sorban kiemelt szerep jut
számukra a vérképzőszervi daganatok diagnosztikájában, genetikai
hátterének felderítésében (pl. Philadelphia kromoszóma:
t(9,22)).
Mindegyik esetben az első feladat megfelelő minőségű DNS
izolálása. Tekintsük át röviden, hogy milyen fontosabb lépései
vannak a DNS izolálási eljárás(ok)nak.
A mintavétel, ahogy az 1. fejezetben írtuk a vizsgálat céljától
függő szövetből történhet invazív módon, leggyakrabban vérvétellel,
korionboholyból (CVS), illetve nem invazív módon bucca sejtekből,
hajból, körömből. Természetesen bármilyen DNS tartalmú minta
alkalmas lehet DNS izolálásra, legfeljebb a módszert kell
adaptálni, a leggyakrabban gyakorlati megfontolásból az előbb
felsorolt mintákból történik a DNS kinyerése.
2.2.2.2.1. A sejt feltárása
A DNS-hez hozzá kell férnünk, így első lépésünk a sejt feltárása
lesz. Humán sejtek esetében, amelyek nem rendelkeznek sejtfallal
legtöbbször elegendő a hipotóniás sokk (valamilyen alacsony
koncentrációjú semleges kémhatású pufferbe tesszük a feltárandó
sejteket). A komoly sejtfallal rendelkező baktériumok esetében
szükséges a sejtfal emésztése lizozimmel. Ezen kívül szövetdarabok,
baktériumok esetén szükség lehet mechanikai szövet-,
sejtfeltárásra. Ilyen mechanikai feltárók a French press, Waring
késes feltáró, a BeadBeater, a Potter-Elvehjem feltáró. Szintén
mechanikus feltárási eljárás, a térfogatváltozáson alapuló,
ismételt fagyasztás-olvasztás. Kötőszövetekből történő izolálás
esetén (kollagenáz) enzimes kezelésre is szükség lehet. A különböző
membránszerkezetek megbontása detergensekkel, illetve enzimekkel
(leggyakrabban proteináz K) történik.
2.2.2.2.2. A sejt saját nukleázainak inaktiválása
Célunk a lehető legkisebb mértékben sérült genomi DNS (egyes
esetekben organelláris DNS) kinyerése. Ehhez a sejt saját
nukleázait, amelyek felszabdalnák a DNS szálakat inaktiválnunk
kell. Ez leggyakrabban EDTA tartalmú pufferek használatával
történik meg, mivel ezek a nukleázok működéséhez szükséges ionokat
(Ca2+, Mg2+) megkötik.
2.2.2.2.3. Szennyező alkotók eltávolítása
A legnagyobb gondot a szennyező fehérjék jelenthetik (különösen
a leggyakoribb izolálást követő folyamat, a PCR alkalmazása során).
A szennyező fehérjéktől leggyakrabban oldószeres extrakcióval
(fenol/kloroform/izoamil-alkohol) szabadulhatunk meg. A fenol
vízzel rosszul elegyedő folyadék, ha a mintánkhoz, a vizes DNS,
fehérje oldathoz adjuk két külön fázis jön létre (hasonlóan mint a
víz, olaj rendszereknél). A fehérjék a fenolos, a DNS pedig a vizes
fázisba oldódik. A két fázis, centrifugálással elkülöníthető és a
vizes-DNS fázis lepipettázható. Ezen kívül a fehérjék
elkülöníthetők még szelektív kicsapással. A fehérjék eltávolítása
ez esetben NH4OAc-tal, vagy NaCl-dal történő kicsapással történik.
A kicsapódott fehérjéket ezt követően centrifugálással
leülepíthetjük.
2.2.2.2.4. A DNS szelektív kinyerése
A vizes DNS oldathoz, vele megegyező térfogatú, alkohol oldatot
adva a hosszú DNS láncok kicsapódnak és centrifugálással könnyen
szeparálhatóak. A DNS alkoholos kicsapása történhet 2-propanollal,
illetve etanollal. Újabban néhány kromatográfiás módszer is
megjelent a piacon. Alkalmazásuk egyelőre meglehetősen drága, ezért
széles körben nem terjedtek még el.
2.3. A DNS méret szerinti elválasztása gélelektroforézissel
A DNS méret szerinti elválasztása leggyakrabban agaróz gélben
szokott történni. A gél alapanyaga az agaróz egy hínárból kivont
poliszacharid, amely csak forró vízben oldódik és lehűlve
megdermed. A feloldást követően egy téglatest alakú formába töltjük
és egy fésűt helyezünk a még olvadt agaróz oldatba. A dermedést
követően a „fésűfogak” lenyomata fogja képezni a gélzsebeket,
amelyekbe az elválasztani kívánt DNS oldatot töltjük. Az agaróz
tömböt egy pufferrel töltött kádba helyezzük, amelyre egyenáramot
kapcsolunk (2.1. ábra). A gélelektroforézis során az áram hatására
a foszfát csoport miatt negatív töltésű DNS a pozitív elektróda
irányába mozdul el. Az elmozdulást a gélmátrix annál jobban
akadályozza minél nagyobb méretű a DNS szál. A gélelektroforézist
mindaddig végezzük, amíg a DNS oldathoz kevert kék színű
indikátorfesték, például a bróm-fenol kék el nem éri a gélhasáb
szélét. A bróm-fenol kék és társai kis molekulaméretű, negatív
töltésű festékek, így a DNS-szálak garantáltan lassabban haladnak
és nem futnak ki a gélből a pufferbe. Ekkor, hogy láthatóvá tegyük
a DNS-szálakat a gélt etídium-bromid oldatba tesszük. Az
etídium-bromid egy fluoreszcens festék, amely a DNS és RNS
molekulák bázisai közé interkalálódik. A gélt UV fénnyel
átvilágítva a nukleinsav láncokba interkalálódott etidium-bromid
élénk színnel fluoreszkál. A DNS-szálak méretét ismert hosszúságú
DNS-t tartalmazó, DNS molekula tömeg markerrel, úgy nevezett
létrával tudjuk megállapítani. Az azonos utat megtevő DNS csíkok,
azonos mérettel rendelkeznek (2.1. ábra).
2.1. ábra - DNS minták (agaróz) gélelektroforézise.
A DNS mérete és a megkívánt felbontás alapján választjuk ki a
gél anyagát, töménységét. Az agaróz gélelektroforézis egyszerű, de
nem túl jó felbontást tesz lehetővé (viszonylag tömény 2% körüli
gél esetében is maximum 10 bp-os felbontás). Az agaróz mellett,
kisebb méretű (50-1000 bp) DNS-szálak elválasztására alkalmazzák a
poliakrilamid gélelektroforézist. Ebben az esetben már 3 bp-os
felbontás is elérhető. Ettől komolyabb felbontás, akár 1 bp
különbség is elérhető kapilláris gélelektroforézis-sel. Kapilláris
gélelektroforézis során egy keskeny kapilláris egyik oldalán
történik a mintafelvitel és a hagyományos gélelektroforézissel
megegyező módon, a kapilláris két oldalára kapcsolt egyenáram
hatására történik meg a különböző gélmátrixot tartalmazó
kapillárisban a méret szerinti elválasztás. A kapilláris túloldalán
található detektor segítségével történik a nukleinsavak detektálása
(2.2. ábra).
2.2. ábra - DNS minták kapilláris elektroforézise.
Eredményként, egy kromatogramhoz hasonló elektroforetogramot
kapunk, ahol az eltelt idő, vagy a molekulaméret függvényében
ábrázolják a detektor jelének intenzitását (2.9. ábra).
Az izolálás során nyert genomi DNS hosszú, különböző mértékben
fragmentálódott darabokból áll. Nehezen kezelhető ebben a formában.
A DNS minták kezelését megoldja, illetve a további vizsgálatok is
megkívánják, hogy kisebb darabokra vágjuk őket. Ebben bakteriális
enzimek, a restrikciós endonukleázok vannak a segítségünkre. A
DNS-hez kötődnek a specifikus (általában 4-6 bp-ból álló)
felismerési helyen és elhasítják a DNS láncot. Eredetileg a
baktériumokba behatoló vírusok ellen fejlődtek ki. A saját DNS
állományukat nem hasítják, mivel mindegyik restrikciós
endonukleáznak létezik egy metiláz párja, amely a saját DNS-t
metilálja, ezáltal egy védő jelet téve rá.
Az enzimek révén akár SNP-k kimutatása is lehetségessé válik. Ha
a kérdéses SNP átfed valamely restrikciós endonukleáz specifikus
hasítási helyével, akkor annak megléte, vagy hiánya befolyásolja az
adott DNS darab adott enzimmel történő hasítását. Például a vad
típusú DNS esetén létrejön a hasítás, az SNP-t (pontmutációt)
tartalmazó esetén pedig, mivel megváltozott az enzim hasítási helye
nem. Így, amennyiben vad típusú a DNS, két rövidebb darabkát kapunk
az enzimmel történt hasítást követő gélelektroforézis során.
Amennyiben a vizsgált DNS minta hordozta a szóban forgó SNP-t,
akkor pedig egy hosszabbat.
2.4. Hibridizáció, Southern blot
A gélelektroforézis és az etídium-bromidos festés segítségével
az egyes DNS szálak hossza megállapítható, de a különböző
bázissorrenddel rendelkező DNS szálak nem különböztethetők meg
egymástól. Az egyes DNS szálak beazonosítása során azt használjuk
ki, hogy a kettős szálú DNS vizes oldatban 100 °C-on, vagy lúgos
pH-n szétbomlik szimpla szálakra (a kettős láncot összetartó
hidrogén hidak felbomlása miatt, melynek egyik esetben a magas
hőmérséklet okozta hőmozgás, a másikban az enol-oxo tautoméria áll
a hátterében). Ha huzamosabb ideig 65 °C-on tartjuk újra
kettősszálú szerkezetet vesz fel, kialakulnak a komplementer
bázispárok között a hidrogén hidak: hibridizál (renaturálódik).
Amennyiben a hibridizáció során a keresett DNS szakasszal
komplementer, jelölt próbát is adunk a DNS oldatunkhoz, azok a
megfelelő (komplementer) régiókkal hibridizálni fognak. A próbák
tehát 15 – néhány ezer bázispár hosszú radioaktívan, vagy
fluoreszcensen jelölt nukleotid szakaszok.
Az eljárás tehát két fő részből áll:
1. Elsődleges durva elválasztás gélelektroforézissel (méret
szerint)
2. Másodlagos specifikus analízis jelölt hibridizációs
próbával
A módszert, kifejlesztőjéről, Sir Edwin Southernről, Southern
Blot technikának nevezték el. Később hasonló módon, a Southern Blot
technikára alapozva megvalósították az RNS szálak: Northern Blot és
a fehérjeláncok: Western Blot azonosítását is. S mivel southern
angolul annyit tesz, hogy déli az utóbbi esetekben már az eltérő
égtájakról történt elnevezés, az eltérő molekulák azonosítására
utal.
A módszer igen érzékeny és szelektív. A polimeráz láncreakció
(PCR), amely szintén a hibridizáción alapul azonban valamelyest
háttérbe szorította.
2.5. Polimeráz láncreakció (PCR)
A polimeráz láncreakció során – melynek ötlete kifejlesztőjének
Kary Mullis fejében egy ezüstmetál Honda Civicben töltött hajnali
autóút során fogant meg, miután hazavitte barátnőjét és lakása felé
hajtott – tulajdonképpen a sejtben zajló replikáció folyamatát
másoljuk le. A legfontosabb különbség az, hogy míg a replikáció
során a teljes genomot lemásolja a sejt, addig a PCR során a minta
DNS mindössze egy általunk kiválasztott hosszabb, vagy rövidebb
részletéről készül igen jelentős számú kópia (2.3. ábra).
2.3. ábra - Polimeráz láncreakció
Adódik a kérdés, hogy tudjuk mi kiválasztani a megsokszorozni
kívánt DNS szakaszt? Bizonyára mindenki emlékszik még rá, hogy a
DNS polimeráz, csak egy már megkezdett oligonukleotid láncot tud
folytatni. Így a PCR reakcióelegynek tartalmaznia kell egy 15-25 bp
hosszú kezdő DNS oligonukleotid szekvenciát, a primert. A primer
szekvenciáját mi adjuk meg és gyártatjuk le egy céggel. A primer a
bázis komplementaritás alapján hozzáköt a templát DNS vele
komplementer régiójához és a DNS polimeráz ettől a ponttól kezdve
folytatja a lánc meghosszabbítását. Mindebből következik, hogy a
módszer alkalmazásának előfeltétele, hogy a vizsgálandó DNS-szakasz
nukleotid sorrendjét – legalább részben, a primerek tapadási
helyeinél – ismerjük.
Tekintsük át, milyen reagensekre van szükségünk a „kémcső
replikációhoz” és pontosan milyen folyamatok is zajlanak a PCR
csőben!
Hozzávalók:
· Templát DNS: Ezt az előzőek szerint izoláljuk a betegből
származó mintából.
· PCR puffer
· Primerek: tervezzük, majd leszintetizáltatjuk
· dNTP Mg2+: az újonnan szintetizálandó DNS lánc(ok)
építőelemei
· Hő stabil DNS polimeráz (pl. Taq, Pfu)
Történések:
Minden alkotót a megfelelő arányban összemérünk egy PCR csőbe és
a PCR készülékbe helyezzük. Ez tulajdonképpen egy programozható
termosztát. Egy általános PCR hőprogram három lépésből áll.
1. Denaturáció: A lépés során a készülék 95 °C-ra melegíti a
reakcióelegyet. Ennek hatására a kettős szálú DNS részletek között
a hidrogénhidak felhasadnak és egyszálúvá válnak.
2. Primerek betapadása: Az angolszász irodalomban annealing-nek
nevezett lépés során a készülék 40-60 °C közé hűti le a
reakcióelegyet. Ennek hatására a rövid primerdarabok betapadnak a
komplementer DNS részletekhez, létrejönnek köztük a H-hidak és
megindul a polimerizáció, a lánchosszabbítás folyamata.
3. Polimerizáció: A lépés során a készülék 72 °C-ra melegíti a
reakcióelegyet. Ez a hő stabil polimeráz optimális működési
hőmérséklete, a polimerizáció folyamata felgyorsul.
A PCR reakció során ezt a három lépést ismétli ciklikusan a
műszer (2.4. ábra)
2.4. ábra - A polimeráz láncreakció lépései, hőprogramja
Egy lépés nagyjából fél percig tart és hozzávetőlegesen
35-50-szer szoktuk megismételni. A primer, ahogy az ábrán is látjuk
az újonnan szintetizált DNS az egyik végét határozza csak meg. Így
a kívánt jól definiált hosszúságú
