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東京工業大学 科学技術創成研究院 未来産業技術研究所 初澤研究室
題目:同時個別機械刺激が可能な細胞培養デバイス
分野:分析・診断デバイス
種別:平成26年度修士論文
概要:骨細胞など,力による刺激で分化する細胞の培養を
効率的に行うため,異なる力学的刺激を同じ
プレート内で発生可能なデバイスを開発中です.
丈夫な骨細胞になるには機械的刺激が必要骨芽細胞
1.研究背景・目的
骨の再建手術
頭頸部癌による手術創
術前CT画像により作製した3Dスキャホールド
http://www.okayama-u.ac.jp/user/ohnccpky/infomation02.html
http://www.kms.ac.jp/~keisei/guide/head_and_neck_cancer.html
in vitroで培養した骨の直接移植
金属
アパタイト
骨芽細胞播種
3Dプリンタ
骨形成過程
間葉系幹細胞 骨前駆細胞 前骨芽細胞 骨芽細胞 骨細胞
2
Wolffの法則
『骨は加わる力に抵抗するのに最も適した構造を発達させる』
負荷がかかると,骨形成が促進されるがそのメカニズムは未解明である
N. Rosenberg, Cytotechnology 39: 125–130, 2002. C. Frias, Composites Science and Technology 70 (2010) 1920–1925
PVDFを用いた骨芽細胞への機械的負荷PVDFを用いた骨芽細胞への機械的負荷骨芽細胞への振動刺激モデル骨芽細胞への振動刺激モデル
1.研究背景・目的
In vitroで細胞に力学的刺激を与える研究が盛んに行われてきた
3 4
力学的刺激に対する細胞挙動が不明
所定形状までの培養に時間を要する
1.研究背景・目的
52.実験
デバイス提案
最適な刺激条件を効率よく探索
多種類培養プレート 刺激条件1
刺激条件2
刺激条件3
1日目 2日目 3日目 ・・・
例)
順次細胞を剥がして逐次細胞数計測が可能なデバイス
圧電素子
デバイス概要
○ウェルごとに与える周波数を変えることができ,多種類同時比較を行える
○低周波(数百Hz)~高周波(数十kHz)の幅広い条件での加振が可能
○オートクレーブによる滅菌が可能
○小型・インキュベータ内で用いることができる
拡大図
6 well-plate
PC(Poly Carbonate)板
2.実験
特徴
6
PDMS
細胞播種部
圧電素子PC板
72.実験
デバイス作製
I. 12well-plateを鋳型とし,PDMSを1mmの厚さに
なるよう流し込み,1次硬化
II. 圧電素子を配置し,上からPDMSを17.5mmの
厚さになるよう流し込み,2次硬化
III. 圧電素子をPC板に配置し,上からPDMSを流し
込み固める12well-plate
Poly Carbonate
82.実験
PDMS
細胞播種部
圧電素子 PC板
完成したデバイス・実験系
インキュベータ内
FG
CO2インキュベータ
9
刺激培養群
FG
2.実験
コントロール
通常培養群
材料細胞 : MC3T3-E1(継代2~4代目)
培地 : α-MEM 10%FBS
細胞計測 : トリプシン+EDTA,位相差顕微鏡,
ノイバウェル血球計算盤 http://www.primarycell.com/hanbai/hone_kotsuga.html
マウス骨芽細胞株 MC3T3-E1
培養プレート : 6-well plate
播種密度 : 5.0 10 cell
加振周波数 : 4000 Hz, 方形波,
交流電圧 p-p 15V
細胞計測 : 3日間隔
培養プレート : 6-well plate
播種密度 : 5.0 10 cell
加振周波数 : 4000 Hz, 方形波,
交流電圧 p-p 15V
細胞計測 : 3日間隔
実験条件
103.結果
播種後12時間後
播種後6日後
113.結果
4
FG
123.改良型デバイス原理
PDMS
細胞播種部
圧電素子従来
細胞への振動印加 ×
細胞観察(位相差顕微鏡) ○
細胞接着 ○
(播種部wellplate)
圧電素子
細胞播種部
PDMS
改良
細胞への振動印加 ○
⇒圧電素子:低振幅高周波数
⇒リレー:大振幅低周波数
リレー
細胞播種部
PDMS
細胞観察 ×⇒細胞測定(血球計算盤)
⇒細胞形態観察(SEM)
細胞接着 △⇒接着実験にて確認
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190 mm
50 mm30 mm
20 mm
190 mm
50 mm
振動子なし圧電素子 リレー
平面図
立体図
完成図
3.改良型デバイス原理 143.実験
ⅠPDMSへの細胞付着実験
Ⅱデバイスへの細胞播種実験
⇒PDMS細胞接着化法①PDMS表面のゼラチンコーティング
②酸素プラズマ処理によるPDMS表面の親水化
①細胞増殖期における細胞数測定
②細胞分化期におけるALP活性評価
圧電素子の振動子にバーストパルス波(duty比 10%)を採用
細胞播種実験
疎水性のため細胞が付着しにくい
3種類を比較
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条件 周波数 電圧 振動子
① 振動1000 Hz,duty比10% p-p 15 V 圧電素子
② 50 Hz p-p 2V リレー
③ - - -
細胞分化期におけるALP活性評価
細胞:MC3T3-E1(継代2~5代目)
播種密度 : 5.0 10 cell
ALP計測 : 72時間後より7日間隔
細胞:MC3T3-E1(継代2~5代目)
播種密度 : 5.0 10 cell
ALP計測 : 72時間後より7日間隔
マイクロプレートリーダーで測定
通常群と比較し振動群にて高いALP活性値が得られた
分化期における細胞への刺激が分化を促進することを確認
デバイスの有用性を確認
4.実験結果 165.結論
結論
機械的刺激培養デバイスの提案・作製
ALP活性評価から,デバイスの有用性を確認
今後の課題
コンタミネーションの防止
デバイスの小型化
骨芽細胞分化条件の特定