Xây dựng phương pháp định tính, định lượng

flavonoid trong lá và nụ vối

Nguyễn Quốc Tuấn

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn Thạc sĩ ngành: Hoá phân tích; Mã số: 60 44 29

Người hướng dẫn: PGS.TS. Phương Thiện Thương

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Tách được 2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchalcone (CO -1) từ

nụ vối. Xây dựng được phương pháp định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học. Tìm

ra được hệ dung môi định tính flavonoid bằng sắc ký bản mỏng (TLC). Tìm ra được

điều kiện chạy HPLC định tính chất CO-1 từ nụ và lá vối. Xác định được flavonoid

toàn phần trong lá và nụ vối của một số mẫu dược liệu vối thu hái ở các tỉnh phía Bắc.

Xây dựng được phương pháp định lượng CO-1 bằng HPLC. Ứng dụng phương pháp

xây được trong việc định lượng các mẫu lá và nụ vối thu hái ở các tỉnh phía Bắc.

Keywords: Hóa học; Hóa phân tích; Cây Vối

Content

MỞ ĐẦU

Cây Vối, một loại cây quen thuộc của làng quê các tỉnh Đồng Bằng bắc bộ, có tên

khoa học là Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry thuộc họ Sim (Myrtaceae). Từ

lâu nhân dân ta đã biết dùng lá và nụ vối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay

hãm lấy nước uống hàng ngày vừa có tác dụng thanh nhiệt vừa có tác dụng kiện tỳ, tiêu thực.

Thành phần hóa học chính trong nụ vối là flavonoid, với khoảng hơn 20 flavonoid

khác nhau. Các flavonoid có nhiều tác dụng sinh học quý như chống ung thư, chống dị ứng,

chống co giật, giảm đau, nghẽn mạch, nghẽn phế quản, lợi mật, diệt nấm... Trong dự thảo

Dược Điển Việt Nam V (dự kiến xuất bản năm 2013-2014) đã có chuyên luận về lá và nụ vối.

Tuy nhiên, trong các chuyên luận này chưa có tiêu chí về định tính và định lượng flavonoid

trong nụ vối, trong khi flavonoid là thành phần chính và có nhiều tác dụng quan sinh học

trọng.

Với thực trạng trên, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định

tính, định lƣợng flavonoid trong nụ và lá vối”. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây

dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng dược liệu nụ và lá vối phục vụ việc quản lý chất lượng

dược liệu trên thị trường.

Các mục tiêu của đề tài gồm có:

• Phân lập được một flavonoid chính trong nụ vối dùng làm chất đối chiếu trong việc

định tính, định lượng flavonoid.

2

• Xây dựng được quy trình định tính và định lượng flavonoid trong dược liệu nụ và lá

vối.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây vối

1.1.1 Tên gọi

- Tên tiếng Việt: Cây vối, vối nhà

- Tên Latin: Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry

- Tên đồng nghĩa: Eugenia operculata Roxb.

- Họ Sim (Myrtaceae).

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây vối là loại cây gỗ nhỡ, cao 5-10 m, có khi hơn, vỏ thân nứt nẻ, màu nâu đen. Cành

nhánh có nhiều vảy, cành non tròn hay hơi hình 4 cạnh, nhẵn Lá đơn mọc đối, có cuống dài 1-

1,5 cm, dai, cứng, phiến lá hình trái xoan hay hình trứng, dài 8-20 cm, rộng 5-8 cm giảm nhọn

ở gốc, có mũi ngắn. Quả hình cầu hay hơi hình trứng, đường kính 7-12 mm, xù xì, khi chín có

màu tím, thể chất nạc, vị ngọt.

a) Cây vối

b) Nụ vối tươi

b) Nụ vối khô

ơ

Hình 1.1: Hình ảnh Cây và Nụ vối

1.1.3 Thành phần hóa học

Lá Vối chứa rất ít tanin, vết alcaloid (nhóm indolic) và tinh dầu, tinh dầu lá gồm nhiều

thành phần trong đó thành phần chính là (Z)-β-ocimen, myrcen, (E)-β-ocimen. Trong lá vối

có chứa flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đường tự do và sterol. Vỏ cây chứa triterpen

nhóm ursan là acid usolic. Nụ vối chứa nhiều flavonoid khác nhau, với nhiều thành phần đã

xác định cấu trúc hóa học.

1.1.4 Tác dụng sinh học của các flavonoid trong lá và nụ vối

Các flavonoid còn có khả tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như những

chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa. Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ

thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, thoái hóa gan, tổn thương do bức

xạ.

3

Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý

tim mạch như thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch,…nhờ

khả năng chống oxy hóa không hoàn toàn cholesterol.

- Tác dụng ức chế sự phát triển của TB ung thư: 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-

dimethylchalcone phân lập từ nụ vối có tác dụng ức chế sự phát triển của TB ung thƣ

với các dòng TB ung thƣ khác nhau.

- Tác dụng làm giảm đường huyết: tác dụng ức chế maltase đường ruột làm giảm đường huyết

trên chuột gây bệnh tiểu đường.

- Tác dụng chống oxy hóa: ức chế các enzym α-glucosidase.

- Tác dụng chống Alzheimer: các flavonoid như quercetin, kaempferol, tamarixetin được phân

lập từ nụ vối có tác dụng chống Alzheimer thông qua ức chế acetylcholinesterase và

butyrylcholinesterase.

1.2 Các phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid

1.2.1 Phƣơng pháp định tính

a) Phương pháp ống nghiệm

Phản ứng với hơi amoniac

Nhiều flavonoid thay đổi màu khi gặp hơi NH3. Có thể quan sát sự biến đổi màu này

bằng mắt thường hoặc dưới ánh sáng tử ngoại.

Phản ứng cyanidin (phản ứng Shinoda).

Phản ứng do sự có mặt nhân γ-penzopyron trong đa số flavonoid. Thuốc thử là HCl

đặc và bột Magie kim loại.

Phản ứng bằng thuốc thử Sibata và dung dịch H2SO4 đậm đặc

Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài mililit H2SO4 đậm đặc, sau đó cho thêm 0,1

gam Mg, tiếp theo thêm từ từ rượu isoamylic theo thành ống nghiệm. Đun nóng, có màu hồng

từ từ xuất hiện rồi chuyển sang đỏ cam hoặc đỏ tím [6].

Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5%.

Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc sẽ xuất

hiện màu xanh đen.

b) phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM)

SKLM là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua

pha tĩnh, trên đó ta đặt hỗn hợp các chất cần tách .

1.2.2 Phƣơng pháp định lƣợng flavonoid

a) Phương pháp cân: Ứng dụng khi nguyên liệu giàu có flavone hoặc flavonol và dịch

chất ít tạp chất.

b) Phƣơng pháp trắc quang

Nguyên tắc: Phương pháp xác định dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng của một dung

dịch phức tạo thành giữa chất cần xác định với thuốc thử vô cơ hay hữu cơ trong môi trường

thích hợp khi được chiếu bởi chùm sáng. Phương trình định lượng của phép đo dựa trên định

luật Lamber-Beer: A = K.C

4

Trong đó: A: Độ hấp thụ quang

K: Hằng số thực nghiệm

C: Nồng độ chất phân tích

Phương pháp này cho phép xác định nồng độ chất ở khoảng 10-5

– 10-7

M và là một

trong những phương pháp được sử dụng khá phổ biến.

Đối với flavonoid cho tạo màu khi phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối

diazoni, tạo phức màu với AlCl3, muối titan…

Phương pháp trắc quang có độ nhạy, độ ổn định cũng như độ chính xác khá cao và là

phương pháp được sử dụng phổ biến trong phân tích.

c) Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp hóa lý dựa vào ái lực khác

nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau, một pha

động và một pha tĩnh. Quá trình sắc ký xảy ra do các cơ chế: Hấp phụ, phân bố, trao đổi ion

hoặc rây phân tử.

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra

khỏi cột đạt giá trị cực đại cho pic trên sắc ký đồ.

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Nụ và lá vối nhà, Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr.et Perry thuộc họ Sim

(Myrtaceae) được thu hái ở các địa phương khác nhau, ở các tỉnh phía Bắc. Sau đó phơi và

sấy ở 500C cho đến khô. Các mẫu nụ và lá vối được lưu ở Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn,

Viện Dược liệu

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập một flavonoid chính từ nụ vối. Tinh chế hoạt chất đạt độ tinh khiết cần thiết

cho việc định tính, định lượng.

- Xây dựng phương pháp định tính flavonoid từ lá và nụ vối.

- Xây dựng phương pháp định lượng một flavonoid chính từ lá và nụ vối.

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, dung môi

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ

- Cân kỹ thuật Precisa XT 620M

- Cân phân tích Precisa XT 220A

- Máy cất quay Buchi B481

- Tủ sấy Binder – FD 115

- Đèn tử ngoại

- Hệ thống HPLC _ LC10A, hãng Shimadzu (Nhật Bản)

- Máy TLC chấm mẫu bán tự động CAMAG LINOMAT5, CAMAG REPROSTAR3.

- Máy UV-VIS 1800, dải đo 190 nm-900 nm, hãng Shimadzu (Nhật Bản)

2.3.2 Hóa chất, dung môi

5

- Dung môi: methanol, n-hexan, ethyl acetat, toluen… dùng cho sắc ký đạt tiêu chuẩn

phân tích, dung môi dùng trong chiết xuất đạt tiêu chuẩn công nghiệp được chưng cất lại

trước khi dùng.

- Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silica gel GF254 (Merck).

- Silica gel sắc ký cột pha thường, cỡ hạt 40-63µm (Merck).

- Hóa chất: các hóa chất để làm các phản ứng định tính bằng phương pháp hóa học, định

tính phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và định lượng bằng phương pháp đo quang,

HPLC.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Chiết xuất và phân lập một flavonoid chính từ nụ vối

3.1.1. Chiết xuất dƣợc liệu và phân đoạn

Cân 8 kg dược liệu (nụ vối) làm khô, chiết bằng ethanol 96% bằng phương pháp ngâm

lạnh, cho ethanol ngập hết dược liệu, thời gian ngâm là 1 tuần/lần rút dung dịch chiết, ngâm 3

lần (dịch đã nhạt màu). Dung dịch chiết thu được, đem cất thu hồi dung môi ethanol và cô

cách thủy, thu được cao toàn phần (1192 g). Lấy 1000 g cao đem hòa tan một lượng vừa đủ

0,5 lít ethanol 96%, và tiếp tục bổ xung thêm 1,5 lít nước cất để hòa tan. Quy trình chiết được

tóm tắt ở sơ đồ 3.1:

3.1.2 Phân lập flavonoid chính trong cao phân đoạn ethyl acetat

Cân khoảng 300g cao phân đoạn EtOAc Tiến hành chạy cột với hệ dung môi n-hexan:

ethyl acetat với độ phân cực tăng dần (tỉ lệ dung môi từ 49:1 đến 1:1). Dùng bình nón có thể

tích 250 ml để hứng dung dịch ra khỏi cột, thu được 32 bình (200 ml). Tất cả các bình hứng

đều được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Bằng cách này, ta thấy từ bình 04 đến bình 09 cho

sắc đồ giống nhau có 1 vết màu vàng (hình 3.1), gộp các bình này lại, cất thu hồi dung môi và

cô cách thủy đến khô thu được chất rắn có màu da cam, gọi là chất rắn CO-1 (4,329 g).

a) Hình ảnh SKLM

b) Hình ảnh chất CO-1

Hình 3.1: Hình ảnh SKLM và chất CO-1 phân lập từ nụ vối

6

3.1.3. Xác định cấu trúc chất phân lập

Chất rắn CO-1 là tinh thể có màu vàng da cam, có điểm nóng chảy 125-1270C. Kiểm

tra độ tinh khiết bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho biết chất CO-1 phân lập

được có độ tinh khiết 98,21% tính theo diện tích pic, sắc ký đồ thể hiện ở hình 3.2

Minutes

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

mA

U

0

100

200

34016

1457

5242

1199

1875

691

2476

66

6412

2036

1009

2351

1201

15949

4250687

506

116

160

102

142

300

197

358

314

146

113

259

545

258

165

179

252

83

251

206

966

581

381

144

9: 341 nm, 8 nm

nuvoistd

nu voi_stdCO55(0.11mg-ml)- 13042012 - 5uL -002.dat

Area

Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC của chất CO-1

Kết hợp số liệu các phổ UV, IR, 1H-NMR và

13C-NMR cho thấy chất CO-1 là 2',4'-

dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon, có CTPT là C18H18O4 và KLPT 298 amu.

Phổ khối MS cho pic ion phân tử ở [M+H]+, có m/z = 299; ở [M-H]

+ có m/z = 297, tương

ứng với khối lượng phân tử của chất rắn CO-1 là M = 298 amu.

Công thức cấu tạo của chất CO-1 được trình bày trong hình 3.3.

Hình 3.3: Công thức cấu tạo chất CO-1

Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC, đo nhiệt độ nóng chảy của CO-1 nhiều lần đều cho

kết quả ổn định ở 125-127oC. Như vậy, có thể sử dụng mẫu chất CO-1 phân lập được làm

chất đối chiếu trong phép xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid và chất này

trong các mẫu nụ và lá vối.

3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính flavonoid trong lá và nụ vối

3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học

Bảng 3.1: Kết quả định tính flavonoid trong nụ và lá vối

3.2.2 Định tính bằng TLC

3.2.2.1 Định tính flavonoid trong dược liệu nụ và lá vối

a) Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký

Dung dịch thử: Lấy 1 gam bột dược liệu (nụ, lá vối) cho vào bình nón, thêm 50 ml

methanol (MeOH) rồi đem siêu âm 30 phút, lọc qua giấy lọc, dịch lọc để làm các phép định

tính.

7

Dung dịch đối chiếu: Dung dịch flavonoid chính (tách được ở nụ vối) trong MeOH

(hàm lượng khoảng 1 mg/ml).

b) Hệ dung môi sắc ký: Tiến hành khảo sát triển khai sắc ký cho các hệ dung môi sau:

Hệ 1: Toluen:EtOAc:Aceton:Acid formic =5:2:2:1 (v:v:v )

Hệ 2: EtOAc:Acid acetic:Acid formic:Nước =10:1:1:2 (v:v:v:v )

Hệ 3: n-Hexan : EtOAc : Acid formic =6:3:0,1 (v:v:v )

Hệ 4: EtOAc : Toluen : Acid formic : Nước = 7:3:1,5:1 (v:v:v)

Hình 3.4: Sắc ký đồ định tính flavonoid trong nụ và lá vối

C: Chất chuẩn CO-1 N: Nụ vối L: Lá vối

Các sắc ký đồ hình (A,B,C) cho thấy flavonoid trong nụ, lá vối cho các vết màu đen

xám khi soi dưới UV-254 nm và UV-366 nm. Sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% /ethanol và

sấy ở 1050C, ở miền ánh sáng trắng cho các vết có màu vàng (Rf =0,47) đặc trưng của

flavonoid.

Như vậy có thể sử dụng hệ 3 làm hệ dung môi cho việc triển khai sắc ký để định tính

flavonoid trong việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu nụ, lá vối.

3.2.3 Định tính bằng HPLC

* Chuẩn bị dung dịch lá vối: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu, thêm chính xác

khoảng 25,00 ml methanol, đem siêu âm 30 phút, làm lặp 2 lần, để nguội, bổ sung lượng

methanol đã mất cho đủ 50,00ml. Lọc, đem đi xác định hàm lượng.

* Chuẩn bị dung dịch nụ vối: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu, thêm chính xác

khoảng 25,00 ml methanol, đem siêu âm 30 phút, làm lặp 2 lần, để nguội, bổ sung lượng

methanol đã mất cho đủ 50,00 ml. Lọc, hút ra chính xác 1ml đem hòa tan định mức thành

10,00ml bằng methanol, sau đó đem đi tiêm sắc ký.

* Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn: Cân chính xác 1,10 mg chất CO-1, thêm chính xác

1,00 ml methanol, sau đó đem siêu âm trong 10 phút. Hút chính xác 0,50 ml đem pha loãng

bằng methanol tới 5,00 ml để được nổng độ của CO-1 là 0,11 mg/ml, sau đó đem tiêm sắc ký.

8

Minutes

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

mA

U

0

100

200

34016

1457

5242

1199

1875

691

2476

66

6412

2036

1009

2351

1201

15949

4250687

506

116

160

102

142

300

197

358

314

146

113

259

545

258

165

179

252

83

251

206

966

581

381

144

9: 341 nm, 8 nm

nuvoistd

nu voi_stdCO55(0.11mg-ml)- 13042012 - 5uL -002.dat

Area

Sắc ký đồ chất đối chiếu (C)

Minutes

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

mA

U

0

20

40

60

80

1885

597620

40768

31034

145292

37467

107289

68840

63088

52777

35304

1652910

5215

4829

5537

3529

77788

54358

3252

2988

5471

1672

1178

1307

425

227

61169

429

452

254

93

140

171

155

9: 341 nm, 8 nm

nuvoihungyen

nuvoihungyenm2(4mg.ml)- 25042012 - 10uL -001.dat

Area

Sắc ký đồ của nụ vối (N)

Minutes

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

mA

U

0

100

200

300

400 9: 341 nm, 8 nm

lavoi

lavoibacgiang(20mg.ml)- 29052012 - 10uL -003.dat

Area

Sắc ký đồ của lá vối (L)

Hình 3.5 : Sắc ký đồ của mẫu đối chiếu CO-1 và nụ, lá vối

Qua tiến hành thí nghiệm tìm ra điều kiện định tính CO-1 trong nụ và lá vối bằng sắc

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thông qua thời gian lưu tR.

3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid trong lá và nụ vối

3.3.1 Xây dựng bằng phƣơng pháp trắc quang

3.3.1.2 Độ lặp lại của phƣơng pháp

Để xác định độ lặp lại của phương pháp tiến hành với 6 thí nghiệm riêng biệt cho mẫu

nụ vối Hưng yên.

Bảng 3.2: Kết quả độ lặp lại của phương pháp trắc quang

STT 1 2 3 4 5 6

mmẫu(g) 1,0041 1,0064 1,0110 1,0365 1,0189 1,0831

Abs 0,174 0,181 0,184 0,191 0,196 0,193

Số liệu thống kê SD = 0,83.10-2

; RSD = 4,45%

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy phương pháp có độ lặp lại có thể chấp nhận được thông

qua RSD = 4,45% (< 5%).

3.3.1.3 Xây dựng đƣờng chuẩn

Xây dựng đường chuẩn bằng chất đối chiếu CO-1: Tiến hành pha một dãy dung dịch

đối chiếu CO-1 (chất tách được từ nụ vối) với nồng độ chính xác là 12, 24, 36, 48 , 72 và 100

mg/l. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 Dựa trên phần mềm excel để vẽ đồ thị đường chuẩn ở

(hình 3.6).

Bảng 3.3: Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu CO-1

Nồng độ (mg/l) 12 24 36 48 72 100

A510 (Abs) 0,042 0,082 0,120 0,160 0,231 0,332

9

y = 0.0033x + 0.0026

R2 = 0.999

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0 20 40 60 80 100 120

Nồng độ CO-1 (mg/l)

Độ

hấ

p t

hụ

qu

an

g

Hình 3.6: Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo CO-1

Từ kết quả ở bảng 3.5 và hình 3.7 kết quả khảo sát trên cho thấy với nồng độ của chất

đối chiếu CO-1 từ 12-100 mg/l có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ

quang. Ta được y = 0.0033x + 0.0026 với hệ số tương quan R2 = 0.9990. Dựa trên phần mềm

Originpro 7.5 tính được độ lệch chuẩn của phương trình hồi quy là Sy= 0,00366 và SA=

5,04.10-5

; SB = 0,0028. Tra bảng ta t(0,95; 5) = 2,571

phƣơng trình hồi quy đầy đủ: y = (0,0033 ± 1,30.10-4

)x + (0,0026± 0,0072)

Xây dựng đường chuẩn bằng chất chuẩn catechin: Tiến hành pha một dãy dung dịch

chuẩn catechin (Sigma) với các nồng độ chính xác là 45, 90, 180, 360 và 450 mg/l. Kết quả

được trình bày ở bảng 3.6. Dựa trên phần mềm excel để vẽ đồ thị đường chuẩn ở (hình 3.7).

Bảng 3.4: Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất chuẩn catechin

Nồng độ (mg/l) 45 90 180 360 450

Độ hấp thụ quang A510(Abs) 0,107 0,214 0,457 0,890 1,091

y = 0.0024x + 0.0022

R2 = 0.9993

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 100 200 300 400 500

Nồng độ Catechin (mg/l)

Độ

hấ

p t

hụ

qu

an

g

Hình 3.7: Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo catechin

Kết quả ở bảng 3.6 và hình 3.8 kết quả khảo sát trên đã chỉ ra rằng với nồng độ của

chất chuẩn catechin từ 45-450 mg/l có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ

quang. Ta được y = 0,0024x + 0,002 với hệ số tương quan R2 = 0.9993. Tra bảng được t(0,95;

4) = 2,776. Dựa trên phần mềm Originpro 7.5 ta tính được độ lệch chuẩn của phương trình hồi

quy như sau: Sy = 0,01289 và Sa= 3,70.10-5

; Sb = 0,01013.

Phƣơng trình hồi quy đầy đủ là: y = (0,0024 ± 1,07.10-4

)x + (0,002 ± 0,0028)

3.3.1.4 Giới hạn phƣơng pháp.

a) Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ:

10

Để tiến hành xác định LOD và LOQ tiến hành chuẩn bị các dung dịch mẫu trắng bằng

cách lấy vào 10 bình định mức cỡ 10 ml: Cho vào bình có chứa sẵn khoảng 4 ml nước cất +

0,3 ml NaNO2 5% + 0,3 ml AlCl3 10% + 2 ml NaOH 1M sau đó định mức bằng nước cất hai

lần, sau khoảng 10 phút thì đem đi đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch trên ở bước sóng

510 nm (với dung dịch so sánh là nước cất) ta thu được kết quả như trong bảng 3.7.

Bảng 3.5: Kết quả xác định độ lệch chuẩn của mẫu trắng

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A510 0,002 0,002 0,003 0,002 0,004 0,002 0,003 0,002 0,002 0,004

Kết quả trên ta tính được giá trị trung bình: OA = 0,0026

Giá trị độ lệch chuẩn: SD = 0,843.10-3

Giới hạn phát hiện LOD và LOQ của phương pháp khi dùng chất CO-1 làm chất đối

chiếu:

LOD = 3. YS

b = 3.

30,843.10

0,0033

= 0,77 mg/l

LOQ = 10. YS

b = 10.

30,843.10

0,0033

= 2,55 mg/l

Giới hạn phát hiện LOD và LOQ của phương pháp khi dùng chất chuẩn catechin làm chuẩn:

LOD = 3. YS

b = 3.

30,843.10

0,0024

= 1,05 mg/l

LOQ = 10. YS

b = 10.

30,843.10

0,0024

= 3,51 mg/l

b) Giới hạn LOL: Xác định bằng cách nới rộng nồng độ ở điểm trên của đường chuẩn

cho đến khi tương quan giữa nồng độ và độ hấp thụ quang không còn tuyến tính nữa.

Đối với chất đối chiếu CO-1:

Bảng 3.6: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của chất đối chiếu CO-1

Nồng độ CO-1 (mg/l) 48 72 100 110 120 130

A510 0,160 0,231 0,332 0,351 0,376 0,381

11

Giới hạn LOL

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 50 100 150

Nồng độ CO-1 (mg/l)

Độ

hấp

th

ụ q

uan

g

Hình 3.8: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của CO-1

Kết quả bảng 3.6 và hình 3.8 cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 120 mg/l, tại nồng độ

này trở đi thì đồ thị của độ hấp thụ quang theo nồng độ không còn tuyến tính. Như vậy

khoảng tuyến tính của phương pháp xác định theo chất đối chiếu CO-1 là khoảng từ 2,55 –

120 mg/l.

Đối với chất chuẩn catechin:

Bảng 3.7: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của catechin

Nồng độ catechin (mg/l) 500 900 1000 1100 1200 1300

A510 1,217 2,246 2,534 2,712 2,798 2,834

Giới hạn LOL

0

1

2

3

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Nồng độ catechin (mg/l)

Độ

hấp

th

ụ q

uan

g

Hình 3.9: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của catechin

Kết quả ở bảng 3.7 và hình 3.9 cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 1000 mg/l, tại nồng

độ này trở đi thì đồ thị của độ hấp thụ quang theo nồng độ không còn tuyến tính.

Như vậy khoảng tuyến tính của phương pháp xác định theo chất chuẩn catechin là

khoảng từ 3,51 – 1000 mg/l.

3.3.1.5 Độ đúng của phƣơng pháp

Để xác định độ đúng thực hiện với một dung dịch mẫu đối chiếu CO-1 có nồng độ

chính xác 12 mg/l. Sau đó tiến hành phân tích mẫu chuẩn đó lặp lại 6 lần, kết quả được ghi ở

bảng 3.7

Bảng 3.8: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp

STT 1 2 3 4 5 6

12

A510 0,043 0,042 0,044 0,041 0,041 0,042

Hàm lƣợng 12,367 12,000 12,700 11,700 11,700 12,000

Số liệu thống kê m = 12,78; SD = 0,86

Ta có ttn = 2

12 12,78

0,86

6

= 2,22

Tra bảng t(0,95;5) = 2,57 > ttn = 2,22.

Như vậy : tc > ttn : Không có sự khác nhau về kết quả của giá trị trung bình so với giá

trị tham chiếu ở mức ý nghĩa α = 0,95, tức là phương pháp có độ đúng đạt yêu cầu → Phƣơng

pháp không mắc sai số hệ thống.

3.3.1.6 Độ ổn định của phƣơng pháp

Tiến hành đo độ hấp thụ quang của chất CO-1 có nồng độ 12 mg/l và của catechin có

nồng độ 100 mg/l. Sau đó dùng hàm chuẩn studen (t) để đánh giá. Kết quả được thể hiện ở

bảng 3.9

Bảng 3.9 : Kết quả đánh giá độ ổn định của phương pháp theo cách 1

STT 1 2 3 4 5 6

A510 CO-1 0,043 0,042 0,044 0,041 0,041 0,042

Catechin 0,242 0,242 0,243 0,242 0,241 0,243

Ta có : Đối với chất CO-1: 510A

1 = 0,0422 ; S1 = 11,70.10

-4

Đối với chất catechin : 510A2 = 0,2422 ; S2 = 7,54.10

-4

Ta có: Ftn = 2

1

2

2

S

S=

4 2

4 2

(11,70.10 )

(7,54.10 )

= 1,55 > 1 . Ta So sánh Ftn với Fc(0,05 ;5 ;5).

Tra bảng ta có Fc(0,05 ;5 ;5) = 5,0503 > Ftn = 1,55 : Như vậy hai phương sai không có sự khác

nhau có ý nghĩa, hai phương pháp có độ lặp lại tương đồng.

Kết quả định lƣợng flavonoid toàn phần trong nụ và lá vối

Hàm lượng flavonoid toàn phần trong nụ và lá vối được tính theo khối lượng chất

chuẩn catechin (g) và chất đối chiếu CO-1 (g). Được tính trong 1 g khối lượng mẫu dược liệu

khô tuyệt đối. Giá trị kết quả của hàm lượng flavonoid toàn phần được làm lặp lại 3 lần và kết

quả ở bảng 3.12 được biểu diễn : m ± SD

Bảng 3.10 : Kết quả xác định flavonoid toàn phần

STT

Tên mẫu

(nơi thu hái)

mmẫu (g)

Hàm lƣợng

flavonoid toàn phần

tính theo Catechin

(mg/g)

Hàm lƣợng

flavonoid toàn phần

tính theo

CO-1 (mg/g)

Các mẫu lá

13

1 Bắc Giang 1,0028 30,33 ± 1,060 22,42 ± 1,060

2 Bắc Ninh 1,0017 20,73 ± 1,040 15,44 ± 1,040

3 Hà Đông (HN) 1,0028 21,81 ± 1,230 16,23 ± 1,230

4 Hòa Bình 1,0180 29,70 ± 1,320 21,99 ± 1,320

5 Phú Thọ 1,0066 23,74 ± 1,160 17,62 ± 1,160

6 Quảng Ninh 1,0221 22,61 ± 0,840 16,81 ± 0,840

7 Thái Bình 1,0380 22,69 ± 0,840 16,87 ± 0,840

Các mẫu nụ

8 Chợ Đồng Xuân(HN) 1,0020 39,23 ± 1,630 28,91 ± 1,630

9 Hưng Yên 1,0014 42,11 ± 1,630 30,99 ± 1,630

10 Nam Định 1,0032 40,93 ± 2,230 30,13 ± 2,230

11 Hải Dương 1,0045 39,23 ± 2,200 28,88 ± 2,200

12 Hà Đông (HN) 1,0052 34,98 ± 1,620 25,79 ± 1,620

13 Hà Nam 1,0066 38,51 ± 1,160 28,36 ± 1,160

14 Thái Nguyên 1,0013 37,43 ± 1,620 27,57 ± 1,650

Hàm lượng flavonoid toàn phần xác định theo chất chuẩn CO-1: Trong các mẫu lá vối

trong khoảng 15,443 – 22,418 mg/g. Trong nụ vối khoảng từ 25,791 – 30,995 mg/g.

Hàm lượng flavonoid toàn phần xác định theo chất chuẩn catechin: Trong các mẫu lá

vối trong khoảng 20,728 – 30,331 mg/g. Trong nụ vối khoảng từ 34,978 – 42,114 mg/g.

Qua bảng 3.10 nhận thấy hàm lượng flavonoid toàn phần trong nụ vối cao hơn so với

hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá vối.

3.3.2 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid chính bằng HPLC

3.3.2.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống

Để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký, tiến hành pha một mẫu đối chiếu có

nồng độ 0,053 mg/ml, tiến hành sắc ký 6 lần với điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Kết quả khảo

sát tính thích hợp của hệ thống được ghi ở bảng 3.11.

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống

Lần

tiêm

Thời gian lƣu Diện tích pic Các thông số thống kê

1 9,12766 2190950

14

2 9,07053 2186244 SD = 21052

RSD = 0,95 (%) 3 9,18479 2205546

4 9,47704 2245278

5 9,53417 2214240

6 9,41771 2213154

Kết quả trên cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC là phù hợp

và đảm bảo sự ổn định của phép phân tích định lượng CO-1.

3.3.2.2 Khoảng tuyến tính của phƣơng pháp

Chuẩn bị một dãy gồm 5 dung dịch mẫu đối chiếu CO-1 có nồng độ chính xác

khoảng 0,0055 mg/ml đến 0,11 mg/ml rồi tiến hành chạy sắc ký như điều kiện đã mô tả. Kết

quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.15 và đường chuẩn lập được, được thể hiện ở hình

3.12.

Bảng 3.12: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

Dung dịch Nồng độ (mg/ml) Diện tích pic (AU.s)

1 0,11 4575033

2 0,055 2483455

3 0,0275 1138335

4 0,011 529218

5 0,0055 269653

6 0 27465

Sử dụng phần mềm origin 7.5 vẽ đường chuẩn và tính toán

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

Ph­¬ng tr×nh: Y = A + B * X

Th«ng sè Gi¸ trÞ Sai sè

------------------------------------------------------------

A 54599.803 46041.88268

B 4.16056E7 890693.07305

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99908 83327.81606 6 <0.0001

------------------------------------------------------------

DiÖ

n t

Ých P

Ýc

Nång ®é (mg/ml)

Hình 3.10: Đường chuẩn xác định hàm lượng CO-1 trong nụ và lá vối

15

Δa = t(0,95, 4).Sa = 2,131841*46041,883 = 98153,9739

Δb = t(0,95, 4).Sb = 2,131841*890693,073 = 1898815,935

Phương trình hồi quy đầy đủ của đường chuẩn có dạng y = a + b.x có dạng như sau : y

= a + b.x = (a ± Δa) + (b ± Δb).x

yi = (54599,803 ± 98153,9739) + (4,16056x107 ± 1898815,935). CC.01 (1)

3.3.2.3 Độ lặp lại của phương pháp

Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng cách tiến hành 6 thí nghiệm riêng biệt

cho mẫu chứa chất đối chiếu CO-1 có nồng độ 0,042 mg/ml (Bảng 3.13A) và mẫu thực nụ vối

Hưng yên (Bảng 3.13B).

Bảng 3.13A: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu CO-1

Lần tiêm 1 2 3 4 5 6

PICS (AU.s) 1663046 1712229 1725100 1730613 1666705 1727390

Các thông số thống kê SD = 31102; RSD = 1,82(%)

Bảng3.13 B: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu thực

Tên mẫu thử Số mẫu định

lƣợng

Hàm lƣợng tìm

thấy %

Các số liệu thống kê

Nụ vối Hưng Yên 6 1,86 SD = 0,0346 ;

RSD = 1,696%

3.3.2.4 Độ đúng của phƣơng pháp

Thêm vào mẫu thử (nụ vối Hưng Yên) đã được xác định hàm lượng một lượng chính

xác chất chuẩn sao cho tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát.

Hiệu suất thu hồi được tính theo công thức sau :

H(%) = 100%.(Ccó thêm chuẩn - Cnền)/Cchuẩn được thêm vào

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp

Tên mẫu

thử

Số lần

định

lƣợng

Lƣợng

thêm vào

(mg)

Lƣợng tìm

lại đƣợc

trung bình

% tìm lại đƣơc

trung bình

Số liệu thống kê

Mẫu nụ vối

Hưng Yên

6 0,044 0,043 97,73 RSD = 2,16 %

Qua bảng trên cho thấy, phương pháp phân tích định lượng HPLC có khả năng thu hồi

lại cao hơn 90% có thể chấp nhận được. Như vậy phương pháp này có độ đúng cao.

3.3.2.5 Giới hạn của phƣơng pháp

16

Phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ 44 μg/ml, sau đó pha loãng dần đến khi dung dịch

chuẩn không còn xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Tiến hành phân tích theo các điều kiện

đã lựa chọn, ở nồn độ 0,031 μg/ml được coi là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp

(Bảng 3.20) thể hiện qua việc tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N) đạt trong khoảng

2-3.

Ta có S/N = 2H

h=

2.0,6

0,4=3

Hình 3.11: Chiều cao tín hiệu phát hiện LOD

Qua bảng 3.20 và hình 3.12 xác định được giới hạn phát hiện (LOD) của phương

pháp xác định CO-1 là 0,031 μg/ml.

Như vậy suy ra giới hạn định lượng LOQ = 3,3 × LOD = 0,1023 μg/ml.

Xác định giới hạn LOL: Xác định bằng cách nới rộng điểm trên của đường chuẩn cho

đến khi tương quan giữa nồng độ và diện tích píc không còn tuyến tính nữa.

Bảng 3.15: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL

Nồng Độ

(mg/ml)

0,11 0,1375 0,22 0,275 0,367 0,55

Diện tích Píc 4575033 7119423 12105281 14809513 16490167 20791750

Giới hạn LOL

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Nồng độ CO-1 (mg/ml)

Diệ

n t

ích

Píc

Hình 3.12: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL

Từ kết quả (Bảng 3.15 và Hình 3.12) cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 0,275 mg/ml,

tại nồng độ này trở đi trên đồ thị cho thấy diện tích píc và nồng độ không còn tuyến tính. Như

vậy, khoảng nồng độ tuyến tính CO-1 để định lượng cho kết quả tốt nhất được xác định nằm

trong khoảng 0,1-275 μg/ml.

Bảng 3. 16: Kết quả định lượng hoạt chất trong một số mẫu nụ và lá vối

STT Tên mẫu Khối Độ PicS (A

Hàm lƣợng chất CO-1

17

(nơi thu hái) lƣợng

cân (g)

ẩm

(%)

U.s) (mg/g) (%

kl/kl)

Các mẫu nụ vối

1 Chợ Đồng Xuân (HN)

1,0709 12,62 1324731 16,81 ± 0,058 1,68

2 Hưng Yên

1,0007 11,18 1377958 18,61 ± 0,184 1,86

3 Nam Định

1,0113 11,14 1022567 13,45 ± 0,160 1,35

4 Hải Dương

1,0032 7,65 1143549 14,69 ± 0,093 1,47

5 Hà Đông (HN)

1,0057 6,77 1048407 13,24 ± 0,030 1,32

6 Hà Nam

1,0266 8,00 1066353 13,36 ± 0,125 1,34

7 Thái Nguyên

1,0003 7,85 1067456 13,74 ± 0,173 1,37

Các mẫu lá vối

8 Bắc Giang 1,0020 9,30 3447931 4,661 ± 0,058 0,47

9 Bắc Ninh 1,0017 11,50 3158279 4,376 ± 0,053 0,44

10 Hà Đông (HN) 1,0028 11,10 3178280 4,377 ± 0,029 0,44

11 Hòa Bình 1,0180 15,10 3379762 4,792 ± 0,030 0,48

12 Phú Thọ 1,0066 8,70 3449983 4,625 ± 0,045 0,46

13 Quảng Ninh 1,0221 11,50 3312138 4,493 ± 0,023 0,49

14 Thái Bình 1,0380 10,90 3258986 4.327 ± 0,029 0,43

Kết quả định lượng các mẫu thu hái tại một số địa phương ở miền bắc Việt Nam cho

biết hàm lượng CO-1 trong lá vối nằm trong khoảng 0,43 - 0,49%, thấp hơn nhiều so với hàm

lượng trong nụ vối trong khoảng 1,32 – 1,86%. Kết quả nghiên cứu này gợi ý cho việc xây

dựng tiêu chuẩn cho dược liệu nụ và lá vối để kiểm nghiệm chất lượng dược liệu vối sử dụng

cho y học cổ truyền.

18

KẾT LUẬN

1. Đã phân lập được một flavonoid chính (2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone)

trong nụ vối làm chất đối chiếu trong xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid.

Xác định được độ tinh khiết của flavonoid chính bằng HPLC (98,21%).

2. Đã xây dựng được phương pháp định tính flavonoid trong nụ và lá vối bằng các phản ứng

hóa học, sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Đã đưa ra các phản ứng định tính flavonoid trong nụ và lá vối gồm: phản ứng với các

thuốc thử NH3, NaOH, (Mg + HCl), và FeCl3.

Tìm ra được hệ dung môi định tính flavonoid trong sắc ký bản mỏng (TLC) gồm: Hệ

1: n-Hexan : EtOAc : Acid formic = 6:3:0,1 (v:v:v ) và hệ 2: Toluen : EtOAc : Acid formic =

6:4:1 (v:v:v).

Định tính được flavonoid chính bằng HPLC thông qua thời gian lưu (tR = 9,3 phút) và

so sánh với chất đối chiếu CO-1 được tách từ nụ vối.

3. Xây dựng được phương pháp định lượng flavonoid:

a) Bằng phương pháp trắc quang

Xây dựng được phương pháp định lượng flavonoid toàn phần theo chất đối chiếu CO-

1 (được tách từ nụ vối) và theo catechin.

Xác định được khoảng tuyến tính và đường chuẩn xác định lượng flavonoid là ; Giới

hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phép đo nằm trong khoảng LOD = 0,77 mg/l, LOQ

= 2,55 mg/l (theo chất đối chiếu CO-1) và LOD = 1,05 mg/l, LOQ = 3,51 mg/l (theo chất

chuẩn catechin) ; Độ đúng, độ ổn định của phương pháp phù hợp.

Đã xác định được hàm lượng flavonoid toàn phần trong 14 mẫu nụ và lá vối thu hái ở

các tỉnh miền bắc Việt Nam. Kết quả cho biết hàm lượng trong các mẫu nụ là 25,791 – 30,995

mg/g, mẫu lá 15,443 – 22,418 mg/g (tính theo chất đối chiếu CO-1). Tính theo chất chuẩn

catechin : mẫu nụ là 34,978 – 42,114 mg/g, mẫu lá 20,728 – 30,331 mg/g. Kết quả đã đánh

giá được hàm lượng flavonoid trong nụ vối cao hơn trong lá vối có ý nghĩa thống kê.

b) Bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Đưa ra được điều kiện, dung môi phù hợp chạy sắc ký trong việc định lượng flavonoid

chính trong nụ và lá vối

Xác định được khoảng tuyến tính (0,1 – 275 μg/ml) và lập đường chuẩn của

flavonoid.

Xác định được giới hạn phát hiện (LOD = 0,031 μg/ml) và giới hạn định lượng của

phép đo (LOQ = 0,1023 μg/ml) .

Đánh giá được sai số và độ lặp lại của phép đo.

19

Đã xác định được hàm lượng của 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone

trong một số mẫu lá (4,3272 – 4,7924 mg/g) và nụ vối (13,2437 – 18,6095 mg/g) thu hái ở các

tỉnh phía Bắc.

References

I. Tiếng việt

1. Bộ Y tế (2005), Kiểm nghiệm thuốc, NXB Y học, Hà Nội. tr. 72-79.

2. Bộ Y tế (2007), Hóa phân tích II, NXB Y học, Hà Nội. tr.13-20.

3. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung

Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn

Tập, Trần Toàn – Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II

NXB Y học, tr. 1065-1066.

4. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 1330.

5. Dược điển Việt Nam 3, NXB Y học 2004.

6. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc,

NXB Y Học.

7. Đào Thị Thanh Hiền (2000), “Góp phần nghiên cứu cây vối (Cleistocalyx operculatus

(Roxb.) Merr. et Perry Myrtaceae)”, Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Dược học, Trường Đại học

Dược Hà Nội.

8. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Xuân Trung, Nguyễn Văn Ri (2003), Các phương

pháp phân tích công cụ, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội.

9. Trần Hùng (2007), Giáo trình, Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học Y Dược Tp

HCM.

10. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học, Hà Nội, tr. 423.

11. Phạm Luận (2000), Giáo trình, Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, Đại Học Khoa

Học Tự Nhiên-ĐHQGHN

12. Phạm Luận (2004), Cơ sở lý thuyết của phương pháp phân tích phổ hấp thụ quang phân

tử UV-VIS, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên-ĐHQGHN

13. Hoàng Thị Lý (2011), Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu nụ vối, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ,

Trường đại học Dược Hà nội.

14. Trương Thị Tuyết Mai, Nguyễn Thị Lâm, Nguyễn Công Khẩn, Nguyễn Văn Chuyển,

Nagashima Fumie “Tác dụng chống oxy hóa của nụ vối trên ống nghiệm và trên chuột tiểu

đường” Tạp chí Y học dự phòng, 2009, số 5 (104).

20

15. Hoàng Thị Tuyết Nhung (2012), Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế Conessin, Kaempferol,

Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc, Luận án Tiến sỹ -

Trường Đại học Dược Hà Nội.

16. Nguyễn Văn Ri, giáo trình môn học, Các phương pháp tách, Đại học Khoa học Tự Nhiên

- ĐHQGHN

17. Ngô Văn Thu, Bài giảng dược liệu, tập 1, Bộ y tế và Bộ giáo dục Hà Nội.

18. Nguyễn Thị Kim Tuyến, Nguyễn Văn Thanh, Hoàng Văn Lựu, Chu Đình Kính (2010).

“Tách và xác định cấu trúc một số hợp chất từ nụ và hoa cây vối (Cleistocalyx operculatus

(Roxb) Merr. et Perry) ở Nghệ An”. Tạp chí Dược học 405, tr. 44-46.

19. Tạ Thị Thảo, giáo trình môn học, Thống kê trong hóa phân tích, Đại học Khoa học Tự

Nhiên-ĐHQGHN.

20. Trần Quang Vinh (2009), Sự thay đổi hàm lượng flavonoid trong lá của cây chùm ngây

(Moringa oleifera Lam.) theo các giai đoạn phát triển, Luận văn thạc sĩ Trường Đại học hoa

Khọc Tự Nhiên - ĐHQG HCM

21. Viện Dược liệu (2008), Chiết xuất dược liệu, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. tr. 11-

29, 39-49, 66-76.

22. Viện Dược liệu – Sở Y tế tỉnh Nghệ an (2009), Cây thuốc Nghệ an, tr. 606-608.

23. Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà

Nội, tr. 494.

24. Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, Thẩm định phương pháp trong

phân tích hóa học và vi sinh vật, NXB khoa học và kỹ thuật Hà nội.

II. Tiếng anh

25. Arvouet A., B. Vennat, A. Pourrat and Legret (1994), “Sandardisation of an extract of

Propolis and identification of the major compounds”, J. Pharm. Belgg., Vol. 49 pp. 462-468.

26. Brás H. de Oliveira , Tomoe Nakashima ,José D. de Souza Filho and Fabiano L. Frehse

(2001), “HPLC Analysis of Flavonoids in Eupatorium littorale” J. Braz. Chem. Soc., Vol. 12,

No. 2, pp. 243-246.

27. Byung-Sun Min, To Dao Cuong, Joo-Sang Lee, Beom-Soo Shin, Mi Hee Woo, Tran

Manh Hung (2010), “Cholinesterase Inhibitors from Cleistocalyx operculatus Buds”, Archives

of Pharmacal Research 33(10), pp. 1665-1670.

28. Byung Sun Min, To Dao Cuong, Joo-Sang Lee, Mi Hee Woo, and Tran Manh Hung

(2010), “Flavonoids from Cleistocalyx operculatus Buds and their Cytotoxic Activity” Bull.

Korean Chem. Soc., Vol.31, No.8. pp. 2392-2394

21

29. Chun-Lin Ye ,Jian-Wen Liu , Dong-Zhi Wei Yan-Hua Lu , Feng Qian (2005), “In vivo

antitumor activity by 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone in a solid human

carcinoma xenograft model”, Cancer Chemotherapy and Pharmacology 56(1), pp. 70-74.

30. Chun-Lin Ye, Jian-Wen Liu, Dong-Zhi Wei, Yan-Hua Lu, Feng Qian (2004), “In vitro

anti-tumor activity of 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone against six

established human cancer cell lines”, Pharmacological Research 50(5), pp. 505-510.

31. Chun-Lin Ye, Yan-Hua Lu, Dong-Zhi Wei (2004), “Flavonoids from Cleistocalyx

operculatus”, Phytochemistry 65(4), pp. 445–447

32. C-L Ye, Y-H Lu, X-D Li, D-Z Wei (2005), “HPLC analysis of a bioactive Chalcone and

tritecpence in the buds of Cleistocalys operculatus” South African Journal of Botany, 71

(3&4) pp. 312-315.

33. Dao Trong Tuan et al. (2010), “C-Methylated flavonoids from Cleistocalyx operculatus

and their inhibitory effects on novel influenza A (H1N1) neuraminidase”. Journal of Natural

Products 73, pp. 1636-1642.

34. Elisabetta Campeol, Serena Catalano, Roberto Cremon Ini and Ivano Morell (2000),

“Flavonoids analysis of Vicia species of Narbonensis complex: V. kalakhensis Khatt. Maxt &

Bisby and V.eristalioides Maxt” Caryologia Vol. 53, No.1, pp. 63-68.

35. Feng Quian, Chun-Lin Ye, Dong-Zhi Wei, Yan-Hua Lu, Song-Lin Yang (2005), “In vitro

and in vivo reversal of cancer cell multidrug resistance by 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-

dimethylchalcone”, Journal of Chemotherapy 17(3), pp. 309-314.

36. Han-Yao Huang, Jian-Lei Niu, Yan-Hua Lu (2012), “Multidrug resistance reversal effect

of DMC derived from buds of Cleistocalyx operculatus in human hepatocellular tumor

xenograft model”, Journal of the science of food and agriculture 92(1), pp. 135-140.

37. James M. Harnly, Robert F. Doherty, Gary R. Beecher, Oanne M.Holden, David B.

Haytowitz, Seema Bhagwat, and Susan Gebhardt,(2006), “Flavonoid Content of U.S. Fruits,

Vegetables, and Nuts” J. Agric. Food Chem. 54, pp. 9966−9977.

38. Lui Alberto Lira Soares, Valquíria Link Bassani, George González Ortega & Pedro Ros

Petrovick (2003), “Total Flavonoid Determination for the Quality Control of Aqueous

Extractives from Phyllanthus niruri L.” Lat. Am. J. Pharm. 22 (3), pp. 203-207.

39. L.-Tao, Z-T.Wang, E.-Y.Zhu, Y.-H.Lu, D.-Z.Wei (2006), “HPLC analysis of bioactive

flavonoids from the rhizome of Alipinia officinarum” South African Journal of Botany 72

(2006), pp. 163-166.

22

40. Marica Medić-Šarić, Ivona Jasprica, Asja Smolčić-Bubalo and Ana Mornar (2004),

“Optimization of chromatographic conditions in thin layer chromatography of flavonoids and

phenolic acids” Croat. Chem. Acta 77(1-2), pp. 361-366.

41. Mudasir Sultana, Pawan Kumar Verma, Rajinder Raina, Shahid Prawez & M A Dar

“Quantitative Analysis of Total Phenolic, flavonoids and Tannin Contents in Acetone and n-

hexane Extracts of Ageratum conyzoides” International Journal of ChemTech Research

CODEN( USA): IJCRGG ISSN : 0974-4290 Vol. 4, No.3, pp. 996-999

42. Nguyen Thi Dung , Jung Min Kim, Sun Chul Kang (2008), “Chemical composition,

antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil and the ethanol extract of

Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry buds”, Food and Chemical Toxicology 46,

pp. 3632–3639.

43. Tevini, M., Iwanzik, W., Teramura, A.H. (1983), “Effects of UV-B radiation on plants

during mild water stress-II. Effects on growth, protein and flavonoid contcent”, Z.

Pflanzenphysiol. 110, pp. 459-467.

44. T. Sathishkumar, Baskar.R, Shanmugam.S, Rajasekaran.P, Sadasivam.S and

Manikandan.V “Optimization of flavonoids extraction from the leaves of Tabernaemontana

heyneana Wall. using L16 Orthogonal design” Nature and Science, 6(3), 2008, ISSN: 1545-

0740

45. Truong Tuyet Mai, Nguyen Van Chuyen (2007), “Anti-hyperglycemic activity of an

aqueous extract from flower buds of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry”,

Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 71(1), pp. 69-76.

46. Truong Tuyet Mai, Nghiem Nguyet Thu, Pham Gia Tien, Nguyen Van Chuyen (2007),

“Alpha-Glucosidase inhibitory and antioxidant activities of Vietnamese edible plants and their

relationship with polyphenol contents”, Journal of Nutritional Science and Vitaminology

53(3), pp. 267-276.

47. Waksmundzka H. M., Sherma J., Kowalska T. (2008), “Thin layer Chromatography in

Phytochemistry”, CRC Press, Florida. pp. 3-15.