Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics

7/23/2019 Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics

http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-xac-dinh-dinh-tinh-dinh-luong-bifidobacterium 1/112

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRỊNH THỊ PHƢƠNG DUNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH (ĐỊNHTÍNH, ĐỊNH LƢỢNG) BIFIDOBACTERIUM

LONGUM TRONG CÁC CHẾ PHẨMPROBIOTICS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2014



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRỊNH THỊ PHƢƠNG DUNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH (ĐỊNH

TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG) BIFIDOBACTERIUM

LONGUM TRONG CÁC CHẾ PHẨM

PROBIOTICS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ 60 72 04 10

Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Việt Hùng

HÀ NỘI 2014



LỜI C ẢM ƠN

Luận văn này được hoàn thành tại khoa Vi Sinh – Viện Kiểm nghiệm Thuốc

Trung Ương – Bộ Y tế. Để có được bản luận văn tốt nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng

biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần Việt Hùng, người thầy đã trực tiếp hướng

dẫn, dìu dắt tôi trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu này.

Xin chân thành cám ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau

đại học, Bộ môn Kiểm Nghiệm Thuốc và Độc chất và các Bộ môn khác của trườngĐại Học Dược Hà Nội đã giúp tôi trang bị tri thức, tạo môi trường, điều kiện thuận

lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình hoàn

thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đoàn Cao Sơn – Viện trưởng Viện kiểm

Nghiệm Thuốc Trung Ương, Ban Giám Đốc Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung

Ương, các đồng nghiệp trong khoa và Th s. Khổng Thị Minh Huệ đã hỗ trợ, giúp đỡđể tôi hoàn thành tốt luận văn thạc sĩ và hoàn thành khóa học theo đúng thời hạn.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã luôn ở bên

tôi động viên, chia sẻ, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua

Hà Nội 27 tháng 8 năm 2014

Dược sỹ Trịnh Thị Phương Dung



MỤC LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................ 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTICS ............................................................... 3

1.1.1. Định nghĩa ................................................................................................ 3

1.1.2. Ứng dụng của probiotics trong ngành Dược ............................................ 3

1.1.3. Các vi sinh vật thường được sử dụng trong chế phẩm probiotics............ 4

1.1.4. Tổng quan về tiêu chuẩn chất lượng probiotics ....................................... 4

1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI BIFIDOBACTERIUM .......................................... 6

1.2.1. Đặc điểm chung của chi Bifidobacterium [30], [33],............................... 6

1.2.2. Bifidobacteria với vai trò là probiotics. ................................................... 6

1.3. TỔNG QUAN VỀ B. LONGUM .................................................................. 7

1.3.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................... 7

1.3.2. Khả năng chuyển hóa carbohydrat [31]. .................................................. 8

1.3.3. Cấu trúc gen cuả B. longum [24] .............................................................. 8

1.3.4. Vai trò của B. longum [9], [11], [24], [26] , [15], [33], [35]. ................... 9

1.3.5. Phương pháp kiểm nghiệm B. longum trong chế phẩm probiotics ........ 10

1.3.6. Tình hình nghiên cứu định tính và định lượng B. longum trong các chế phẩm probiotics trong những năm gần đây ........................................... 17

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊPHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 20

2.1. PHƢƠNG TIỆN DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU .................................. 20

2.1.1. Môi trường, hoá chất, dung môi, thiết bị ............................................... 20

2.1.1.1. Môi trường ...................................................................................... 20

2.1.1.2. Hoá chất, dung môi ......................................................................... 22

2.1.1.3. Thiết bị, dụng cụ ............................................................................. 23

2.1.2. Phần mềm xử lý kết quả: Apiweb của hãng BioMérieux. ...................... 24

2.1.3. Chủng vi sinh vật chuẩn ......................................................................... 24

2.2. ĐỐI TƢỢ NG NGHIÊN CỨ U .................................................................... 25



2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U .............................................................. 26

2.3.1. Phương pháp định lượng B. longum trong chế phẩm ............................ 26

2.3.2. Phương pháp định danh vi sinh vật bằng kit API 20A .......................... 27

2.3.2.1. Nguyên tắc chung ............................................................................ 27

2.3.2.2. Tiến hành ......................................................................................... 28

2.3.3. Định danh đến loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự ......................... 31

2.3.3.1. Sơ đồ chung định tính B. longum trong các chế phẩm probiotics bằng k ỹ thuật PCR và giải trình tự ................................................. 31

2.3.3.2. Tách DNA vi khuẩn bằng WizardR Genomic DNA Purification Kit ......................................................................................................... 32

2.3.3.3. Định lượng DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng tửngoại ở bước sóng 260 nm (A260) ................................................... 33

2.3.3.4. Nghiên cứu, thiết kế mồi đặc hiệu ................................................ 33

2.3.3.5. Kiểm tra khả năng tách DNA .......................................................... 34

2.3.3.6. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng nghiên cứu bằng kỹthuật PCR ........................................................................................ 35

2.3.3.7. Nhân dòng và giải trình tự .............................................................. 36

2.3.4. Thẩm định quy trình đã xây dựng .......................................................... 39

2.3.4.1. Thẩm định phương pháp định lượng B. longum ............................. 39

2.3.4.2. Thẩm định qui trình định danh bằng kit API 20A .......................... 41

2.3.4.3. Thẩm định qui trình định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 41

2.3.5. Ứng dụng quy trình chuẩn để định lượng và định tính B. longum trongcác chế phẩm probiotics đang lưu hành trên thị trường ........................ 44

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 45

3.1. XÁC ĐỊNH SỐ LƢỢNG VI SINH VẬT TRONG CHẾ PHẨMPROBIOTICS ............................................................................................. 45

3.2. ĐỊNH DANH VI SINH VẬT BẰNG KIT API 20A ................................. 46

3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT TRONG CÁC MẪU BẰNGKỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ................................................. 51

3.3.1. Kết quả tách DNA .................................................................................. 51

3.3.1.1 Tách DNA bằng WizardR Genomic DNA Purification kit của hãngPromega .......................................................................................... 51

3.3.1.2. Kiểm tra khả năng tách DNA .......................................................... 51

3.3.2. Nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng vi sinh vật thuộc đối

tượng nghiên cứu ................................................................................... 52



3.3.3. Nhân dòng và giải trình tự ..................................................................... 55

3.3.3.1.Tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các visinh vật phân lập từ các mẫu nghiên cứu bằng bộ kit Fermentas ... 55

3.3.3.2. Nhân dòng các đoạn gen đặc hiệu vào vector nhân dòng và biến nạpvào tế bào E. coli chủng DH5α ....................................................... 56

3.3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu trong plasmid tái tổhợp .................................................................................................. 57

3.3.3.4. Giải trình tự mẫu chứa phân đoạn 831 bp ....................................... 60

3.4. ĐÁNH GIÁ PHƢƠNG PHÁP .................................................................... 62

3.4.1. Kết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trường định lượng BSM agar . 62

3.4.2. Độ lặp lại của phép định lượng .............................................................. 63

3.4.3. Thẩm định độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng kit API20A ........................................................................................................ 64

3.4.4. Đánh giá độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng kỹ thuậtPCR ........................................................................................................ 65

3.4.5. Xác định ngưỡng phát hiện của quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệucủa B. longum bằng cặp mồi đặc hiệu. .................................................. 68

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN .................................................................................. 71

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 74

PHỤ LỤC



CÁC CHỮ VIẾT TẮT AA: Acid acetic

AL: Acid lactic

ATCC: American Type Culture Collection

B. longum: Bifidobacterium longum

dATP: Deoxy adenosine Triphosphat

dCTP: Deoxy cytosineTriphosphat

dGTP: Deoxy guanine Triphosphat

DNA: Deoxyribo nucleic acid

dNTP: Deoxy nucleic TriphosphatdTTP: Deoxy thymin Triphosphat

E. coli : Escherichia coli

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

FISH: fluorescence in situ hydridization

JCM: Japan Colletion of Microorganisms

LAB: Lactic acid bacteria

LB Luria Bertani

PCR: Polymerase Chain Reaction

rRNA: Ribosome Ribonucleic acid

VSV: Vi sinh vật



DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Mồi đặc hiệu 22Bảng 2.2 Hóa chất, dung môi 22

Bảng 2.3 Các vi sinh vật chuẩn đượ c sử dụng 24

Bảng 2.4 Cách đọc k ết quả kit Api 20A 30

Bảng 2.5 Trình tự các cặ p mồi dùng cho phản ứng PCR 34

Bảng 2.6 Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra DNA mớ i tách 35

Bảng 2.7 Thành phần của phản ứng PCR đơn mồi 36

Bảng 2.8 Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector 38

Bảng 2.9 Các chủng chuẩn kiểm tra tính chọn lọc của môi trườ ng BSM

agar

40

Bảng 2.10 Công thức tính độ đặc hiệu 42

Bảng 2.11 Tiêu chuẩn đánh giá chất lượ ng của sản phẩm PCR 43

Bảng 3.1 Số lượ ng vi sinh vật trong chế phẩm 45

Bảng 3.2 Theo dõi phản ứng định danh vi sinh vật bằng kit API 20A 48Bảng 3.3 K ết quả định danh vi sinh vật bằng phần mềm Apiweb 50

Bảng 3.4 K ết quả đo quang các dung dịch DNA mớ i tách 51

Bảng 3.5 Thành phần của phản ứng PCR 53

Bảng 3.6 K ết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trườ ng BSM agar 62

Bảng 3.7 K ết quả đếm số lượ ng vi khuẩn trong mẫu A 64

Bảng 3.8 K ết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặ p mồi BlonF/BlonR trên

20 chủng

66

Bảng 3.9 K ết quả đếm số lượ ng vi khuẩn B. longum 68

Bảng 3.10 K ết quả xác định ngưỡ ng phát hiện 69



DANH MỤC HÌNHTrang

Hình 1.1 Hình ảnh B. longum trên kính hiển vi điện tử 8

Hình 1.2 Hình ảnh genom B. longum 8

Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase 14

Hình 1.4 Hình minh họa k ỹ thuật PCR 14

Hình 2.1 Sơ đồ định tính B. longum bằng k ỹ thuật PCR và giải trình tự 31

Hình 3.1 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu A bằng kit API 20A 46

Hình 3.2 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu B bằng kit API 20A 46Hình 3.3 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu C bằng kit API 20A 47

Hình 3.4 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu D bằng kit API 20A 47

Hình 3.5 Định danh vi sinh vật trong trong mẫu E bằng kit API 20A 47

Hình 3.6 Quan sát giếng ESC dưới đèn UV ở bướ c sóng 365nm 48

Hình 3.7 K ết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen 16S rDNA

bằng cặ p mồi ID16R08F và IDL16R09R

52

Hình 3.8 K ết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu

của B. longum bằng cặ p mồi BlonF/BlonR

54

Hình 3.9 K ết quả điện di mẫu tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các

đoạn gen đặc hiệu phân lậ p từ các mẫu nghiên cứu trên gel

agarose 1%

55

Hình 3.10 Sơ đồ vector nhân dòng pGEMT-eseay 56

Hình 3.11 K ết quả biến nạ p sản phẩm gắn vào vi khuẩn E. Coli DH5α. và

cấy tr ải trên môi trườ ng nuôi cấy có bổ sung ampicillin

100µg/ml

57

Hình 3.12 K ết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợ p

mang các đoạn gen có kích thướ c 831bp

58

Hình 3.13 K ết quả điện di sản phẩm cắt giớ i hạn vector tái tổ hợ p mang

các phân đoạn 831 bp bằng enzym EcoRI

59



Hình 3.14 Hình thái khuẩn lạc B. longum trên môi trườ ng BSM agar 63

Hình 3.15 Định danh B. longum JCM 1217 bằng kit Api 20A 65

Hình 3.16 K ết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ đặc hiệu của cặ p

mồi nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum

67

Hình 3.17 K ết quả điện di sản phẩm PCR xác định ngưỡ ng phát hiện của

quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum

70



1

ĐẶT V ẤN ĐỀ

Vi khuẩn lactic (LAB) có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta.Chúng tạo ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng. Từ

đầu thế kỷ 20, Elie Metchnikoff (1845-1916) đã đề xuất sử dụng các LAB cho mục

đích chữa bệnh. Từ đó, lĩnh vực nghiên cứu probiotics ngày càng được quan tâm và

phát triển. Đến nay, những nghiên cứu về probiotics đã không ngừng cung cấp

những bằng chứng có tính khoa học về hiệu quả thực sự của probiotics đối với sức

khỏe con người. Bên cạnh đó, các sản phẩm chức năng sử dụng các vi khuẩn

probiotics xuất hiện ngày càng nhiều ở Châu Âu, Nhật, Mỹ… Năm 2008, doanh thutừ các chế phẩm này là 15,9 tỉ USD trên toàn cầu [10].

Probiotics bắt nguồn từ ngôn ngữ Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống (for life).

Năm 2002 tổ chức Nông Lương Liên hiệp quốc và tổ chức Y tế thế giới nêu rõ:

“ probiotics là những vi sinh vật sống mà khi sử dụng với một lượng thích hợp, sẽ

tạo nên những hiệu quả tốt đối với sức khỏe của cơ thể chủ” [32]. Các probiotics

thường có trong các chế phẩm là vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) trong đó bao gồm

chi Lactobacillus và chi Bifidobacterium, vi khuẩn sinh bào tử Bacillus, nấm

Saccharomyces cerevisiae…

Theo Robin Temmerman (2001) trong số 55 mẫu khảo sát chỉ có khoảng 20%

chế phẩm có chứa vi khuẩn đúng như trên nhãn, 16% chế phẩm không chứa một

trong các chủng probiotics được liệt kê trên nhãn [28]. Mặt khác số lượng vi sinh

vật trong các chế phẩm probiotics giảm nhiều trong thời gian bảo quản. Như vậy,

việc định tính, định lượng các loài vi khuẩn probiotics trong các chế phẩm là rấtquan trọng, đảm bảo chất lượng của chế phẩm, mang lại hiệu quả cho người dùng.

Thị trường thuốc Việt Nam hiện có hàng trăm chế phẩm probiotics dưới dạng

thuốc và thực phẩm chức năng, trong đó có rất nhiều chế phẩm có chứa

Bifidobacterium longum ( B. longum là một vi khuẩn thuộc nhóm LAB) dưới dạng

đơn hoặc đa thành phần. Mặc dù trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu

để định tính và định lượng B. longum trong các chế phẩm đa thành phần, tuy nhiên

ở Việt Nam việc kiểm soát chất lượng của các chế phẩm probiotics còn đang bỏ



2

ngỏ. Cụ thể là Việt Nam chưa có một tài liệu chính thức nào hướng dẫn kiểm soát

chất lượng các chế phẩm probiotics bao gồm cả các chế phẩm chứa B. longum. Đa

số các tiêu chuẩn cơ sở của các thuốc và thực phẩm chức năng trong nước cũng như

nhập khẩu chưa định lượng riêng cũng như chưa định tính được B. longum trong

các chế phẩm có chứa hỗn hợp nhiều vi sinh vật.

Xuất phát từ nhu cầu thực tế và tính cấp thiết về yêu cầu kiểm tra chất lượng

của các chế phẩm probiotics, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình xác

định (định tính, định lượng) Bifidobacterium longum trong các chế phẩm

probiotics” với các mục tiêu:

- Xây dựng quy trình chuẩn định tính, định lượng B. longum trong các chế phẩm đa thành phần.

- Ứng dụng quy trình đã thiết lập để khảo sát chất lượng của một số chế

phẩm probiotics có chứa B. longum đang lưu hành trên thị trường.



3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTICS1.1.1. Định nghĩa

Hàng ngàn năm trước đây, con người đã biết sử dụng các chế phẩm sữa lên

men với mục đích tăng cường sức khỏe. Tuy nhiên, phải đến đầu thế kỷ 19 nhà

khoa học người Nga Elie Metchnikoff mớ i thực sự nghiên cứu về vấn đề này. Từ đó

đến nay, lĩnh vực nghiên cứu về probiotics ngày càng đượ c quan tâm và phát triển.

Có r ất nhiều định nghĩa khác nhau về probiotics, tuy nhiên định nghĩa của tổ chức

Nông Lương Liên hiệp quốc và tổ chức Y tế thế giới năm 2002 là được sử dụng

rộng rãi phổ biến nhất: “ probiotics là những vi sinh vật sống mà khi sử dụng với

một lượng thích hợp, sẽ tạo nên những hiệu quả tốt đối với sức khỏe của cơ thể

chủ” [32].

1.1.2. Ứ ng dụng của probiotics trong ngành Dƣợ c

Probiotics có các tác dụng sau:

- Tiêu diệt hoặc kìm hãm sự phát triển của các vi sinh vật có hại bằng cách

tiết ra các chất giống kháng sinh như acidolin, lactocidin và acidophilin.

- Sinh ra các vitamin bao gồm niacin, acid folic, biotin, vitamin B6...

- Hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa, điều chỉnh nồng độ enzym.

- Giảm pH bằng cách sinh ra acid lactic, hydrogen peroxyd... do đó ức chế sự

phát triển của các vi sinh vật và nấm có hại.

- Giải độc và bảo vệ niêm mạc ruột: Lactobacillus có khả năng liên kết với

các chất độc như kim loại nặng, tế bào ung thư, các vi sinh vật này sẽ chết

cùng với chất độc và được loại trừ ra khỏi cơ thể cùng với chất độc dưới

dạng chất thải rắn.

- Giảm nồng độ cholesterol.

- Hỗ trợ hấp thu các khoáng chất, đặc biệt là calci do tác dụng làm giảm pH

ruột của chúng.

- Giảm nguy cơ bị ung thư, khối u [3], [6].



4

Với những tác dụng trên, Probiotics được sử dụng với mục đích chính là làm

cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột trong hoặc sau khi điều trị bằng kháng sinh do

kháng sinh đã làm thay đổi hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa, giảm số lượng v i

sinh vật có lợi và thường gây ỉa chảy, rối loạn tiêu hóa [34]. Ngoài ra, Probiotics

còn được sử dụng để điều trị viêm đường tiêu hóa thường gặp ở trẻ sơ sinh do bị

nhiễm Rota virus, điều trị tiêu chảy, ung thư ruột kết, đau dạ dày do nhiễm

Helicobacteria pylori, bệnh về dị ứng, ngăn cản nhiễm trùng âm đạo do Candida

albicans...[3], [6].

1.1.3. Các vi sinh vật thƣờng đƣợ c sử dụng trong chế phẩm probiotics

Nếu trướ c kia sự lựa chọn vi sinh vật cho chế phẩm Probiotics dùng làm thuốc

chủ yếu dựa trên kinh nghiệm thì hiện nay, các nhà khoa học đã đưa ra những tiêu

chí r ất rõ ràng, đó là:

- Có khả năng chịu được pH thấp ở dạ dày và acid mật ở ruột non

- Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa

- K hông gây bệnh, không sinh độc tố

- Có khả năng sống và cư trú trong ruột.

Bốn nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotics là

Lactobacillus, Bifidobacterium, Saccharomyces, Enterococcus. Ngoài ra, còn một

số nhóm vi sinh vật khác được sử dụng như Bacillus, Streptococcus… [3], [6], [29].

1.1.4. Tổng quan về tiêu chuẩn chất lƣợ ng probiotics

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều hướng dẫn xây dựng tiêu chuẩn chất lượng

của probiotics. Theo khuyến cáo của FAO (2002), tiêu chuẩn chất lượng của các

pro biotics bao gồm các chỉ tiêu [32]:

- Định danh vi sinh vật: yêu cầu phải định danh đến loài bao gồm cả kiểu

hình và kiểu gen

- Các thử nghiệm in vitro về hoạt tính của probiotics: kháng kháng sinh,

kháng dịch vị, kháng muối mật

- Các bằng chứng về sự an toàn

- Thử in vivo trên động vật và trên người



5

- Các yêu cầu về nhãn sản phẩm

Năm 2009, Bộ y tế Canada cũng ban hành chuyên mục về probiotics, trong đó

cũng yêu cầu định danh vi sinh vật đến loài bao gồm cả kiểu hình và kiểu gen [10].

Đến năm 2011, Bộ sức khỏe và gia đình cùng với Bộ Công nghệ sinh học của

Ấn Độ đã ban hành hướng dẫn đánh giá chất lượng probiotics khá đầy đủ bao gồm

9 chỉ tiêu [16]:

- Định danh vi sinh vật: yêu cầu phải định danh đến loài bao gồm cả kiểu

hình và kiểu gen. Trong đó chỉ ra kỹ thuật PCR là kỹ thuật sinh học phân tử

để định danh vi sinh vật.

- Các thử nghiệm in vitro về hoạt tính của probiotics: kháng kháng sinh,kháng dịch vị, kháng muối mật

- Các bằng chứng về sự an toàn trên động vật

- Các thử nghiệm về tác dụng của probiotics trên động vật

- Các bằng chứng về sự an toàn trên người

- Thử tác dụng trên người

- Các yêu cầu về nhãn sản phẩm

- Các thử nghiệm xác định liều

- Yêu cầu ghi nhãn

- Yêu cầu trong sản xuất và thủ tục đăng ký

Hiện nay Việt Nam chưa có văn bản chính thức nào về việc đánh giá chất

lượng của các chế phẩm probiotics. Chỉ có duy nhất TCVN 7849:2008 đưa ra

phương pháp đếm L. acidophilus trong sữa và các chế phẩm sữa trên môi trường

đặc hiệu [5]. Việc kiểm soát chất lượng mới chỉ dừng lại ở xác định số lượng vi sinh

vật, định tính dựa trên kiểu hình, độ nhiễm khuẩn và các chỉ tiêu về dạng bào chế

theo tiêu chuẩn nhà sản xuất. Trong rất nhiều trường hợp, tiêu chuẩn chất lượng còn

rất sơ sài, đặc biệt chưa định danh được tất cả các vi sinh vật trong chế phẩm.



6

1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI BIFIDOBACTERIUM

1.2.1. Đặc điểm chung của chi Bifidobacterium [30], [33],

Các vi khuẩn thuộc chi Bifidobacterium trước đây thường được gọi là Lactobacillus bifidus và được phân loại thành 29 loài khác nhau. Ngày nay, người

ta đã phát hiện ra hơn 33 loài thuộc chi Bifidobacterium, trong số đó có khoảng 12

loài có mặt ở đường tiêu hóa của người.

Bifidobacteria là các trực khuẩn gram dương, kị khí bắt buộc. Chúng thuộc

loại vi khuẩn lên men không đồng nhất, không di động và không hình thành bào tử.

Bifidobacter ia cho phản ứng catalase âm tính, phản ứng indol âm tính và phản ứng

fructose – 6-phosphate phosphoketolase dương tính. Chúng phát triển ở khoảng nhiệt

độ thích hợp từ 37-41oC, không phát triển ở nhiệt độ dưới 20oC và trên 46oC, Tuy

nhiên, có một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ trên 46oC như B.

thermacidophilum. Khoảng pH tối ưu cho sự phát triển của Bifidobacteria là 6,5-

7,0. Bifidobacteria không phát triển được ở pH dưới 4,5 và trên 8,5 ngoại trừ B.

thermacidophilum có thể phát triển được ở pH 4,0.

Các vi khuẩn Bifidobacterium là những vi sinh vật quan trọng trong hệ đường

ruột của người và chiếm 3,5 đến 10% hệ sinh vật ở ruột kết. Chúng chiếm ưu thế ở

trong phân của trẻ bú mẹ, còn trong phân của trẻ bú bình chúng chiếm khoảng 40%

hệ vi sinh vật. Chúng là một trong năm loài chiếm ưu thế trong hệ thống đường tiêu

hóa của người, ngoài ra còn được tìm thấy ở âm đạo và khoang miệng . Ngoài ra

Bifidobacteria cũng được tìm thấy trong hệ thống đường tiêu hóa của nhiều động

vật như bò cái, cừu, lợn, gà, thỏ, chuột và ong mật.

1.2.2. Bifidobacteria vớ i vai trò là probiotics.

Bifidobacteria là những probitics phổ biến và là một phần quan trọng của hệ vi

khuẩn trong đường tiêu hóa. Chúng thuộc nhóm vi khuẩn sinh acid lactic (LAB), có

khả năng tổng hợp amino acid (acid glutamic và acid aspartic), sản xuất một số

vitamin như riboflavin, thiamin, vitamin B2, vitamin B6 và biotin.



7

Ngoài ra Bifidobacteria còn có khả năng sản xuất bacteriocin (hóa chất kháng

khuẩn) và các chất giống kháng sinh do đó chúng rất có lợi đối với hệ thống tiêu

hóa và miễn dịch [33].

Tuy nhiên, k hông giống như các vi khuẩn Lactobacillus, các vi khuẩn

Bifidobacterium còn sản sinh ra acid acetic, là acid béo chuỗi ngắn. Acid acetic hạn

chế nấm phát triển hiệu quả hơn acid lactic và nó cũng được xem là nguồn năng

lượng cho cơ thể. Do tạo ra đồng thời acid acetic và acid lactic cũng như một số

chất có ích khác nên các vi khuẩn Bifidobacterium rất cần thiết cho đường âm đạo

và đường niệu sinh dục, nơi mà nấm và các vi khuẩn cơ hội có thể gây bệnh, cũng

như trong hệ tiêu hóa [36].Một số lợi khuẩn Bifidobacterium có tác dụng tốt đối với cơ thể người do

chúng có thể làm thay đổi hệ miễn dịch. Trong một số trường hợp chúng giúp tăng

cường hệ miễn dịch cũng như có tác động chống viêm .

Một số Bifidobacteria hay được dùng trong các chế phẩm thuốc, thực phẩm

chức năng với vai trò là probiotics là Bifidobacterium longum, Bifidobacterium

infantis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium breve…

1.3. TỔNG QUAN VỀ B. LONGUM

1.3.1. Đặc điểm hình thái

B. longum thuộc nhóm vi sinh vật sinh acid lactic và thuộc chi

Bifidobacterium.

B. longum là vi khuẩn Gram dương, hình que phân nhánh, kỵ khí bắt buộc,

không di động, không sinh bào tử và cho phản ứng catalase âm tính. B. longum tăng

trưởng tối ưu ở 38 - 39°C, tối thiểu ở 19-20°C, tối đa ở 44,5-45°C. B. longum tăng

trưởng tối ưu ở pH 7-8, không tăng trưởng ở pH 5,0 hoặc 9,5 [12].



8

Hình 1.1. Hình ảnh B. l ongum trên kính hiển vi điện tử 1.3.2. Khả năng chuyển hóa carbohydrat [31].

B. longum có khả năng lên men các đường: arabinose, xylose, glucose,

fructose, mannose, galactose, maltose, sucrose, lactose, melibiose, raffinose. Sản

phẩm cuối cùng của quá trình lên men đường là acid lactic (AL) và acid acetic

(AA), với tỷ lệ từ 1,0 (AL): 1,7 (AA) đến 1,0 (AL): 2.0 (AA).

B. longum không lên men các đường: rhamnose, melezitose, cellobiose,

trehalose, dextrin, tinh bột, inulin, sorbitol, manitol, glycerol, salicin, gluconate và

lactate.

1.3.3. Cấu trúc gen cuả B. longum [24]

Nhiễm sắc thể của B. longum có chiều dài khoảng 2,26 Mb, tỷ lệ Guanine -

Cytosine là 65%.

Hình 1.2. Hình ảnh genom B. longum



9

Trong đó:

A: Kích thước gen biểu diễn trên thang Mb

B: Chuỗi mã hóa: gồm 2 sợi bổ sung, các mũi tên chỉ phần chuyển tiếp GC

C: Thang G-C

D: Cấu tạo nguyên vẹn genom của B. longum.Vùng hình tròn biểu diễn các

rARN operon, hình vuông là vùng gen của prophage, tam giác biểu diễn vị

trí của 3 vùng gen giống nhau của B. longum, hình chữ nhật là vùng gen

plasmid tích hợp.

1.3.4. Vai trò của B. longum [9], [11], [24], [26] , [15], [33], [35]. B. longum là một loại vi khuẩn rất cần thiết với cơ thể con người, thường gặp

ở ruột và âm đạo do nó có vai trò quan trọng trong việc giữ cho hệ tiêu hóa và hệ

miễn dịch con người khỏe mạnh. B. longum đặc biệt quan trọng đối với trẻ sơ sinh

do nó giúp tăng cường hệ miễn dịch của trẻ sơ sinh. B. longum có nhiều ở trong hệ

tiêu hóa của trẻ sơ sinh và chiếm ưu thế hơn ở trẻ bú mẹ so với trẻ bú bình. Một

điều dễ thấy là trẻ bú mẹ ít bị tiêu chảy và dị ứng hơn so với trẻ bú bình. Ở người

lớn, B. longum giữ cho hệ thống miễn dịch khỏe mạnh, hỗ trợ cân bằng vi khuẩn

đường ruột và có thể ngăn ngừa ung thư như ung thư ruột kết. B. longum sản sinh

acid lactic, do vậy làm giảm nguy cơ viêm âm đạo.

Một nghiên cứu liên quan đến giảm cân, béo phì và táo bón chỉ ra rằng những

người sử dụng B. longum đạt được kết quả giảm cân và cải thiện táo bón tốt hơn so

với những người dùng thuốc nhuận tràng [11].

Một nghiên cứu khác hiện được thực hiện tại Nhật Bản nhằm xác định liệu B.

longum có thể được sử dụng như là vector chuyển gen để điều trị ung thư hay

không. Tiến hành thực nghiệm trên chuột cho thấy B. longum có thể xâm nhập vào

khối u và tích lũy trong khối u. Đây là một nghiên cứu rất tích cực và hy vọng nó sẽ

giúp cho các nhà nghiên cứu tìm ra cách mới để đưa thuốc trực tiếp vào khối u [ 15].

Do có vai trò rất quan trọng đối với sức khỏe con người nên B. longum được

sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm thuốc, thực phẩm chức năng, sữa...



10

1.3.5. Phƣơng pháp kiểm nghiệm B. longum trong chế phẩm probiotics

1.3.5.1. Phương pháp định lượng vi sinh vật trong chế phẩm [14], [19], [21].

a. Phương pháp đếm trên đĩa thạch

Phương pháp đếm trên đĩa thạch được sử dụng nhiều nhất để định lượng B.

longum trong chế phẩm Probiotics do có độ chính xác cao, đơn giản, dễ thực hiện ở

quy mô phòng thí nghiệm, đồng thời có thể định lượng riêng được B. longum trong

hỗn hợp. Vi sinh vật trong chế phẩm ban đầu được pha loãng đến nồng độ thích

hợp, sau đó được cấy trộn vào môi trường dinh dưỡng trong đĩa petri và nuôi cấy ở

nhiệt độ, thời gian thích hợp. Sau thời gian nuôi cấy, đếm số khuẩn lạc và tính số

lượng vi sinh vật có trong chế phẩm ban đầu Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là tốn thời gian nuôi cấy, khó

khăn trong việc lựa chọn môi trường đặc hiệu cho vi sinh vật cần định lượng trong

hỗn hợp gồm nhiều vi sinh vật khác nhau.

b. Định lượng bằng phương pháp real-time PCR

Real-time PCR là một trong những kỹ thuật cho phép định lượng chính xác

nhất số lượng trình tự DNA trong một mẫu thí nghiệm. Khác với việc định lượng

khi quá trình khuếch đại đã hoàn tất, kỹ thuật này cho phép kiểm soát và định lượng

số lượng DNA ngay cả khi phản ứng đang xảy ra. Trong kỹ thuật này, ở mỗi chu

kỳ, lượng DNA được khuếch đại sẽ phát ra một lượng tín hiệu huỳnh quang nhất

định. Nói cách khác, lượng tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng tỉ lệ thuận với mỗi chu kỳ

khuếch đại thành công của phản ứng real-time PCR. Như vậy bằng cách ghi nhận

lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra sau mỗi chu kỳ, ta có thể kiểm soát phản ứng

PCR ngay trong giai đoạn khuếch đại tuyến tính của chúng. Và sự gia tăng đầu tiên

của tín hiệu huỳnh quang sẽ tương ứng với lượng DNA ban đầu của mẫu

Trong phản ứng real-time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát

huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR

Green, EvaGreen...) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX ...).

Tác nhân liên kết với mạch đôi DNA. Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của

các sản phẩm DNA mạch đôi do quá trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với

DNA mạch đôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm vừa được tạo ra này



11

và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn (so với trạng thái tự do trong dung

dịch). Loại tác nhân huỳnh quang này có thể sử dụng được cho mọi trình tự đích

nên chi phí sẽ thấp; nhưng độ đặc hiệu của sản phẩm phải được kiểm tra chặt chẽ

thông qua một bước phân tích bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc – phân

tích đường cong nóng chảy (Melting curve analysis).

Tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu rất đa dạng như FAM, TAMRA,

Texas Red, Cy3, Cy5… được sử dụng với nhiều loại mẫu dò khác nhau như mẫu dò

lai, mẫu dò thủy giải, mẫu dò dạng kẹp tóc.

Khi sử dụng với các mẫu dò khác nhau, cường độ tín hiệu huỳnh quang đều tỉ

lệ thuận với hàm lượng sản phẩm đích đang được nhân bản trong phản ứng. Các tínhiệu huỳnh quang phát ra sẽ được các đầu dò của máy luân nhiệt real-time PCR thu

nhận và xử lý. Khi cường độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt qua đường tín hiệu

huỳnh quang nền (base line) của phản ứng thì mẫu được xem là dương tính và

người ta lấy thời điểm vượt qua đó (biểu hiện qua giá trị chu kỳ ngưỡng – Ct, Cycle

Threshhold) để so sánh với một đường cong chuẩn (standard curve) đã biết để suy

ra nồng độ trình tự DNA đích trong mẫu thử nghiệm ban đầu. Đường cong chuẩn

được xây dựng từ chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn có chứa sản phẩm đích đã biết

trước nồng độ.

c. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH-fluorescent insitu

hybridization).

FISH dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của vi sinh vật cần định

lượng bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với các trình

tự đặc hiệu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn (không cần phá vỡ tế bào)

Quy trình thực hiện bao gồm các bước:

- Chuẩn bị mẫu và đầu đò

- Cố định mẫu

- Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào

- R ửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai

- Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang

trực tiếp)



12

- Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả bằng kính hiển vi quét laze đồng tiêu

hoặc kính hiển vi gắn thêm bộ lọc dải hẹp nhiều tần cùng với một máy ảnh

và phần mềm xử lí hình ảnh.

Các đầu dò thường được sử dụng là các oligonucleotide rRNA 16S để đảm

bảo sự liên kết bổ sung đạt hiệu quả cao nhất trong quá trình lai.

Đầu dò thường được đánh dấu bằng cách gắn trực tiếp chất nhuộm huỳnh quang lên

đầu dò hoặc kết hợp đầu dò với một số chất chỉ thị như Digoxygenin, sau đó chúng

sẽ được dò tìm thông qua một chất phản huỳnh quang

Ưu điểm của 2 phương pháp Realtime PCR và FISH là nhanh, cho độ chính

xác cao. Tuy nhiên nhược điểm là đòi hỏi đầu tư thiết bị đắt tiền, yêu cầu trình độkỹ thuật cao và không phân biệt được vi khuẩn sống hay vi khuẩn chết.

1.3.5.2. Định danh

a. Định danh kiểu hình

Dựa theo khóa phân loại được công nhận quốc tế: Dựa vào đặc điểm hình thái,

phản ứng sinh hóa. Để tiến hành kiểm tra các đặc điểm sinh hóa thì phương pháp sử

dụng phổ biến hiện nay là sử dụng các kit sinh hóa có sẵn (Ví dụ Api kit của hãng

BioMerieux-Pháp). Để định danh vi sinh vật thuộc chi Bifidobacterium có thể sử

dụng kit API 20A hoặc Rapid ID 32A.

b. Định danh kiểu gen.

Để định danh đến loài, kỹ thuật phổ biến được sử dụng hiện nay là kỹ thuật

nhân gen và giải trình tự

Kỹ thuật này bao gồm các bước:

Tách chiết DNA của vi sinh vật nghiên cứu: Thành tế bào vi sinh vật được

phá vỡ nhờ lysozyme và các chất tẩy rửa mạnh như SDS-tris-hydroclorid

giúp giải phóng toàn bộ DNA của vi sinh vật. Protein và RNA được tách

khỏi DNA nhờ các enzym RNAse, protease và isopropanol. Cuối cùng DNA

được tủa bằng ethanol tuyệt đối.

Tiến hành phản ứng PCR: Với việc sử dụng DNA polymerase và các

oligonucleotid tổng hợp nhân tạo, một đoạn DNA dùng làm khuôn được

nhân lên nhanh chóng với số bản sao gấp hàng tỉ lần mà không cần đến



13

nhiều tế bào vi sinh vật. Nhờ phản ứng này, một đoạn gen bất kì sẽ được

khuếch đại khi biết trình tự của hai điểm từ đầu 5’ đến đầu 3’ của sợi bổ

sung và nhờ có enzym DNA polymerase mà DNA khuôn được tổng hợp khi

đã có sẵn dNTP.

Kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose. Phân tích trình tự 16S

rDNA theo phương pháp Sanger. Cuối cùng, chuỗi trình tự này được so

sánh với tất cả các chuỗi nucleotid 16S rDNA đã được công bố trên ngân

hàng gen quốc tế và từ đó đưa ra kết luận chính xác tên của vi sinh vật.

Phương pháp này có độ chính xác rất cao. Cho đến nay, các chuyên gia phân

loại vi sinh vật trên thế giới đều cho rằng phương pháp tốt nhất để định danh vi sinhvật và thành lập cây phát sinh chủng là dựa trên trình tự rDNA kết hợp với phương

pháp phân loại kinh điển. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi đầu tư trang thiết bị

rất lớn mà không phải phòng thí nghiệm nào cũng có khả năng trang bị được.

- Kỹ thuật nhân gen PCR (Polymerase Chain Reaction) [8].

PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại

và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử.

PCR dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài primer nhờ enzym Taq DNA

polymerase để khuếch đại in vitro các acid nucleic đặc hiệu trong thiết bị điều nhiệt

tuần hoàn (thermocycler) hay còn gọi là máy PCR. PCR cho phép khuếch đại theo

hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ 200- 3000 bp. Đoạn

DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận dạng nhờ cặp primer đặc hiệu

(oligonucleotid) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide.

Taq D NA polymerase là một loại enzym DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi

khuẩn chịu nhiệt cao Thermus aquaticus), được dùng để tổng hợp các đoạn DNA

mới trong môi trường có bốn loại deoxyribonucleotid (dATP, dCTP, dGTP và

dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết

hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn

mẫu. Sau nhiều chu kì, số lượng đoạn DNA nói trên được nhân lên gấp nhiều lần,

nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng...



14

Nguyên tắc của phản ứng khuếch đại gen được trình bày tổng quát trong Hình

1.3 và Hình 1.4

Hình 1.3. Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase

Hình 1.4.



15

Nguyên tắc của PCR được trình bày trong Hình 1.3 và Hình 1.4. Theo đó, từ

chu kỳ thứ hai, Taq polymerase (Taq pol) bắt đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài

xác định. Các primer thường là một oligonucleotid tổng hợp, có khoảng 10 - 20

nucleotid hoặc hơn. Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng

hợp nhân tạo các primer tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ

thuật điện di. Trong kỹ thuật PCR người ta thường tiến hành khoảng 25 - 35 chu kỳ.

Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba bước có nhiệt độ khác nhau (xem hình vẽ minh hoạ):

Bước 1 là biến tính DNA (ở 90- 95oC), có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn

xoắn kép. Bước 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn (ở 40 -65oC). Bước 3

là kéo dài chuỗi theo mồi, (ở nhiệt độ 70-72o

C)

chiều 5’-3’ với quá trình trùng hợpgắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ

sung. Tính đặc hiệu của phản ứng được quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp

theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kết quả tạo ra hàng triệu phiên bản

sợi khuôn trong vài giờ.

- Điện di DNA trên gel agarose

Nguyên lý điện di: các phân tử DNA là các polyanion nên trong môi trường

trung tính và kiềm, dưới tác dụng của điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực

dương. Mức độ di chuyển của các phân tử DNA trong điện trường phụ thuộc chủ

yếu vào kích thước (hay khối lượng phân tử) của chúng. Phân tử có kích thước nhỏ

sẽ di chuyển nhanh còn phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm. Sử dụng

thang chuẩn DNA với kích thước đã biết có thể dễ dàng xác định được kích thước

tương đối của DNA mẫu.

Tiến hành: chuẩn bị gel agarose X%, tiến hành tra mẫu gồm 10 l mẫu DNA

được trộn với 2 l đệm mầu (có chứa: glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol

xanh, xylene cyanol) và tra vào các giếng trên gel. Chạy điện di với hiệu điện thế ổn

định là 10 volt/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2

cm thì dừng lại. Nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromide (EtBr) ở nồng độ

50 g/ l trong 15-30 phút. Sau đó, gel được lấy ra và soi dưới ánh sáng tử ngoại

của máy soi chụp gel, các băng gắn với EtBr xuất hiện dưới dạng các băng màu

sáng trên nền gel màu đen.



16

- Nhân dòng

Nhân dòng là sự tách lập và thu nhận nhiều bản sao đồng nhất của một gen

hay của một mảnh đoạn DNA.

Nguyên tắc:

K ỹ thuật nhân dòng bao gồm việc phải cài một mảnh (chuỗi) DNA lạ vào một

vector (plasmide hoặc phage λ) bằng phương pháp hóa sinh. Sau đó, đưa phân tử

lai nay vào tế bào chủ đã chọn lựa bằng phương pháp biến nạ p hoặc tải nạp. Trườ ng

hợ p muốn tạo dòng tổng hợ p enzym thì mảnh DNA định cài phải mã hóa cho gen

cấu trúc của một enzyme nào đó.

+ Các bước cơ bản của phương pháp nhân dòng: Tách lậ p các DNA lạ cần nhân dòng:

Chọn và xử lý vector nhân dòng

Tạo DNA tái tổ hợ p (vector tái tổ hợ p).

Chuyển DNA tái tổ hợ p vào tế bào chủ bằng phương pháp biến nạ p hoặc tải

nạ p.

Phát hiện dòng cần tìm

Kiểm tra thu nhận sản phẩm của gen tái tổ hợ p.

- Giải trình tự

Phương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định

typ vi sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi DNA của một vùng quy định

trên nhiễm sắc thể. Phương pháp giải trình tự DNA phát triển nhanh chóng, kết quả

so sánh sự tương đồng của trình tự gen nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại

chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyềngiữa các đối tượng nghiên cứu. Các gen bảo thủ được giải trình tự làm cơ sở để xác

định vị trí của sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tự không tương đồng

(khác biệt) lại làm cơ sở cho sự biệt hóa cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá

thể gần với nhau.

Từ những năm 1977 một số phương pháp giải trình tự gen đã được phát minh

như phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học ( Alan

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Alan_Maxam&action=edit&redlink=1




17

Maxam và Walter Gilbert), phương pháp giải trình tự gen bằng enzyme (do

Frederick Sanger và cộng sự )

Cả hai phương pháp này đã đánh dấu bước ngoặt lớn trong lịch sử phát triển

của bộ môn sinh học hiện đại. Ngày nay, rất nhiều máy giải trình tự gen tự động đều

dựa trên nguyên tắc chính là phương pháp giải trình tự gen của Sanger.

Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định

nhờ DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide cùng với các

deoxynucleotid thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp

nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau.

Các phân đoạn DNA sẽ được phân tách bằng điện di trên gel polyacrylamid cókhả năng phân tách hai trình tự DNA chỉ chênh nhau một nucleotid. Với việc sử

dụng một loại nucleotide có đánh dấu đồng vị phóng xạ, kết quả trình tự DNA cần

xác định được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di.

Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sản

sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch

điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Nguyên

tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di

đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được

con mắt cản quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ.

Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng

với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA.

1.3.6. Tình hình nghiên cứu định tính và định lƣợ ng B. longum trong các

chế phẩm probiotics trong những năm gần đây - Trên thế giới

Phương pháp định lượng B. longum phổ biến vẫn là phương pháp đếm trên đĩa

thạch. Bên cạnh đó các nhà khoa học đã nghiên cứu thêm một số phương pháp mới

đó là phương pháp FISH, phương pháp real-time PCR và kỹ thuật nhuộm huỳnh

quang.


http://vi.wikipedia.org/wiki/Walter_Gilbert

http://vi.wikipedia.org/wiki/Frederick_Sanger

http://vi.wikipedia.org/wiki/Frederick_Sanger

http://vi.wikipedia.org/wiki/Walter_Gilbert




18

Để định lượng B. longum trong các chế phẩm gồm nhiều vi sinh vật bằng

phương pháp đếm trên đĩa thạch, việc khó khăn nhất là lựa chọn được môi trường

phù hợp. Môi trường này phải đáp ứng yêu cầu là khuyến khích sự phát triển của B.

longum và ức chế hoàn toàn sự phát triển của các vi sinh vật còn lại trong hỗn hợp.

Để đạt được yêu cầu này, người ta thường dựa vào khả năng nhạy cảm hoặc kháng

lại kháng sinh của vi sinh vật trong hỗn hợp. Do đó người ta sẽ thêm vào môi

trường cơ bản ban đầu một hoặc nhiều kháng sinh khác nhau với mục đích là các

kháng sinh này sẽ ức chế các vi sinh vật khác trong hỗn hợp, sẽ định lượng và phân

lập riêng được vi sinh vật cần nghiên cứu là vi sinh vật đề kháng lại các khá ng sinh

đã thêm vào môi trường. Dựa trên nhiều công trình nghiên cứu của nhiều tác giả,Janet E.L.Corry và cộng sự đã tổng quan lại một số môi trường để định lượng

Bifidobacteria trong chương 10 cuả quyển “ Handbook of culture Media for Food

and Water Microbiology, 3rd

edition” [19]. Theo đó việc lựa chọn môi trường để

định lượng tùy thuộc vào sự có mặt của những vi sinh vật nào trong hỗn hợp cần

định lượng, từ đó cho phép định lượng riêng được từng vi sinh vật trong hỗn hợp.

Để định danh B. longum trong hỗn hợp, phương pháp phổ biến thường được

dùng là định danh bằng kỹ thuật PCR [27], [22].

- Trong nước

Hiện nay, thị trường thuốc Việt Nam có rất nhiều thuốc và thực phẩm chức

năng có chứa B. longum như LACTIBIO (Công ty TNHH DP UNIVN), LAZEBIO

(Công ty INTECHPHARM), LACCLEAN GOLD (Cell Biotech CO, Ltd),

YBIOPLUS (Công ty Dược Hậu Giang), Safikid BIO (Học viện Quân Y), L-Bio-

3D (Công ty Liên Doanh Dược phẩm Mebiphar Austrapharm)…

Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về việc định lượng và phân lập riêng B.

longum trong thuốc và thực phẩm chức năng. Việc định lượng chỉ dừng lại ở định

lượng hỗn hợp vi sinh vật trong chế phẩm. Đồng thời việc định danh B. longum

cũng chưa được nghiên cứu thấu đáo. Trong một số tiêu chuẩn cơ sở của các nhà

sản xuất trong nước đã sử dụng kít Api 20A để định danh B. longum trong chế

phẩm [1], [2]. Tuy nhiên, việc sử dụng kit Api 20A mới chỉ cho phép định danh đến

chi Bifidobacterium, đồng thời các tiêu chuẩn này cũng chưa chỉ ra được cách phân



19

lập khuẩn lạc thuần khiết để tiến hành phản ứng sinh hóa. Điều này sẽ dễ gây ra sai

số trong việc định danh. Chưa có công trình nghiên cứu nào ứng dụng kỹ thuật nhân

gen và giải trình tự để định danh B. longum.

Do đó hướng nghiên cứu của đề tài này là nghiên cứu lựa chọn môi trường đặc

hiệu để định lượng riêng được B. longum trong hỗn hợp, từ đó phân lập được khuẩn

lạc thuần khiết để định tính bằng kít sinh hóa và định danh bằng kỹ thuật sinh học

phân tử. Thẩm định qui trình đã thiết lập để áp dụng vào việc kiểm nghiệm B.

longum trong một số chế phẩm thuốc và thực phẩm chức năng lưu hành trên thị

trường Việt Nam.



20

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN V ẬT LIỆU,

TRANG THIẾT BỊ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. PHƢƠNG TIỆN DÙNG TRONG NGHIÊN CỨ U

2.1.1. Môi trƣờ ng, hoá chất, dung môi, thiết bị

2.1.1.1. Môi trườ ng

- Môi trường BSM đặc (Fluka) lô BCBK6505V.

Hỗn hợp kháng sinh để thêm vào môi trường BSM đặc, lô BCBK 1651V

- Môi trường MRS đặc (Merck)

Công thức

Pepton 10,0g

Cao thịt 8,0g

Cao men bia 4,0g

Glucose 20,0g

Dikali hydrophosphat 2,0g

Tween 80 1,0g

Amoni citrat 2,0g

Natri acetat 5,0g

Mangan sulfat 0,04g

Magnesi sulfat 0,2g

Thạch 14,0g

Nước cất vừa đủ 1000ml pH sau khi tiệt trùng: 5,7 ± 0,2

- Môi trường MRS lỏng (Merck) có công thức giống môi trường MRS đặc

chỉ khác là không có thạch.



21

- Môi trườ ng API 20A (BioMérieux, Pháp): Ống 4ml. Số lô: 1002717340.

Hạn dùng: 5/5/2015

Công thứ c

Trypticase 5,0g

Cao men bia 5,0g

Natri clorid 2,5g

L-tryptophan 0,2g

L-cystine 0,4g

Hemin 0,005g

Vitamin K 1 0,01g Natri sulfit 0,1g

Nướ c cất vừa đủ 1000ml

pH sau khi tiệt trùng: 6,9 – 7,3.

- Môi trườ ng thạch máu

Công thứ c

Pepton 10,0g

Natri clorid 5,0g

Cao thịt 2,5g

Thạch 20,0g

Nướ c cất vừa đủ 1000ml

pH sau khi tiệt trùng: 7,4 – 7,6

Máu thỏ 50,0ml ( máu 5%)



22

2.1.1.2. Hoá chấ t, dung môi

- Hóa chất, dung môi được ghi ở Bảng 2.1 và Bảng 2.2

Bảng 2.1. Mồi đặc hiệu

Loài Tên mồi Số lô Hãng sản xuất

Đoạn 16S r DNA

ID16R08F 208918A07

InvitrogenIDL16R09R 208918A08

B. longum

BlonF 208918B05

InvitrogenBlonR 208918B05

VectorpGemT easy nguyên

bản

Promega

Bảng 2.2. Hóa chất, dung môi

Tên Số lô Hãng sản xuất

Lysozym 061M13281V Sigma-Aldorich

WizardR Genomic DNA

Purification Kit

297885 Promega

Taq DNA polymerase 1130853 Life technologies

dNTPs (100mM) 1139131 Life technologies

Thang DNA chuẩn 668361 Invitrogen

DNA loading Dye (6X) 00056239 Fermentas

Đệm PCR – MgCl2 (10X) 1113366 Invitrogen

Nước cất siêu tinh khiết 764952 Invitrogen

Agarose siêu tinh khiết 0000144547 Invitrogen

Tris siêu tinh khiết 90920S196 Biobasic Inc

EDTA, free acid 1004SHLS0125B0210J Biobasic Inc

Kit API 20A 1002998430 BioMérieux

Thuốc thử BCP 1003101450 BioMérieux

Thuốc thử XYL Merck

Thuốc thử HER 1003059340 BioMérieux



23

- Độ đục chuẩn McFarland số 2: Hút chính xác 2,0ml dung dịch bari clorid 1,0%

vào bình định mức dung tích 100ml và pha loãng bằng dung dịch acid sulfuric 1,0%

vừa đủ đến vạch, tr ộn đều.

- Độ đục chuẩn McFarland số 3: Hút chính xác 3,0ml dung dịch bari clorid 1,0%

vào bình định mức dung tích 100ml và pha loãng bằng dung dịch acid sulfuric 1,0%

vừa đủ đến vạch, tr ộn đều.

Đo độ hấ p thụ của các độ đục chuẩn ở bướ c sóng 600nm, cốc đo dày 1cm, sử

dụng dung dịch acid sulfuric 1,0% làm mẫu tr ắng thì độ hấ p thụ của độ đục chuẩn

số 2 khoảng 0,451, độ hấ p thụ của độ đục chuẩn số 3 khoảng 0,582. Độ đục chuẩn

chỉ dùng trong vòng 3 tháng k ể từ ngày pha.2.1.1.3. Thiế t bị , d ụng cụ

a. Thiết bị.

Được hiệu chuẩn theo ISO/IEC-17025 và GLP.

- Buồng thổi khí sạch Kebo (Thuỵ Điển).

- Tủ ấm CO2 T 305-F (Thuỵ Điển)

- Tủ sấy Memmert ULE 600 (Đức)

- Nồi hấp Tomy SS-325 (Nhật)

- Cân kĩ thuật điện tử Sartorius TE 412, độ chính xác 0,01g (Đức)

- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến Shimadzu (Nhật Bản)

- Tủ lạnh sâu Kebo 2951 (Thuỵ Điển)

- Máy li tâm lạnh Mikro-200R (Đức)

- Máy điện di gel XL-ULTRA-V-2 (Mỹ)

- Máy chụp ảnh gel UVDI- 312 (Đài Loan) - Máy khuyếch đại gen RealTime Step one Plus (Singapore)

- Máy lắc trộn Vortex Genie 2 (Mỹ)

- Đèn soi UV ở bước sóng 365nm

b. Dụng cụ

Các dụng cụ thuỷ tinh như pipet, bình định mức, bình nón... Class A.

Micropipet (Eppendorf - Đức) 10 l, 100 l 1000 l, 5ml và 10ml. Ống nhựa 1,5ml,

2,0ml; ống thủy tinh kích thước 16x120mm.



24

2.1.2. Phần mềm xử lý k ết quả: Apiweb của hãng BioMérieux.

2.1.3. Chủng vi sinh vật chuẩn

Các chủng vi sinh vật chuẩn đượ c sử dụng trong đề tài này đượ c trình bày ở Bảng 2.3

Bảng 2.3. Các vi sinh vật chuẩn đượ c sử d ụng

TT Tên chủng Kí hiệu TT Tên chủng Kí hiệu

1 Bacillus

cereus

ATCC 11778 11 Lactobacillus

rhamnosus

ATCC

9595

2 Bacillus

pumilus

ATCC 14884 12 Bifidobacterium

breve

ATCC

15700

3 Bacillus

stearothermo

philis


bifidum

ATCC

11863

4 Bacillus

subtilis

ATCC 6333 14 Streptococcus

faecalis

ATCC

33186

5 Lactobacillus

acidophilus

ATCC

4356

15 Streptococcus

pyogenes

ATCC

19615

6 Lactobacillus

leichmannii

ATCC 7830 16 Pseudomonas

aeruginosa

ATCC

9027

7 Bacilus

coagulans

ATCC 7050 17 Escherichia coli ATCC

8739

8 Lactobacillus

casei

ATCC 334 18 Staphylococcus

aureus

ATCC653

8

9 Lactobacillus

fermentum

ATCC 9338 19 Streptococcus

thermophilus

ATCC

19258

10 Lactobacillus

plantarum


longum

JCM 1217



25

2.2. ĐỐI TƢỢ NG NGHIÊN CỨ U

Là một số chế phẩm probiotics trên thị trường

- Gói bột SamubioTHYMO (kí hiệu mẫu A)

Công ty sản xuất: Công ty cổ phần Dược, vật tư y tế Hải Dương

Số đăng kí: 12735/2011/YT-CNTC

Số lô: 010112. Hạn dùng: 300115

Công thức: Mỗi gói 3g bột chứa

+ Lactobacillus acidophilus ≥108CFU

+ Bifidobacterium longum ≥108CFU

+ Streptococcus faecalis ≥108

CFU- Gói bột safikid BIO (kí hiệu mẫu B)

Công ty sản xuất: Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sản xuất thực phẩm chức

năng- Học viện Quân Y.

Số đăng kí: 1757/2010/YT-CNTC

Số lô: 1113. Hạn dùng: 11/2015

Công thức: Mỗi gói 3g bột chứa

+ Lactobacillus acidophilus ≥108CFU

+ Bifidobacterium longum ≥108CFU

+ Streptococcus thermophilus ≥108CFU

- Gói bột L-Bio-3D (ký hiệu mẫu C)

Công ty sản xuất: Công ty liên doanh dược phẩm MEBIPHAR -

AUSTRAPHARM

Số đăng kí: QLSP -0746-13Số lô: 061213. Hạn dùng: 25/12/2015

Công thức: Mỗi gói 1g bột chứa hỗn hợp các vi khuẩn sinh acid lactic

≥108CFU

+ Lactobacillus acidophilus

+ Bifidobacterium longum

+ Lactobacillus rhamnosus

- Gói bột Lackid (Ký hiệu mẫu D)



26

Công ty sản xuất: Novarex, Hàn Quốc

Số đăng kí: 3056/2013/ATTP - XNCB

Số lô: 4002. Hạn dùng: 08.04.2017


≥108CFU


+ Lactobacillus rhamnosus

+ Lactobacillus plantarum


+ Streptococcus faecalis - Gói bột Probiotics Lactomin plus (ký hiệu mẫu E)

Công ty sản xuất: Novarex, Hàn Quốc

Số đăng kí: 1160/2014/XNQC - ATTP

Số lô: 4002. Hạn dùng: 04.02.2017


≥108CFU



+ Streptococcus faecalis

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

2.3.1. Phƣơng pháp định lƣợ ng B. longum trong chế phẩm

Sử dụng phương pháp đếm trên đĩa thạch. Trên cơ sở tham khảo các công

trình nghiên cứu có liên quan, chúng tôi lựa chọn môi trường BSM agar để định

lượ ng B. longum trong hỗn hợ p [19], [25].

Chuẩn bị hỗn dịch thử : Cân và xác định khối lượng trung bình của 20 gói chế

phẩm. Cân chính xác khoảng 10,0g bột thuốc vào bình nón vô trùng, thêm dung môi

pha loãng với thể tích tính theo mililit bằng 9 lần khối lượng bột thuốc đã cân và vài

viên bi thuỷ tinh vô trùng. Lắc mạnh trong 30 phút để vi sinh vật phân tán đều trong

dung dịch, thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10-1

. Lấy 1000 l hỗn dịch trên cho



27

vào ống nghiệm đã chứa sẵn 9,0ml dung môi pha loãng, lắc đều bằng máy lắc trộn

Vortex được hỗn dịch có độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng 10 lần như trên để

thu được hỗn dịch có có độ pha loãng 10-5, 10-6 và 10-7.

Tiến hành: Chuẩn bị ba đĩa petri vô trùng, chuyển vào mỗi đĩa chính xác

1000 l hỗn dịch có độ pha loãng 10-5. Tiếp tục làm như trên với hỗn dịch có độ pha

loãng 10-6 và 10-7. Cấy trộn với môi trường BSM đặc (đã được tiệt trùng và để nguội

xuống khoảng 45oC), để môi trường trong đĩa đông tự nhiên. Lật ngược đĩa petri và

ủ ở 37 1oC trong 48 - 72 giờ trong điều kiện kị khí. Sau thời gian ủ, đếm số lượng

khuẩn lạc trong các đĩa petri (chỉ đếm các đĩa petri có số khuẩn lạc nằm trong

khoảng 25 - 250).Tính kết quả: Số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm được tính theo công

thức:

A = nTB d MTB

Trong đó:

A : số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm (CFU/gói),

nTB : số lượng khuẩn lạc trung bình trong 3 đĩa petri (CFU),

MTB : khối lượng trung bình của bột thuốc trong gói chế phẩm (g/gói),

d : hệ số pha loãng của hỗn dịch thử.

2.3.2. Phƣơng pháp định danh vi sinh vật bằng kit API 20A

2.3.2.1. Nguyên t ắ c chung

Kit API 20A là một hệ thống đã đượ c tiêu chuẩn hóa của hãng BioMérieux

(Pháp). Kit API 20A đượ c dùng cùng với môi trườ ng API 20A để định danh vi sinh

vật k ị khí, trong đó có chi Bifidobacterium.

Kit API 20A gồm 20 giếng chứa các chất nền khác nhau. Vi sinh vật cần xác

định sẽ đượ c cấy vào môi trườ ng API 20A và nhỏ môi trường đã có vi sinh vật vào

từng giếng, lúc này các chất nền trong giếng sẽ được hoà tan vào trong môi trườ ng.

Trong quá trình nuôi cấy sản phẩm chuyển hóa nếu có sẽ tự làm thay đổi màu môi

trườ ng hoặc thay đổi màu sau khi thêm thuốc thử. Tên của các chất nền sẽ được đề

cập đến trong mục 2.3.2.2 13 .



28

2.3.2.2. Tiế n hành

Sau khi nuôi cấy vi sinh vật như mô tả trong mục định lượ ng 2.3.1, lựa chọn

một khuẩn lạc đặc trưng, tách biệt và cấy chuyển sang 5,0ml môi trườ ng MRS lỏng,

có bổ sung khoảng 0,5ml dầu khoáng ở lớ p bề mặt và ủ trong điều kiện k ị khí ở 37

1oC trong 24 giờ .

a. Nhuộm Gram: Tiến hành nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram và

soi dướ i kính hiển vi vớ i vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần.

Nếu vi sinh vật bắt màu tím, hình que, không có bào tử thì k ết luận vi sinh

vật là tr ực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử.

b.

Định danh vi sinh vật bằ ng kit API 20A:Sau khi xác định vi sinh vật là tr ực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử

thì tiế p tục cấy một quai cấy canh chủng từ ống MRS lỏng ở trên lên môi trườ ng

thạch máu, ủ trong điều kiện k ị khí ở 37 1oC trong 18-24 giờ . Gặt vi sinh vật

trên bề mặt đĩa thạch và phân tán đều trong ống nghiệm có sẵn 1ml nướ c cất vô

trùng thu đượ c hỗ n d ịch g ố c.

Nhỏ từ từ từng giọt hỗ n d ịch g ố c ở trên vào một ống nghiệm đã chứa sẵn 4ml

nướ c cất vô trùng đến khi độ đục trong ống tương đương với độ đục chuẩn

McFarland số 3. Ghi lại số giọt hỗn dịch gốc đã cho vào ống nghiệm trên.

Cho vào 4ml môi trườ ng API 20A số giọt hỗn dịch gốc bằng số giọt đã cho

vào ống nghiệm trên và lắc đều. Như vậy, nồng độ vi sinh vật trong môi trườ ng

API 20A tương đương với độ đục chuẩn McFarland số 3 (so sánh độ đục bằng

mắt thườ ng).

Nhỏ môi trườ ng API 20 đã cấy vi sinh vật vào các giếng của bộ kit API 20A bắt đầu từ giếng số 0 đến giếng 20, chú ý tránh tạo bọt khí trong giếng, chú ý chỉ

nhỏ phần tube. Riêng đối vớ i giếng IND nhỏ dung dịch dầu khoáng vô trùng lên

trên bề mặt giếng để tạo điều kiện k ị khí cho vi sinh vật phát triển. Đối vớ i giếng

GEL nhỏ cả phần tube và phần miệng giếng. Ủ ở 36 ± 2oC trong điều kiện k ị khí

trong vòng 24± 2h.

Cách đọc k ết quả: Sau 24h nuôi cấy, quan sát và đọc k ết quả.



29

- Đối vớ i giếng IND: Thêm 1 giọt thuốc thử XYL vào lớ p dầu khoáng phía

trên, tr ộn đều và để 2-3 phút. Sau đó thêm 1 giọt thuốc thử EHR. Đọc k ết

quả trong vòng 5 phút. K ết quả là dương tính nếu xuất hiện màu đỏ.

- Đối vớ i các giếng có chứa các đườ ng khác nhau: Thêm vào mỗi giếng một

giọt thuốc thử BCP. K ết quả được ghi là dương tính nếu xuất hiện màu

vàng hoặc vàng-xanh.

- Phản ứng CAT: Để kit tiế p xúc vớ i không khí khoảng 30 phút, sau đó thêm

2 giọt thuốc thử H2O2 3% vào một giếng dương tính bất k ỳ. K ết quả đượ c

ghi là dương tính nếu thấy xuất hiện bọt khí.

Cách đọc giếng dương tính và giếng âm tính đượ c trình bày ở Bảng 2.4



30

Bảng 2.4. Cách đọc k ế t quả kit Api 20A

Giếng Chất nền

Hàm

lượ ng(mg/gi

ếng)

Phản ứng

K ết quả

âm tính Dương tính

IND L-tryptophan 0,98 Sự hình thành indol

XYL-tr ộn đ u /2-3 phút + HER/5 phút

Vàng Đỏ

URE Urea 0,648 Urease Vàng-cam Đỏ

GLU

MAN

LAC

SACMAL

SAL

XYL

ARA

D-glucose

D-manitol

D-lactose

D-saccharoseD-maltose

Salicin

D-xylose

L-arabinose

1,96

1,96

1,96

1,861,96

1,64

1,64

1,64

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóaAcid hóa

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóa

BCP

Tím Vàng/ vàng-xanh

GEL gelatin 0,6Sự thủy phân gelatin

Không có sự khuếch tán chất

màu

Có sự khuếch tán

chất màu đen

ESCEsculin

Sắt (III) citrat

0,36

0,11Sự thủy phân Esculin

Vàng Nâu-đen

Soi dưới đèn UV 365nm

Phát quang Không phát quang

GLY

CEL

MNE

MLZ

RAF

SOR

RHA

TRE

Glycerol

D-cellobiose

D-mannose

D-melezitose

D-raffinose

D-sorbitol

L-rhamnose

D-trehalose

1,82

1,86

1,96

1,96

2,18

2,18

1,96

1,96

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóa

BCP

Tím Vàng/ Vàng-xanh

Sau khi tiế p xúc vớ i không khí 30 phút, thêm H2O2

vào 1 giếng dương tính

CAT - Catalase Không có bọt khí Xuất hiện bọt khí

SPOR - Bào tử Không có Có

GRAM - H ng Tím

COCC - Hình thái Que C u



31

Ghi k ết quả vào phiếu theo dõi. Nhậ p số liệu vào phần mềm Apiweb để định

danh chính xác vi sinh vật trong chế phẩm.

2.3.3. Định danh đến loài bằng k ỹ thuật PCR và giải trình tự 2.3.3.1. Sơ đồ chung định tính B. longum trong các chế phẩ m probiotics bằ ng k ỹ

thuật PCR và giải trình t ự

Sau khi lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng tách biệt, tiến hành tăng sinh trong môi

trườ ng MRS lỏng có bổ sung 0,5ml dầu khoáng và được định danh đến chi

Bifidobacterium bằng kit API 20A như mô tả trong mục 2.3.2, tiế p tục cấy tăng sinh

VSV từ phần sinh khối còn lại sang môi trườ ng MRS lỏng, bổ sung thêm 0,5ml dầu

khoáng vô khuẩn, ủ ở 37±10C trong điều kiện k ỵ khí trong 24 giờ. Sau đó VSV

trong ống môi trườ ng MRS lỏng này sẽ đượ c tách chiết DNA và định danh bằng k ỹ

thuật PCR và giải trình tự theo sơ đồ sau

Hình 2.1. Sơ đồ định tính B. longum bằ ng k ỹ thuật PCR và giải trình t ự

VSV trong môitrường MRS lỏng

Tách chiết DNA

Kiểm tra sản phẩmtách

Tiến hành phản ứngPCR với mồi đặc hiệu

Nhân dòng và giảitrình tự



32

2.3.3.2. Tách DNA vi khuẩ n bằ ng WizardR Genomic DNA Purification Kit

Nguyên tắc:

Tách chiết DNA của vi sinh vật nghiên cứu: Thành tế bào vi sinh vật được phá

vỡ nhờ lysozyme và dung dịch ly giải tế bào giúp giải phóng toàn bộ DNA của vi

sinh vật. Protein và RNA được tách khỏi hỗn hợp nhờ enzym RNAse và dung môi

kết tủa protein. Cuối cùng DNA được tủa bằng Isopropanol.

DNA của các chủng nghiên cứu và của các vi sinh vật phân lập trong các mẫu

được tách và tinh sạch bằng kit của Promega có cải tiến. Quy trình thực hiện như

sau:

- Các chủng chuẩn được tăng sinh từ các ống gốc bằng môi trường MRSlỏng, ủ ở 370C trong 48 giờ. Đối với các mẫu nghiên cứu, tiếp tục tăng sinh

VSV trong môi trường MRS lỏng từ phần sinh khối của VSV được phân lập

sau khi đã định danh đến chi Bifidobacterium (mục 2.3.2 )

- Lấy 1,0 – 1,5ml môi trường tăng sinh chủng trên vào ống nhựa 1,5ml.

- Mang ly tâm 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút loại dịch nổi thu lấy cắn.

- Thêm 480µl dung dịch EDTA 50mM vào ống cắn, lắc đều.

- Thêm tiếp 120µl dung dịch lysozyme (nồng độ 20mg/ml) trộn đều.

- Ủ ở 370C trong 30-60 phút, sau đó ly tâm ở 10000-12000 vòng/phút trong 2

phút. Bỏ dịch nổi thu lấy cắn.

- Thêm 600µl dung dịch Nuclei Lysis vào ống cắn vừa thu được. Dùng pipet

đảo nhẹ tạo thành hỗn dịch.

- Ủ hỗn dịch trên ở 800C trong 5 phút để ly giải tế bào, sau đó để nguội đến

nhiệt độ phòng

- Thêm 3µl dung dịch RNAse vào dịch ly giải tế bào, trộn đều bằng cách đảo

ống từ 5-7 phút.

- Ủ ở 370C trong 15-60 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng.

- Thêm 200µl dung dịch Protein Precipitation (dung dịch kết tủa protein)

vào hỗn hợp trên, lắc mạnh tr ong 20 giây.

- Ủ trong đá lạnh 5 phút.

- Đem ly tâm 10000-12000 vòng/phút trong 3 phút.



33

- Chuyển dịch nổi chứa DNA vào một ống nhựa 1,5ml sạch khác chứa 600µl

isopropanol. Trộn đều bằng cách đảo ngược ống từ 5-7 lần.

- Ly tâm 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút.

- Loại bỏ dịch nổi, thu lấy cắn. Thêm 600µl dung dịch ethanol 70% vào ống,

đảo nhẹ nhàng để rửa cắn DNA.

- Ly tâm 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút. Cẩn thận loại hết ethanol

thừa, để khô tự nhiên trong 10-15 phút.

- Thêm 100µl dung dịch DNA Rehydration (dung dịch hòa tan DNA) vào

ống chứa cắn DNA, ủ 650C trong 1 giờ.

- Bảo quản dung dịch DNA vừa tách được ở -200

C.2.3.3.3. Định lượ ng DNA bằng phương pháp đo độ hấ p thụ ánh sáng t ử ngoại ở

bướ c sóng 260 nm (A260 )

Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm

(A260) của các phân tử DNA. Từ giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các

mẫu, với hệ số A260 = 1 tương đương với 50 ng/µl, sử dụng công thức C = A260 x 50

x n (trong đó n là số lần pha loãng) để định lượng DNA có trong mẫu tách chiết.

Tiến hành:

Lấy 20µl dung dịch DNA trên, thêm 1,98 ml nước cất siêu tinh khiết vô

khuẩn. Tiến hành đo quang ở bước sóng 260nm thu được A260. Dựa vào kết quả đo

tính toán nồng độ dung dịch DNA gốc rồi pha loãng dung dịch DNA gốc đến nồng

độ 50 ng/µl.

2.3.3.4. Nghiên cứ u, thiế t k ế mồi đặc hiệu

Trên cơ sở tham khảo các công trình nghiên cứu có liên quan, tham khảonguồn gen của các loài vi sinh vật trên hệ thống ngân hàng gen thế giới (Genbank)

và phần mềm Primer 3, NCBIblast. Từ đó nghiên cứu để thiết kế cặp mồi đặc hiệu

cho đối tượng nghiên cứu.



34

Bảng 2.5. Trình tự các cặp mồi dung cho phản ứng PCR

Loài Tên mồi Trình tự

Kích

thước

gen đích

Tài

liệu

tham

khảo

Đoạn

16S

rDNA

ID16R08

F

5’-GGGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCA- 3’

1500 bp [20]IDL16R0

9R

5’-GGGCTCGAGTACCTTGTTACGACTTCACC-3’

B.

longum

BlonF 5’-TTC CAG TTG ATC GCA TGG TC-3’

831 bp [27],

[22]

BlonR 5’-GGG AAG CCG TAT CTC TAC GA-3’

Vector

pGemT

nguyên

bản

T7-Fw5’ – AATACGACTCACTATAG – 3’

186 bp

[23]

SP6-Rv5’ – TATTTAGGTGACACTATAG – 3’

2.3.3.5. Kiể m tra khả năng tách DNA

16S ribosome RNA là một thành phần của các tiểu đơn vị 30s nhỏ trong

ribosome vi khuẩn. Các gen mã hóa cho thành phần này được gọi là 16S r DNA có

tính đặc thù cho vi khuẩn. Dựa trên tính chất này tiến hành phản ứng nhân bản đoan

gen 16s rDNA bằng mồi đặc hiệu để chứng minh sự có mặt của DNA vi khuẩn.

* Phản ứng PCR

Kiểm tra sản phẩm DNA tách được bằng phản ứng nhân bản đoạn gen đặc

hiệu 16S r DNA của vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR.



35

Bảng 2.6. Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra DN A mới tách

STT Thành phần Thể tích (µl)

1 Đệm PCR (10X) 2,5

2 dNTPs (2mM) 2,5

3 Dung dịch MgCl2 (50mM) 0,75

4 ID16R08F (10 pmol) 1

5 IDL16R09R (10 pmol) 1

6 Tag DNA polymerase (5u/µl) 0,1

7 DNA khuôn (50ng/µl) 3

8 Nước cất 14,15Tổng thể tích phản ứng 25µl

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen 16S r DNA: 940C trong

5 phút để biến tính hoàn toàn DNA khuôn, tiếp theo là 30 chu kỳ của 3 bước: 940C

trong 45 giây để làm biến tính DNA, 560C trong 45 giây để gắn mồi và 720C trong 1

phút 30 giây để kéo dài chuỗi. Mẫu sau đó được ủ tiếp ở 720C trong 5 phút và giữ ở

40C cho đến khi phân tích.

* Điện di trên gel agarose

Chuẩn bị bản gel có nồng độ 1% (kl/tt) trong đệm TBE (pH 8,0) (Tris-Boric

acid-EDTA), nhuộm sản phẩm theo kỹ thuật điện di trên gel giới thiệu ở mục

1.3.5.2 b, kèm theo một giếng nhỏ chứa thang kích thước DNA chuẩn. Điện di bằng

máy điện di gel XL-ULTRA-V-2 ở 100V trong 30 phút. Nhuộm sản phẩm bằng

dung dịch ethidium bromide 0,1% trong 15-30 phút. Ghi lại kết quả bằng máy chụpảnh bản gel UVDI- 312.

2.3.3.6. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của các đối tượ ng nghiên cứ u bằ ng k ỹ

thuật PCR

Tiến hành phản ứng PCR với các thành phần ghi trong Bảng 2.7



36

Bảng 2.7. Thành phần phản ứng PCR đơn mồi


1 Đệm PCR (10X) 2,52 dNTPs (2mM) 2,5


4 BlonF (10pmol) 1

5 BlonR (10pmol) 1



8 Nước cất 14,15

Tổng thể tích phản ứng 25µl

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu: : 94oC trong

5 phút để biến tính hoàn toàn DNA khuôn, tiếp theo là 30 chu kỳ của 3 bước: 940C

trong 45 giây để làm biến tính DNA, 56oC trong 45 giây để gắn mồi và 720C trong

30 giây để kéo dài chuỗi. Mẫu sau đó được ủ tiếp ở 72

o

C trong 5 phút và giữ ở 4

o

Ccho đến khi phân tích.

2.3.3.7. Nhân dòng và giải trình t ự

a. Tinh sạch DNA/dsRNA từ gel agarose bằng bộ kit Fermentas.

Bộ kít GenJETTM Gel Extraction được thiết kế để tinh sạch các phân đoạn

DNA từ gel agarose chạy trong đệm TAE hoặc TBE với hiệu suất cao trong thời

gian ngắn. Bộ kít sử dụng để tinh sạch các phân đoạn DNA/dsRNA sợi đôi có kíchthước từ 25 bp đến 20 kb, hiệu suất có thể lên đến 95% đối với các phân đoạn từ

100 bp đến 10 kb. Quy trình được thực hiện ở nhiệt độ phòng bao gồm những bước

như sau:

- Băng DNA/dsRNA quan tâm được cắt chính xác bằng lưỡi dao sạch từ gel

agarose và đưa vào ống eppendorf 1,5 ml.



37

- Bổ sung đệm bám (binding buffer) với 1 thể tích bằng khối lượng miếng

gel (1µl : 1 mg) và ủ trong bể ổn nhiệt 60°C trong khoảng 10 phút đến khi

gel tan hoàn toàn.

- Dung dịch gel agarose đã hòa tan được chuyển lên cột tinh sạch và ly tâm

10000 vòng/phút trong 1 phút. Sau đó phần dịch đi qua màng được gạn bỏ.

- Bổ sung 500 µl đệm rửa (wash buffer) vào cột và ly tâm 1 phút với vận tốc

10000 vòng/phút. Phần dịch đi qua màng được gạn bỏ. Lặp lại bước này

một lần nữa.

- Cột tinh sạch có chứa DNA/dsRNA được chuyển sang ống eppendorf 1,5

mới và bổ sung 100 µl elution buffer vào chính giữa lớp màng silica củacột.

- Sau đó DNA/dsRNA được thu bằng cách ly tâm 1 phút với tốc độ 10000

vòng/phút.

Lượng DNA/dsRNA tinh sạch được giữ ở -20°C để phục vụ cho thí nghiệm

tiếp theo.

b. Nhân dòng sản phẩm PCR bằng bộ kit pGEMT-Easy cloning.

- Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEMT- Easy.

Các đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng nghiên cứu được nhân bản bằng

phản ứng PCR nhờ enzyme Taq polymerase, do đó sản phẩm PCR được tạo ra là

các đoạn DNA có sẵn đầu A. Các đoạn DNA này dễ dàng ghép nối vào vector

pGEMT-Easy có đầu T nhờ tác dụng của enzyme T4 ligase. Phản ứng gắn sản phẩm

PCR vào vector pGEMT-Easy đầu T được thực hiện theo quy trình kèm theo của bộ

kit, với các thành phần như trong Bảng 2.8

Hỗn hợp phản ứng gắn sau đó được ủ trong bể ổn nhiệt 16°C qua đêm.



38

Bảng 2.8. Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector.

TT Thành phần Thể tích (µl)

1 Đệm phản ứng 2X 10 µl

2 Sản phẩm PCR 3 µl

3 Vector đầu T pGEMT-T 1 µl

4 T4 DNA ligase (5 u/µl) 1 µl

5 H2O cất khử ion vô trùng 5 µl

Tổng thể tích 20 µL

- Biến nạp DNA vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α. Tế bào khả biến E.coli DH5α (bảo quản trong tủ lạnh sâu -80°C) được làm tan

trên đá trong 10 phút. Tiếp đó, bổ sung 10µl hỗn hợp phản ứng gắn sản phẩm PCR

vào vector pGEMT-easy vào dung dịch tế bào đã rã đông và ủ trên đá 20 phút để

tạo điều kiện cho vector bám vào thành tế bào. Tế bào được sốc nhiệt bằng cách

chuyển sang bể ổn nhiệt 42°C trong 45 giây, sau đó được chuyển lại ủ trên đá trong

2 phút. Tiếp theo, bổ sung 450µl LB lỏng vào hỗn hợp biến nạp và ủ ở nhiệt độ

37°C trong vòng 20 phút trước khi được nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong

thời gian 30 phút. Hỗn hợp tế bào biến nạp được cấy trải trên đĩa môi trường LB

đặc có bổ sung ampicillin 100 µg/ml, phủ trên bề mặt cơ chất X-gal (20 l, nồng độ

20 mg/ml) và IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, 20 l, nồng độ

100mM), ủ ở 37°C qua đêm.

c. Tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep.

DNA tái tổ hợp được tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E. coli bằng bộ kitGenJETTM Plasmid Miniprep (Fermentas). Quy trình được thực hiện như sau:

- Một khuẩn lạc dương tính được nuôi lắc trong 5ml môi trường LB lỏng có

bổ sung kháng sinh ampicillin 100 µg/ml với tốc độ 220 vòng/phút ở 37°C

qua đêm.



39

- Tế bào được thu bằng cách ly tâm ở vận tốc 6000 vòng/phút trong 10 phút,

ở 4oC. Tế bào được hòa trở lại trong 250 µl đệm P1 (Resuspension

solution) đã bổ sung enzyme RNase A.

- Bổ sung 250 µl đệm P2 (lysis solution) vào dịch tế bào và đảo nhẹ 3-5 lần,

ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid.

- Hỗn hợp được trung hòa bởi 350 µl đệm P3 (neutralization solution), đảo

đều 4-6 lần. Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính được loại bỏ bằng cách ly

tâm hỗn hợp với vận tốc 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C.

- Dịch nổi sau khi ly tâm được đưa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 10000

vòng/phút trong 1 phút. Plasmid được giữ lại trên lớp màng silica còn dịchqua cột được gạn bỏ.

- Bổ sung 500 µl đệm rửa (Wash buffer), ly tâm 30- 60 giây, sau đó gạn bỏ

dịch qua cột. Bước này được lặp lại một lần nữa.

- Cột tinh sạch chứa plasmid được chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới.

Bổ sung 50 µl đệm đẩy (Elution buffer) vào chính giữa màng silica của cột

và ủ ở nhiệt độ phòng 2 phút.

- Plasmid được thu bằng cách ly tâm với vận tốc 10000 vòng/phút trong 1

phút.

Mẫu plasmid tinh sạch được bảo quản ở -20°C.

2.3.4. Thẩm định quy trình đã xây dự ng

Lựa chọn mẫu A làm đối tượng nghiên cứu để tiến hành thẩm định phương

pháp.

2.3.4.1. Thẩm định phương pháp định lượ ng B. longum

a. Kiểm tra tính chọn lọc của môi trường định lượng BSM agar

Tăng sinh các chủng chuẩn được ghi trong Bảng 2.9 trong môi trường MRS

lỏng, có thêm lớp dầu khoáng ở bề mặt, ủ ở 35-37oC trong 48 giờ trong điều kiện kỵ

khí. Sau đó mang hỗn dịch li tâm với tốc độ 3000-4000 vòng/phút, loại bỏ dịch nổi,

thu lấy sinh khối. Thêm từ từ vào ống nghiệm một lượng dung dịch nước muối sinh



40

lý 0,9 % vô khuẩn, trộn đều cho đến khi thu được hỗn dịch có độ đục tương đương

với độ đục Mc Farland số 2 (khoảng 6,0 x108 CFU/ml).

Chuẩn bị một dãy ống nghiệm thủy tinh vô trùng, mỗi ống chứa 9 ml nước

muối sinh lý 0,9 % vô khuẩn. Lấy 1ml hỗn dịch chủng ở trên thêm vào một ống

nghiệm trên, lắc đều thu được hỗn địch có độ pha loãng 10-1. Tiếp tục pha loãng đến

độ pha loãng 10-7.

- Lấy các ống nghiệm có độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7, với mỗi độ pha loãng

tiến hành cấy vi khuẩn trên 4 đĩa. Cấy vào mỗi đĩa petri vô trùng 1ml hỗn dịch

chủng ở độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7, thêm vào 2 đĩa ở cùng một độ pha loãng 15-

20ml môi trường BSM agar vô trùng đã làm nguội đến 45 -500

C. Thêm vào 2 đĩa ởcùng một độ pha loãng còn lại 15-20ml môi trường MRS agar. Ủ ở 35-37oC trong

điều kiện kỵ khí. Sau 48 giờ đem ra đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa (chỉ đếm đĩa

có 25-250 khuẩn lạc) và so sánh số lượng khuẩn lạc thu được trên 2 môi trường.

Bảng 2.9. Các chủng chuẩn được dùng để kiểm tra tính chọn lọc của môi trường

BSM agar

STT Tên chủng Kí hiệu

1 Lactobacillus rhamnosus ATCC9595

2 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356

3 Lactobacillus plantarum ATCC 8014

4 Lactobacillus casei ATCC 334

5 Lactobacillus fermentum ATCC 9338

6 Streptococcus faecalis ATCC 33186

7 Bifidobacterium longum JCM 1217

8 Streptococcus thermophilus ATCC 19258



41

b. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp [7], [17], [18].

Tiến hành phép thử định lượng như đã mô tả ở mục 2.3.1. Tiến hành định

lượng lặp lại 10 lần. Đánh giá kết quả

Tất cả các kết quả định lượng được chuyển sang dạng log 10 (để thu được mẫu

có phân bố tương đối chuẩn) trước khi phân tích thống kê.

Yêu cầu: Sr ≤ 0,25

Tính độ lệch chuẩn Sr theo công thức:

Trong đó:

- xi: Kết quả của mỗi lần lặp lại

- x : Kết quả trung bình của các lần lặp lại

- n: Số lần lặp lại (n=10)

2.3.4.2. Thẩm định qui trình định danh bằ ng kit API 20A

Tiến hành tăng sinh chủng chuẩn B. longum trong môi trường MRS lỏng, ủ ở

điều kiện kị khí ở 36-38oC trong 48 giờ. Sau thời gian nuôi cấy, cấy một quai cấy từ

hỗn dịch này lên môi trường thạch máu, ủ ở 36-38oC trong điều kiện kị khí trong 24

giờ.

Sau đó tiến hành định tính chủng vi sinh vật chuẩn B. longum bằng kit API 20A

theo phương pháp ghi trong mục 2.3.2. Ghi lại kết quả phản ứng. Nhập kết quả vào phần mềm Apiweb

TM

- Yêu cầu:

+ Kết quả định tính chủng chuẩn là thuộc chi Bifidobacterium với %ID > 80%

2.3.4.3. Thẩm định qui trình định danh bằ ng k ỹ thuật PCR và giải trình t ự

a. Đánh giá độ đặc hiệu

1

2

1

n

x x

S

n

i

i

ri



42

Nguyên tắc: Trong cùng một phản ứng PCR tiến hành nhân bản đoạn gen đặc

hiệu của đối tượng nghiên cứu với sự có mặt DNA của nhiều loài khác.

Bảng 2.10. Công thức tính độ đặc hiệu

Phép thử Chủng chuẩn

Cộng Dương tính Âm tính

Kỹ thuật PCR Dương tính a b a+b

Âm tính c d c+d

Cộng a+c b+d a+b+c+d

* Độ đặc hiệu = số trường hợp âm tính thật/(số trường hợp âm tính thật +số trườnghợp dương tính giả)=d/(b+d)

Quy trình được tiến hành như sau:

- Tách DNA từ chủng chuẩn B. longum JCM 1217 và các chủng kiểm tra độ

đặc hiệu như quy trình ghi ở mục 2.3.3.2.

- Kiểm tra kết quả tách DNA như trong mục 2.3.3.5.

- Tiến hành thử nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu bằng phản ứng PCR với thành

phần các ống thử nghiệm được ghi ở Bảng 2.7 ngoại trừ khuôn lần lượt là

DNA của 20 chủng vi sinh vật chuẩn được ghi ở Bảng 2.3. Các điều kiện

của phản ứng được ghi trong mục 2.3.3.5.

- Điện di DNA trên gel agarose

Tiến hành: Như mô tả trong mục 2.3.3.5

b. Đánh giá độ nhạy của phương pháp

Nguyên tắc: Tiến hành đánh giá ngưỡng phát hiện của toàn bộ quy trình phân

tích bao gồm cả phần xử lý mẫu (tách DNA) và phân tích mẫu (phản ứng PCR)

bằng cách pha một loạt hỗn dịch chủng có nồng độ giảm dần. Tiến hành quy trình

phân tích và xác định nồng độ hỗn dịch nhỏ nhất còn lên kết quả phản ứng PCR.

Quy trình được tiến hành như sau:

- Tăng sinh chủng chuẩn B. longum JCM 1217 trong môi trường MRS lỏng

sau 48 giờ trong điều kiện kỵ khí, đem ly tâm 3000 - 4000 vòng/phút trong



43

15 phút. Bỏ dịch nổi thu lấy cắn. Thêm vào ống nghiệm 2ml dung dịch

nước muối sinh lý 0,9 % vô khuẩn trộn đều.

- Chuẩn bị một dãy ống nghiệm thủy tinh vô trùng, mỗi ống chứa 9 ml nước

muối sinh lý 0,9 % vô khuẩn. Lấy 1ml hỗn dịch chủng ở trên thêm vào một

ống nghiệm ở trên, lắc đều thu được hỗn địch có độ pha loãng 10 -1. Tiếp tục

pha loãng như vậy đến độ pha loãng 10-8.

- Lấy các ống nghiệm có độ pha loãng 10-6, 10-7, 10-8, với mỗi độ pha loãng

đếm số lượng vi khuẩn trên 2 đĩa. Cấy vào mỗi đĩa petri vô trùng 1ml hỗn

dịch chủng ở độ pha loãng 10-6, 10-7, 10-8, thêm vào từng đĩa 15-20ml môi

trường BSM agar vô trùng đã làm nguội đến 45-500

C. Ủ ở 36-38o

C trongđiều kiện kỵ khí. Sau 48 giờ đem ra đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa (chỉ

đếm đĩa có 25-250 khuẩn lạc).

- Các ống hỗn dịch chủng trên được bảo quản ở 2-80C.

- Xác định số lượng vi khuẩn trong các ống pha loãng

X= ((N1 + N2)/2) x k

Tr ong đó: N1, N2: số khuẩn lạc trên từng đĩa.

k: hệ số pha loãng tương ứng.

- Sau khi xác định được nồng độ của các chủng trong các ống hỗn dịch, tiến

hành tách DNA theo quy trình ghi ở trong mục 2.3.3.2, thực hiện phản ứng

PCR với thành phần và chu trình nhiệt như trong mục 2.3.3.6 . Điện di sản

phẩm trên gel agarose, xác định ống pha loãng cuối cùng còn lên phản ứng

PCR chính là độ nhạy của phương pháp.

+ Đánh giá chất lượng của sản phẩm PCR



44

Bảng 2.11. Tiêu chuẩn đánh giá chất lượ ng của sản phẩ m PCR

Tính chất băng điện di trên bản gel chạy điện di Đánh giá kết quả

Không có băng (-)

Băng DNA mờ hoặc chấm hạt thẳng hàng (+)

Băng DNA nhỏ hoặc vừa, quan sát rõ (++)

Băng DNA lớ n, đậm, quan sát r ất rõ (+++)

2.3.5. Ứ ng dụng quy trình chuẩn để định lƣợng và định tính B. longum

trong các chế phẩm probiotics đang lƣu hành trên thị trƣờ ng

Tiến hành định lượng, định tính B. longum trong các chế phẩm probiotics

được liệt kê trong phần đối tượng nghiên cứu theo quy trình đã xây dựng (Phụ lục

12). Khi tiến hành phản ứng PCR thí nghiệm được bố trí như sau:

- Một ống phản ứng PCR với DNA khuôn tách từ mẫu.

- Một ống phản ứng PCR với DNA khuôn của loài vi khuẩn chuẩn tương ứng

(chứng dương tính)

- Một ống phản ứng PCR với nước cất siêu tinh khiết thay thế cho phần dung

dịch ADN khuôn (chứng âm tính)



45

CHƯƠNG 3. KẾT QU Ả NGHIÊN CỨU

3.1. XÁC ĐỊNH SỐ LƢỢ NG VI SINH VẬT TRONG CHẾ PHẨMPROBIOTICS

Định lượng vi sinh vật trong các mẫu A, B, C, D, E bằng phương pháp ghi ở

mục 2.3.1. Kết quả được ghi trong Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Số lượng vi sinh vật trong chế phẩm

Stt MẪU Kết quả

(CFU/gói)

1 A

1, 17 108CFU/gói

(117,0% so với lượng ghi trên nhãn)

2 B

0,86 108 CFU/gói

(86,0% so với lượng ghi trên nhãn)

3 C 7,32 X 106 CFU/gói

4 D 2,83 x 108CFU/gói

5 E 3,22 x 108CFU/gói

Từ kết quả ở bảng trên cho thấy, mẫu A hàm lượng B. longum so với lượng

ghi trên nhãn là 117,0% do đó đạt chỉ tiêu về định lượng, mẫu B số lượng B.

longum chỉ được 86,0% so với lượng ghi trên nhãn. Các mẫu C, D, E do không có

yêu cầu về số lượng B. longum mà nhà sản xuất chỉ công bố tổng số lượng các vi

sinh vật trong hỗn hợp là 108CFU, do đó không kết luận. Trong trường hợp này việc

sử dụng môi trường BSM agar nhằm mục đích phân lập khuẩn lạc thuần khiết để

định danh B. longum.



46

3.2. ĐỊNH DANH VI SINH VẬT BẰNG KIT API 20A

Tiến hành định danh vi sinh vật bằng kit API 20A trong các đã nêu trong phần

đối tượng nghiên cứu bằng phương pháp ghi ở mục 2.3.2.

K ết quả định danh bằng kit API 20A đượ c ghi lại trong Hình 3.1, Hình 3.2,

Hình 3.3, Hình 3.4, Hình 3.5, Hình 3.6, Phụ lục 1, Phụ lục 2, Phụ lục 3, Phụ lục

4, Phụ lục 5, Bảng 3.2 và Bảng 3.3

Hình 3.1. Định danh vi sinh vật trong mẫu A bằng kit API 20 A

Hình 3.2. Định danh vi sinh vật trong mẫu B bằng kit API 20A



47

Hình 3.3. Định danh vi sinh vật trong mẫu C bằng kit API 20 A

Hình 3.4. Định danh vi sinh vật trong mẫu D bằng kit API 20A

Hình 3.5. Định danh vi sinh vật trong mẫu E bằng kit API 20A



48

Hình 3.6. Quan sát giếng ESC dưới đèn UV ở bước sóng 365nm.

Bảng 3.2. Theo dõi phản ứng định danh vi sinh vật bằng kit API 20A

Mẫu A Mẫu B Mẫu C Mẫu D Mẫu E

TT Giếng Chất nền

1 IND L-tryptophane - - - - -

2 URE Urea - - - - -

3 GLU D-glucose + + + + +

4 MAN D-mannitol + + + + +

5 LAC D-lactose + + + + +

6 SAC D-saccharose + + + + +

7 MAL D-maltose + + + + +



49

8 SAL Salicin + + + + +

9 XYL D-xylose - - - - -

10 ARA L-arabinose + + + + +

11 GEL Gelatin - - - - -

12 ESC Esculin ferric

citrate

+ + + + +

13 GLY Glycerol - - - - -

14 CEL D-cellobiose + + + + +

15 MNE D-mannose + + + + +

16 MLZ D-melezitose - - - - -

17 RAF D-raffinose - + + - +

18 SOR D-sorbitol - - - - -

19 RHA L-rhamnose - - - - -

20 TRE D-trehalose - - - - -

CAT (catalase) - - - - -

Bào tử - - - - -

Gram + + + + +

Hình cầu - - - - -



50

Bảng 3.3. K ế t quả định danh vi sinh vật bằ ng phần mề m Apiweb

Stt Tên mẫu K ết quả định danh Độ tin cậy Phản ứ ng nghi ngờ

1 A Bifidobacterium spp1 94,3% RAF 91%

Actinomyces israelii 4,5% XYL 99%, RAF

82%, TRE 90%

2 B

Bifidobacterium spp1 97,1%

Actinomyces israelii2,2%

XYL 99%, RAF

82%,

3 C Bifidobacterium spp1 97,1%

Actinomyces israelii 2,2% XYL 99%, RAF

82%,

4 D

Bifidobacterium spp1 94,3% RAF 91%

Actinomyces israelii4,5% XYL 99%, RAF

82%, TRE 90%

5 E Bifidobacterium spp1 97,1%

Actinomyces israelii2,2% XYL 99%, RAF

82%,

Từ kết quả trên cho thấy các vi sinh vật phân lập từ các mẫu A, B, C, D, E đều

thuộc chi Bifidobacterium với % ID cao (>90%).



51

3.3. K ẾT QUẢ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT TRONG CÁC MẪU BẰNG

K Ỹ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ

3.3.1. K ết quả tách DNA3.3.1.1 Tách DNA bằ ng Wizard R Genomic DNA Purification kit của hãng

Promega

Tiến hành tăng sinh chủng B. longum chuẩn và các vi sinh vật trong các mẫu

probiotics trong phần đối tượng nghiên cứu phân lập được ở mục 3.1, tiến hành tách

DNA theo hướng dẫn tại mục 2.3.3.2. Tiến hành đo quang các dung dịch DNA mới

tách theo mô tả trong mục 2.3.3.3 và pha loãng các dung dịch DNA bằng nước cất

siêu tinh khiết vô khuẩn để thu được dung dịch DNA có nồng độ 50 ng/µl.

Bảng 3.4. Kết quả đo quang các dung dịch DNA mới tách

Đối tƣợng Atn Nồng độ dung dịch

DNA (ng/µl)

B. longum 0,1125 562,5

Mẫu A 0,0911 455,5

Mẫu B 0,0956 478Mẫu C 0,1174 587

Mẫu D 0,0851 425,5

Mẫu E 0,1052 526

3.3.1.2. Kiể m tra khả năng tách DNA

Sau khi tách DNA, các dung dịch DNA được pha loãng tới nồng độ thích hợp.

Kiểm tra sản phẩm DNA đã tách bằng bằng phản ứng PCR nhân bản đoạn gen 16S

rDNA của vi khuẩn, với thành phần và chu trình như trong mục 2.3.3.5. Sản phẩm

PCR được điện di kiểm tra trên bản gel agarose 1%. Kết quả được trình bày ở Hình

3.7



52

Từ Hình 3.7 cho thấy, phản ứng PCR nhân bản đoạn gen 16S rDNA đặc hiệuđều cho các băng nhân bản kích thước 1500 bp, trong khi ở mẫu chứng âm (không

có DNA) không xuất hiện băng nhân bản nào. Kết quả này cho thấy đã thu được các

khuôn DNA của các đối tượng nghiên cứu. DNA sau khi tách chiết được bảo quản ở

-200C để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.3.2. Nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các đối tƣợ ng vi sinh vật thuộc

đối tƣợ ng nghiên cứ uSử dụng cặp mồi BlonF /BlonR để nhân bản các đoạn gen của các đối tượng

nghiên cứu đã tách được ở trên (mục 3.3.1.1).

Thành phần của phản ứng PCR được ghi lại tại Bảng 3.5

M 1 2 3 4 5 6 7

1500bp

Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen 16S rDNA bằng

cặp mồi ID16R08F & IDL16R09R

M: Marker 100 bp (Invitrogen)

Giếng 1: Khuôn là DNA tách chiết từ hỗn dịch B. longum JCM 1217

Giếng 2: Chứng âm ( Khuôn là nước cất)

Giếng 3-7: Khuôn là DNA tách chiết từ hỗn dịch tăng sinh từ khuẩn lạc phân

lập từ các mẫu A, B, C, D và E.



53

Bảng 3.5. Thành phần của phản ứng PCR

STT Thành phần Thể tích ( l)

1 Đệm PCR(10X) 2,52 dNTPs (2mM) 2,5


4 Mồi xuôi (10 pmol) 1

5 Mồi ngược (10 pmol) 1

6

Taq DNA polymerase

(5u/ l)

0,1



Tổng thể tích phản ứng 25

Vớ i thành phần như trên tiến hành phản ứng PCR vớ i chu trình nhiệt:

94oC – 45 giây

94oC – 5 phút 56oC – 45 giây x 30 chu kỳ 72oC - 5 phút 4oC – ∞

72oC – 30 giây

K ết quả phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1% và đượ c ghi lại k ết

quả bằng máy chụ p ảnh bản gel UVDI-312 (Hình 3.8)



54

Kết quả thu được ở Hình 3.8 cho thấy với chu trình nhiệt và thành phần phản

ứng như trên, với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi BlonF/BlonR , chúng tôi đã thu

được băng nhân bản có kích thước khoảng hơn 800 bp ở giếng với khuôn là DNA

tách chiết từ chủng chuẩn B. longum JCM1217 (giếng 1). Kích thước băng này hoàn

toàn phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết của B. longum là 831 bp. Trong khi

đó, chúng tôi không thu được băng nhân bản nào ở mẫu không chứa DNA (chứng

âm-giếng 2).

Như vậy, kết quả thí nghiệm thu được cho phép khẳng định với cặp mồi

BlonF/BlonR chúng tôi đã nhân bản thành công đoạn gen đặc hiệu tương ứng của B.

longum.

Với các giếng từ 3-7 có khuôn là DNA tách từ các vi sinh vật phân lập được

từ các mẫu đã nêu trong phần đối tượng nghiên cứu, cũng đều cho băng nhân bản có

kích thước khoảng 831 bp, tương ứng với với băng nhân bản với khuôn là DNA của

B. longum JCM 1217 . Điều này bước đầu đã khẳng định các vi sinh vật phân lập từ

các mẫu này là B. longum.

Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu của

B. longum bằng cặp mồi BlonF/BlonR

M: Marker 100 bp ( Invitrogen)Giếng 1: Khuôn là DNA tách chiết từ hỗn dịch B. longum JCM 1217 Giếng 2: Chứng âm ( Khuôn là nước cất không chứa DNA) Giếng 3-7: Khuôn là DNA tách chiết từ hỗn dịch tăng sinh từ khuẩn lạc phânlập được từ các mẫu A, B, C, D và E.

800 bp

M 1 2 3 4 5 6 7



55

3.3.3. Nhân dòng và giải trình tự

3.3.3.1.Tinh sạch sản phẩ m PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các vi

sinh vật phân l ậ p t ừ các mẫ u nghiên cứ u bằ ng bộ kit FermentasSử dụng 5 mẫu DNA là sản phẩm nhân bản đoạn gen đặc hiệu của các đối

tượng nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR để làm nguyên liệu cho thí nghiệm nhân dòng

gen.

Sản phẩm PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu được điện di trên gel agarose

1%, kết quả chúng tôi đã thu được băng DNA có kích thước 831 bp. Các băng DNA

này được cắt chính xác khỏi bản gel agarose và tinh sạch bằng bộ kit GenJETTM Gel

Extraction (Fermentas) theo quy trình của nhà sản xuất nhằm loại bỏ toàn bộ cácthành phần dư thừa của phản ứng PCR. Sản phẩm DNA tinh sạch tiếp tục được điện

di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả chúng tôi thu được trên Hình 3.9 cho thấy

chúng tôi đã thu được sản phẩm DNA hoàn toàn tinh sạch, có kích thước 831 bp.

Hình 3.9. Kết quả điện di mẫu tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các đoạn gen đặchiệu phân lập từ các mẫu nghiên cứu trên gel agarose 1%.

M: Marker 100 bp ( Promega )

Giếng 1-5: Sản phẩm PCR tinh sạch của các mẫu nghiên cứu

Các sản phẩm PCR tinh sạch nhân bản 5 đoạn gen đặc hiệu được bảo quản ở -

20oC để sử dụng cho thí nghiệm nhân dòng tiếp theo.

831 b

M 1 2 3 4 5 M



56

3.3.3.2. Nhân dòng các đoạn gen đặc hiệu vào vector nhân dòng và biế n nạ p vào

t ế bào E. coli chủng DH5α

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã dòng hóa 5 đoạn gen đặc hiệu trên vào

vector nhân dòng pGEMT-easy. Vector nhân dòng này được thiết kế có chứa điểm

khởi đầu sao chép nên có khả năng sao chép độc lập với hệ gen của tế bào chủ E.

coli, đồng thời chứa gen chỉ thị kháng kháng sinh Ampicillin, cho phép chọn lọc các

thể biến nạp mang vector này trên môi trường nuôi cấy có Ampicillin. Ngoài ra,

vector nhân dòng còn chứa gen chọn lọc giúp phân biệt các thể biến nạp mang

plasmid tái tổ hợp và plasmid tự đóng vòng.

Hình 3.10. Sơ đồ vector nhân dòng pGEMT - Easy

Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector nhân dòng được thực hiện theo quy

trình kèm theo của nhà sản xuất. Hỗn hợp phản ứng gắn đầu bằng sau đó được

chúng tôi biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α bằng phương pháp sốc

nhiệt. Kết quả biến nạp sản phẩm PCR vào tế bào E. coli trên Hình 3.11 cho thấy

chúng tôi đã thu được nhiều khuẩn lạc trắng (có khả năng mang vector tái tổ hợp)

trên môi trường chọn lọc có bổ sung ampiciline 100 µg/m l, phủ trên bề mặt cơ chấtX-gal (20 l, nồng độ 20 mg/ml) và IPTG (20 l, nồng độ 100mM )



57

Hình 3.11. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn vào vi khuẩn E. coli DH 5α và

cấy trải trên môi trường nuôi cấy có bổ sung ampicillin 100 µg/ml , phủ trên bề mặtcơ chất X -gal (20 l, nồng độ 20 mg/ml) và IPTG (20 l, nồng độ 100mM )

3.3.3.3. Kiể m tra sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu trong plasmid tái t ổ hợ p

Để tiếp tục khẳng định sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu trong vector nhân

dòng, đối với mỗi mẫu, chúng tôi chọn 1 khuẩn lạc dương tính (có màu trắng) để

tinh sạch plasmid và kiểm tra plasmid này bằng PCR và phản ứng cắt enzyme giới

hạn.

a/ Kiểm tra sự có mặt các phân đoạn

Khuẩn lạc dương tính được nuôi cấy và tách chiết plasmid theo quy trình tách

chiết plasmid như mô tả ở mục 2.3.3.7 c. Sản phẩm DNA tinh sạch được chúng tôi

sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với hai cặp mồi khác nhau: cặp mồi đặc hiệu

Blon F/Blon R và cặp mồi đặc hiệu của vector. Trong đó, cặp mồi vector là hai trình

tự nằm trên vector nhân dòng, có khoảng cách khoảng 186 bp.



58

Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang các

đoạn gen có kích thước 831 bp


Giếng 1-7 : sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu BlonF/BlonR.

Giếng 8-14: sản phẩm PCR với cặp mồi vector

Giếng 1: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của B. longum JCM 1217

Giếng 2,9: đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn.Giếng 3-7; 10-14: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của các plasmid tái tổ hợp

mang các đoạn gen có kích thước 831bp.

Giếng 8: sản phẩm PCR với khuôn là vector nhân dòng nguyên bản tách từ khuẩn

lạc xanh

K ết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% ở Hình 3.12 cho thấy sản

phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu có kích thước khoảng 831 bp ( giếng 1, 3-7), tương

ứng với kích thước tính toán lí thuyết của đoạn gen đặc hiệu của các loài B. longum.

Sản phẩm PCR với cặp mồi vector và khuôn là plasmid tách từ khuẩn lạc xanh cho

một băng điện di với kích thước khoảng 186 bp, tương ứng với kích thước theo tính

toán lý thuyết (giếng 8). Sản phẩm PCR với cặp mồi vector khi điện di trên gel

agarose 1% cho một băng có kích thước khoảng 1017bp ( giếng 10-14), kích thước

này phù hợp với kích thước đoạn DNA theo tính toán lý thuyết cộng với 186 bp của

plasmid. Đối với các phản ứng đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn, chúng tôi

1017bp831 bp

M 1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 13 14



59

không thu được băng DNA nào (giếng 2, 9). Kết quả này cho phép chúng tôi khẳng

định plasmid tinh sạch được là plasmid tái tổ hợp mang các đoạn gen phân lập được

từ genome của loài B. longum

với enzyme cắt giới hạn

Để khẳng định chắc chắn đoạn DNA đã được chèn vào vector nhân dòng là

đoạn gen có kích thước 831bp, chúng tôi tiến hành thí nghiệm cắt giới hạn plasmid

tái tổ hợp đã được tinh sạch từ khuẩn lạc dương tính. Theo lý thuyết, trên vector

pGEMT Easy (Hình 3.10) có hai vị trí cắt giới hạn của EcoRI nằm trong vùng đa

điểm cắt. Như vậy, khi được xử lí bằng EcoRI vector tái tổ hợp sẽ bị cắt thành 2

đoạn DNA, một đoạn chính là các đoạn gen được chèn vào và một đoạn là bộ khung

vector có kích thước 3 kb.

Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp mang các

phân đoạn 831 bp bằng enzyme EcoRI.

M1:Marker 1000 bp (Fermentas)

M2: Marker 100 bp (Promega)

Giếng 1, 3, 5, 7, 9, 11, 12: vector tái tổ hợp nguyên bản;

Giếng 2, 4, 6,8,10: sản phẩm cắt giới hạn.

M1 M2 1 2 M2 3 4 M2 5 6 M2 M2 7 8 M2 9 10 M2 11 12 M1

KL xanh

831 831 831831 831

3000

3000



60

K ết quả thu được trên Hình 3.13 cho thấy các sản phẩm cắt vector tái tố hợp

mang các đoạn gen đích của các đối tượng nghiên cứu xuất hiện 2 băng DNA

(giếng 2, 4, 6, 8, 10): trong đó băng DNA 3 kb là bộ khung nguyên bản của vector,

và các đoạn DNA kích thước 831bp là kích thước tương ứng của đoạn gen đặc hiệu

nhân bản từ hệ gen B. longum theo tính toán lí thuyết. Kết quả thu được ở trên cho

phép chúng tôi khẳng định chắc chắn hơn việc nhân dòng thành công các đoạn gen

phân lập được từ genome của các loài phân lập từ đối tượng nghiên cứu của đề tài.

Các vector nhân dòng mang các đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng nghiên

cứu được tinh sạch và bảo quản ở -20oC. Các dòng tế bào E. coli mang các vector

tái hợp chứa các đoạn gen này được giữ trong glycerol 25% và bảo quản ở -80o

C.3.3.3.4. Giải trình t ự mẫ u chứa phân đoạn 831 bp

Để khẳng định DNA tách chiết được từ các mẫu trong phần đối tượng nghiên

cứu có đúng là của loài B. longum hay không, chúng tôi đã tiến hành nhân bản

đoạn gen 831 bp bằng quy trình đã thiết lập, nhân dòng đoạn gen này vào vector

nhân dòng. Sản phẩm vector nhân dòng mang đoạn gen đặc hiệu 831 bp được gửi đi

giải trình tự.

Kết quả giải trình tự của mẫu C như sau:

GAAGGAATCCAACGCGTTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCA

GGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTTTCCAGTTGATCGCATGGTCT

TCTGGGAAAGCTTTCGCGGTATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGC

TTGACGGCGGGGTAACGGCCCACCGTGGCTTCGACGGGTAGCCGG

CCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGA

CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGT

AAACCTCTTTTATCGGGGAGCAAGCGAGAGTGAGTTTACCCGTTGA

ATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAG

GGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGC

GGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCC

GCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAAT

TCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAA



61

TGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAA

AGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG

TATACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTGT

CGGAGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAA

GGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAGCGGGCGGA

GCATGCGGAATTATTCGATGCAACGCGAAGAACCCTTACCCTGGGG

CTTGACATGTTTCCCGGACGGTTGGTTAGAAGAATAACGGGC

Kết quả giải trình tự trên được chúng tôi tiến hành so sánh trình tự với các

trình tự khác trên ngân hàng gen thế giới bằng ứng dụng BLAST ( Basic Local

Alignmen CSearch Tool ) trên trang web của NCBI ( National Center forBiotechnology Information-http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) [37].

Kết quả blast khẳng định đoạn gen nhân bản được chính là đoạn gen được

phân lập từ hệ gen của Bifidobacterium longum.

https://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&ved=0CC8QFjAB&url=http%3A%2F%2Fwww.ncbi.nlm.nih.gov%2FBLAST%2F&ei=xolVU69LyY6KB8D-gOgB&usg=AFQjCNGLvBqs59DIHSNHwhJ_I0n1p8CotA






https://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=4&ved=0CEAQFjAD&url=http%3A%2F%2Fwww.ncbi.nlm.nih.gov%2F&ei=xolVU69LyY6KB8D-gOgB&usg=AFQjCNEtxijk1bbk_J3zghYe8TRBijQ4rw










62

Kết quả giải trình tự đều cho thấy cả 5 mẫu nghiên cứu đều chứa B. longum.

Kết quả giải trình tự của các mẫu A, B, D và E được trình bày ở Phụ lục 7, Phụ lục

8, Phụ lục 9 và Phụ lục 10.

3.4. ĐÁNH GIÁ PHƢƠNG PHÁP

3.4.1. K ết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trƣờng định lƣợ ng BSM agar

Tiến hành kiểm tra tính chọn lọc được mô tả tr ong mục 2.3.4.1a. Kết quả thử

nghiệm được trình bày ở Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Kết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trường BSM agar

STT Tên chủng

Môi trƣờng BSM agar (số

lƣợng khuẩn lạc trên đĩa)

Môi trƣờng MRS agar

(số lƣợng khuẩn lạc trên

đĩa)

10-5 10-6 10-7 10-5 10-6 10-7

1 Lactobacillus

rhamnosus ATCC 9595

Không

mọc

Không

mọc

Không

mọc

Nhiều 45 +37 4 +3

2 Lactobacillus ATCC

4356

Không

mọc

Không

mọc

Không

mọc

Nhiều 40+ 50 2+4

3 Lactobacillus plantarum

ATCC 8014

Không

mọc

Không

mọc

Không

mọc

Nhiều 35+29 2+2

4 Lactobacillus casei

ATCC 334

Không

mọc

Không

mọc

Không

mọc

Nhiều 48 +39 3+5

5 Lactobacillus fermentum ATCC 9338

Khôngmọc

Khôngmọc

Khôngmọc

Nhiều 37+ 46 3+3

6 Streptococcus faecalis

ATCC 33186

Không

mọc

Không

mọc

Không

mọc

Nhiều 50 +57 5+4

7 Bifidobacterium longum

JCM 1217

Nhiều 45 +34 3 +4 Nhiều 48+ 38 4+4



63

Từ kết quả Bảng 3.6 cho thấy các chủng thuộc chi Lactobacillus và

Streptococcus faecalis không phát triển được trên môi trường BSM agar, trong khi

đó vẫn mọc tốt trên môi trường MRS agar. B. longum mọc tốt trên cả hai môi

trường MRS agar và BSM agar. Như vậy chứng tỏ môi trường BSM agar có tính

chọn lọc cao, thích hợp để định lượng và phân lập riêng B. longum trong hỗn hợp vi

sinh vật đã được nêu trong phần đối tượng nghiên cứu. Trên môi trường MRS agar

khuẩn lạc của B. longum có màu trắng, còn trên môi trường BSM agar khuẩn lạc

của B. longum có màu tím đỏ rất thuận tiện cho việc nhận biết và đếm khuẩn lạc

Hình 3.14. Hình thái khuẩn lạc B. longum trên môi trường BSM agar

3.4.2. Độ lặp lại của phép định lƣợ ng

Tiến hành phép thử định lượng như đã mô tả ở mục 2.3.1. Tiến hành định

lượng lặp lại 10 lần. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.7



64

Bảng 3. 7. Kết quả đếm số lượng vi khuẩn trong mẫu A

Áp dụng công thức tính đã trình bày ở mục 2.3.4.1 ta được Sr = 0,04.

Vậy Sr < 0,25. Như vậy phương pháp định lượng B. longum trong đề tài này có độ lặp lại

chấp nhận được đối với phương pháp đếm vi sinh vật.

3.4.3. Thẩm định độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng kit

API 20A

Tiến hành định tính chủng vi sinh vật chuẩn B. longum bằng API kit theo

phương pháp ghi trong mục 2.3.2. Kết quả định danh được trình bày ở Hình 3.15 vàPhụ lục 6 .

Lần Nồng độ 10-6

TB CFU/góiĐĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 3 Lần 1 30 36 27 31 96x10

Lần 2 29 40 42 37 114x106

Lần 3 34 38 47 40 124x106

Lần 4 30 35 42 36 111x106

Lần 5 41 31 31 34 105x10

Lần 6 48 33 36 39 120x106

Lần 7 40 30 36 35 108x106

Lần 8 29 39 31 33 102x106

Lần 9 31 35 43 36 111x10

Lần 10 37 30 28 32 99x106



65

Hình 3.15. Định danh B. l ongum JCM 1217 bằng kit Api 20A

Kết quả định danh cho thấy vi sinh vật thuộc chi Bifidobacterium với % ID là97,1%

Như vậy phương pháp định tính vi sinh vật đến chi Bifidobacterium bằng kit

Api 20A có độ đặc hiệu cao.

3.4.4. Đánh giá độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng k ỹ

thuật PCR

Tiến hành quy trình đánh giá độ đặc hiệu như trong mục 2.3.4.3 a. Kết quảkiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi trên 20 loài chủng vi sinh vật chuẩn được trình

bày ở Bảng 3.8 và Hình 3.16



66

Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi Blon F/Blon R trên 20 chủng

TT Tên chủng Kết quả

PCR

TT Tên chủng Kết

quảPCR

1 Bacillus cereus ATCC

11778

- 11 Lactobacillus fermentum

ATCC 9338

-

2 Bacillus pumilus ATCC

14884

- 12 Lactobacillus plantarum

ATCC 8014

-

3 Bacillus

stearothermophilis

ATCC 795

- 13 Bifidobacterium breve

ATCC 15700

-

4 Bacillus subtilis ATCC

6633

- 14 Bifidobacterium bifidum

ATCC11863

-

5 Lactobacillus rhamnosus

ATCC 9595

- 15 Streptococcus faecalis

ATCC 33186

-

6 Lactobacillus casei

ATCC 334

- 16 Streptococcus pyogenes

ATCC 19615

-

7 Lactobacillus

acidophilus ATCC 4356

- 17 Pseudomonas

aeruginosa ATCC 9027

-

8 Bacillus coagulans

ATCC 7050 - 18 Escherichia coli

ATCC8739 -

9 Bifidobacterium longum

JCM 1217

+ 19 Staphylococcus aureus

ATCC6538

-

10 Lactobacillus

leichmannii ATCC 7830

- 20 Salmonella typhimurium

ATCC 14028

-



67

Ghi chú: (-): Kết quả PCR âm tính: không xuất hiện băng nhân bản.

(+): Kết quả PCR dương tính: xuất hiện băng nhân bản

Kết quả trên cho thấy, với cặp mồi Blon F/ Blon R quy trình PCR nhân bản

đoạn gen đặc hiệu chỉ cho kết quả PCR dương tính với khuôn là DNA của loài

B. longum trong khi 19 loài vi sinh vật dùng để kiểm tra độ đặc hiệu còn lại đều có

kết quả PCR âm tính.

*Tính độ đặc hiệu:

Áp dụng vào công thức

Phép thử Chủng chuẩn

Cộng Dương tính Âm tính

Kỹ thuật PCR Dương tính a (1) b (0) a+b

Âm tính c (0) d (19) c+d

Cộng a+c b+d a+b+c+d

* Độ đặc hiệu = số trường hợp âm tính thật/(số trường hợp âm tính thật +số trường

hợp dương tính giả) = d/(d+b)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M 14 15 16 17 18 19 20

831bp

Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ đặc hiệu của cặp

mồi nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B.longum

M: Marker 100 bp

Giếng 1,14: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của B. longum JCM 1217

Giếng 2-13,15-20: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của 19 loài vi khuẩn

khác được trình bày ở Bảng 3.8



68

Trong đó: d: số trường hợp âm tính thật = 19 (19 mẫu không phải là loài B.

longum đều có kết quả PCR âm tính).

b: số trường hợp dương tính giả = 0 ( các chủng vi sinh vật đều là chủngchuẩn, đã được chứng nhận có nguồn gốc rõ ràng. Không có chủng vi sinh

vật khác ngoài B. longum JCM 1217 có kết quả PCR dương tính)

Như vậy, độ đặc hiệu của cặp mồi BlonF/BlonR cũng như quy trình đã thiết

lập để nhân bản đoạn gen đặc hiệu cho loài B. longum là: 19/(19+0)= 1

(100%)

Kết luận: Với các thành phần phản ứng, quy trình đã thiết lập và cặp mồi đã

thiết kế, chúng tôi đã nhân bản thành công đoạn gen đặc hiệu cho đối tượng nghiên

cứu. Trong khuôn khổ của đề tài nghiên cứu, quy trình đạt độ đặc hiệu rất cao

(100%).

3.4.5. Xác định ngƣỡ ng phát hiện của quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu

của B. longum bằng cặp mồi đặc hiệu.

Tiến hành quy trình xác định ngưỡng phát hiện như mô tả ở mục 2.3.4.3 b. Kết

quả đếm số lượng hỗn dịch B. longum chuẩn được ghi tại bảng như sau.

Bảng 3.9. Kết quả đếm số lượng vi khuẩn B. longum

Độ pha loãng 10-6 10-7 10-8

Đĩa 1(CFU/đĩa) Nhiều 115 9

Đĩa 2 (CFU/đĩa) Nhiều 127 7

Trung bình 121Dd D (CFU/ml) 1,21 x 10

Từ hỗn dịch D trên pha loãng thành một dãy các dung dịch có nồng độ

109CFU/ml, 108 CFU/ml, 107 CFU/ml, 106 CFU/ml, 105 CFU/ml và 104CFU/ml.

Tách chiết DNA từ các hỗn dịch này theo quy trình được trình bày ở mục

2.3.3.2. Tiến hành phản ứng PCR đơn mồi với khuôn là các DNA tách được từ hỗn

dịch ở trên. Sau đó điện di trên gel agarose 1%. Kết quả thu được như sau



69

Bảng 3.10. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện

Nồng độ vi khuẩn Kết quả PCR trong các lần thử

Trong hỗn

dịch trước khi

tách chiết

(CFU/ml)

Trong dịch

chiết DNA

(copy/µl)(*)

1 2 3

109 107 ++ ++ ++

108

106

++ ++ ++107 105 ++ ++ ++

10 10 ++ ++ +

105 103 + + +

104 102 - - -

(*) Vì DNA sau khi tách chiết được hòa trở lại trong 100 µl DNA Rehydration

Solution, nên số lượng bản copy của phân tử DNA trong dung dịch sau khi táchchiết sẽ giảm 100 lần so với số lượng vi khuẩn bắt đầu trong hỗn dịch trước khi

tách chiết.



70

Kết quả cho thấy:

- Ngưỡng phát hiện của quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu cho B. longum

là 105 CFU/ml vi khuẩn (tương ứng với khoảng 103copy/µl dùng làm khuôn

cho phản ứng PCR). Kết quả được thể hiện như Hình 3.17

M 1 2 3 4 5 6

831 bp

Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định ngưỡng phát hiện của

quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B.longum


Giếng 1-6: Sản phẩm PCR với khuôn là DNA tách chiết từ nồng độ chủng từ

109 CFU/ml vi khuẩn đến 104 CFU/ml vi khuẩn (tương ứng với khoảng 107

copy/ µl đến 102 copy/ µl dùng làm khuôn cho phản ứng PCR)



71

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN

Hiện nay, các chế phẩm probiotics lưu hành trên thị trườ ng hầu hết là các sản phẩm hỗn hợ p của nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Tuy nhiên các tiêu chuẩn cơ sở

do các nhà sản xuất đưa ra còn rất nhiều thiếu sót. Việc định lượ ng chỉ dừng lại ở

việc đếm tổng số vi sinh vật trong mẫu. Trong đa số các trườ ng hợp, định danh

còn r ất sơ sài, chỉ dừng lại ở phản ứng nhuộm soi và một vài phản ứng sinh hóa.

Do đó, nếu thực hiện theo tiêu chuẩn, r ất khó để k ết luận mẫu đạt hay không và sẽ

ảnh hưởng đến quyền lợ i của bệnh nhân. Xuất phát từ thực tế, nhu cầu cấ p thiết

đặt ra là phải nghiên cứu định lượng, định danh đến loài đối vớ i các vi sinh vật đãđượ c ghi trên nhãn của chế phẩm. Cùng vớ i sự phát triển của khoa học k ỹ thuật,

việc định danh vi sinh vật không chỉ bao gồm kiểu hình mà còn phải định danh

kiểu gen.

Nghiên cứu trước đây của Nguyễn Thị Thu Hườ ng [4] đã ứng dụng k ỹ thuật

PCR để định danh một số vi sinh vật thuộc chi Lactobacillus trong hỗn hợ p nhiều

vi sinh vật bằng cách tách chiết DNA tr ực tiế p từ mẫu. Trong nghiên cứu này, tác

giả đã thành công trong việc định danh đến loài một số Lactobacillus trong hỗn

hợ p gồm nhiều vi sinh vật thuộc chi Lactobaccillus mà bằng các phản ứng sinh

hoá không thể thực hiện đượ c. Tuy nhiên, nhược điểm của k ỹ thuật này là không

phân biệt đượ c vi khuẩn sống hay vi khuẩn chết. Với quy trình đã xây dựng đượ c

trong đề tài này, chúng tôi đã định lượng riêng đượ c B. longum trong hỗn hợ p

đồng thờ i phân lập đượ c khuẩn lạc thuần khiết để tiến hành định danh kiểu hình

bằng kit sinh hóa và định danh kiểu gen bằng k ỹ thuật PCR và giải trình tự. Do đósẽ khẳng định đượ c chắc chắn số lượ ng B. longum có mặt trong hỗn hợ p ở nồng độ

là bao nhiêu. Điều này r ất có ý nghĩa trong việc kiểm tra giám sát chất lượ ng

thuốc.

Ứ ng dụng quy trình đã thiết lập, chúng tôi đã kiểm tra đượ c một số mẫu lưu

hành trên thị trườ ng, khẳng định đượ c chắc chắn các sản phẩm này đều có chứa B.

longum như trên nhãn do nhà sản xuất công bố. Vớ i những mẫu probiotics mà nhà

sản xuất chỉ công bố tổng số lượ ng vi sinh vật trong hỗn hợ p (L-Bio-3D, Lackid,



72

Lactominplus ), việc sử dụng môi trường BSM agar để định lượ ng riêng B.longum

vẫn có ý nghĩa trong việc phân lập đượ c khuẩn lạc thuần khiết để định danh B.

longum .

Sử dụng kit Api 20A chỉ cho phép định danh đến chi Bifidobacterium, nhưng

theo quy định gần đây về tiêu chuẩn chất lượ ng probiotics [16], [10], [32] việc định

danh kiểu hình vẫn r ất cần thiết. Đồng thờ i, nghiên cứu sử dụng kit Api 20A cũng

cho phép định danh đến loài đối vớ i Bifidobacterium breve, Bifidobacterium

bifidum, Bifidobacterium adolescentis, và Bifidobacterium dentium bằng cách làm

thêm các test bổ sung. Các vi khuẩn này cũng hay đượ c dùng trong các chế phẩm

probiotic. Hơn nữa do không yêu cầu k ỹ thuật cao, chi phí r ẻ nên việc sử dụng kitApi 20A để định danh một số probiotics thuộc chi Bifidobacterium r ất dễ áp dụng ở

các trung tâm kiểm nghiệm thuốc và thực phẩm chức năng, nhằm góp phần vào

công tác kiểm tra chất lượ ng các chế phẩm probiotic ở địa phương.

Để định danh đến loài B. longum, công cụ hiệu quả nhất vẫn là k ỹ thuật PCR

và giải trình tự. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là có độ nhạy và độ chính

xác rất cao, vượt trội so với các phương pháp thông thường . Tuy nhiên, đây cũng

không phải là một phương pháp hoàn hảo vì vẫn có một số hạn chế: yêu cầu kỹ

thuật viên có trình độ cao, trang thiết bị hiện đại, đắt tiền, quy trình thực hiện phức

tạp không dễ áp dụng ở mọi phòng kiểm nghiệm. Mặc dù vậy, với những ưu điểm

vượt trội về độ nhạy, tính đặc hiệu cũng như khả năng xác định chính xác đến loài,

kỹ thuật PCR và giải trình tự ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong việc định

danh B. longum cũng như nhiều vi khẩn khác trong các chế phẩm probiotics, đặc

biệt là đối với những chế phẩm có chứa nhiều vi sinh vật thuộc chi Bifidobacterium.



73

KẾT LU ẬN VÀ KIẾN NGHỊ

K ẾT LUẬN:Từ những k ết quả thu đượ c trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã đạt đượ c

mục tiêu đề ra:

1. Đã xây dựng được quy trình định tính, định lượ ng B. longum trong hỗn hợ p

gồm nhiều vi sinh vật bằng việc sử dụng môi trườ ng BSM agar, kit API

20A, k ỹ thuật PCR và giải trình tự. Vớ i qui trình này, chúng tôi sẽ khẳng

định được chính xác đến loài B. longum vớ i số lượng là bao nhiêu. Điều này

r ất có ý nghĩa trong công tác kiểm tra giám sát chất lượ ng thuốc. Ứ ng dụng

đượ c quy trình nghiên cứu để định tính, định lượ ng B. longum trong một số

chế phẩm lưu hành trên thị trường như: Samubiothymo, Safikid BIO, L-

Bio-3D, Lackid và Lactomin plus.

2. Đã thẩm định được độ lặ p lại của phương pháp định lượng, độ đặc hiệu của

k ỹ thuật định danh bằng kit sinh hóa, độ nhạy, độ đặc hiệu của k ỹ thuật

định danh vi khuẩn bằng k ỹ thuật PCR đơn mồi và giải trình tự.

KIẾN NGHỊ:

Chúng tôi có một số kiến nghị sau:

1. Do gặp khó khăn trong việc mua đượ c hỗn dịch B. longum chuẩn có số

lượ ng biết trước, nên chúng tôi chưa thẩm định được độ đúng của phép định

lượng. Do đó tiếp theo đây chúng tôi sẽ tiế p tục tra cứu và đặt mua hỗn dịch

chuẩn này để thẩm định độ đúng.

2. Tiế p tục nghiên cứu quy trình định danh một số loài khác thuộc chi Bifidobacterium cũng hay đượ c sử dụng trong các chế phẩm probiotics như

Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium infantis...

bằng việc sử dụng kit API 20A cùng vớ i k ỹ thuật PCR và giải trình tự.

3. Tiế p tục nghiên cứu định tính, định lượ ng một số vi khuẩn probiotic đang

gặ p nhiều khó khăn trong công tác kiểm tra, giám sát chất lượng như

streptococcus faecalis, Enterococcus faecium...



74

TÀI LIỆU THAM KH ẢO

TIẾNG VIỆT 1. Công ty liên doanh Dược phẩm Mebiphar -Austrapharm (2007), Tiêu chuẩn

nhà sản xuất: Thuốc L-BIO-3D.

2. Công ty liên doanh Dược phẩm Mebiphar -Austrapharm (2007), Tiêu chuẩn

nhà sản xuất: Thuốc Lactomin plus.

3. Nguyễn Tr ọng Hiệ p, Bùi Tùng Hiệ p (2008), "Vi sinh vật trong chế phẩm

Probiotics", T ạ p chí Dượ c học, số 390, Bộ Y tế, Hà nội.

4. Nguyễn Thị Thu Hường (2012), Định tính một số loài thuộc chi Lactobacillus

trong chế phẩm probiotics lưu hành trên thị trường bằng kỹ thuật PCR, Hà

Nội

5. Tổng cụ đo lường Việt Nam (2008), TCVN 7849 :2008 Sữa và sản phẩm .

sữa. Định lượng Lactobacillus acidophilus giả định trên môi trường chọn

lọc, kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 37 0C.

6.

Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2006), Công nghệ sinh học, Nhà xuất bảnGiáo dục, tậ p 5, tr. 129-154.

7. Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 (2013), Định trị và tính

toán độ không đảm đo kết quả thử nghiệm vi sinh., Hồ Chí Minh.

8. Nguyễn Hùng Vân (2009), PCR và Realtime PCR. Các vấn đề cơ bản và các

áp dụng thường gặp. Nhà xuất bản Y học chi nhánh thành phố Hồ Chí Minh.

TIẾNG ANH 9. Akatsu H, Iwabuchi N, Xiao JZ, Matsuyama Z, Kurihara R, Okuda K,

Yamamoto T, Maruyama M (2012), “Clinical Effects of Probiotic

Bifidobacterium longum BB536 on Immune Function and Intestinal

Microbiota in Elderly Patients Receiving Enteral Tube Feeding”, JPEN J

Parenter Enteral Nutr , 37(5), p. 631-640.



75

10. Alschuler Lise (2011), “Ensuring Probiotics quality” , Natural medicine

journal , 3(10).

11. Amenta M, Cascio MT, Di Fiore P, Venturini I (2006), “Diet and chronic

constipation. Benefits of oral supplementation with symbiotic zir fos

( Bifidobacteriumlongum W11 + FOS Actilight)”, Actabiomed , 77(3), p.157-

162.

12. Bahaka D, Neut C, Khattabi A, Monget D, Gavini F (1993), “Phenotypic and

genomic analyses of human strains belonging or related to Bifidobacterium

longum, Bifidobacterium infantis and Bifidobacterium breve”, Int J Syst

Bacteriol, 43(3), p. 565-73.13. BioMerieux, Inc (2011), API 20A, France.

14. Ethiopian standard ES ISO 29981 (2012), Milk products Enumeration of

presumptive bifidobacteria Colonycount technique at 37 °C .

15. Hamaji Y, Fujimori M, Sasaki T, Matsuhashi H, Matsui-Seki K, Shimatani-

Shibata Y, Kano Y, Amano J and Taniguchi S (2007), “Strong Enhancement

of Recombinant Cytosine Deaminase Activity in Bifidobacterium longum for

Tumor-Targeting Enzyme/Prodrug Therapy”, Biosci. Biotechnol. Biochem,

71, p. 874-883.

16. Indian council of medical research (2011), Guidelines for the Evalution of

Probiotics in Food , Indian.

17. IOS/TS 19036 (2006), Microbiology of food and animal feeding stuffs –

Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative

determinations.

18. IOS/TS 4833 (2003), Microbiology of food and animal feeding stuffs –

Horizontal method for the enumeration of microorganisms – Colony – count

technique at 30oC.

19. Janet E L Corry, Gordon D W Curtis, Baird.R.M (2012), Handbook of

Culture Media for Food and Water Microbiology, 3rd Edition, Royal Society

of Chemistry, p. 199-221.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bahaka%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8347514

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Neut%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8347514

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Khattabi%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8347514

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Monget%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8347514

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gavini%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8347514

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8347514


http://www.jstage.jst.go.jp/article/bbb/71/4/71_874/_article
















http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gavini%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8347514

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Monget%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8347514

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Khattabi%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8347514

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Neut%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8347514

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bahaka%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8347514



76

20. Kwon HS, Yang EH, Yeon SW, Kang BH, Kim TY (2004), “Rapid

identification of probiotic Lactobacillus species by multiplex PCR using

species-specific primers based on the region extending from 16S rRNA

through 23S rRNA.”, FEMS Microbiology Letters, 239, p 267-275.

21. Lahtinen SJ, Gueimonde M, Ouwehand AC (2006), “Comparison of four

methods to enumerate probiotic bifidobacteria in a fermented food product”,

Food microbiology, 23, p. 571-577.

22. Matsuki T, Watanabe K, Tanaka R, Fukuda M and Oyaizu H (1999),

“Distribution of Bifidobacterial Species in Human Intestinal Microflora

Examined with 16S rRNA-Gene-Tareted Species –Specifics Primers”, Applied and Enviroment Microbiology, 65 (10), p. 4506-4512.

23. Promega Technical manual, pGEM-T and pGEM-T easy vector system, USA,

6/2009.

24. Schell MA, Karmirantzou M, Snel B, Vilanova D, Berger B, Pessi

G, Zwahlen MC, Desiere F, Bork P, Delley M, Pridmore RD, Arigoni F

(2002), “The genome sequence of Bifidobacterium longum reflects its

adaptation to the human gastrointestinal tract”, Proc Natl Acad Sci U SA

99(22), p. 14422-14427.

25. Simpson. P.J, Fitzgerald.G.F, Stanton.C, Ross.R.P (2004), “ The evaluation

of a mupirocin-based selective medium for the enumeration of bifidobacteria

from probiotic animal feed”, Journal of Microbiological Methods, 57(1), p. 9-

16.

26. Singh J, Rivenson. A, Tomita. M, Shimamura. S, Ishibashi. N, Reddy. B.S

(1997), “ Bifidobacterium longum, a lactic acid-producing intestinal bacterium

inhibits colon cancer and modulates the intermediate biomarkers of colon

carcinogenesis”, Carcinogenesis, 18(4), p.833 – 841.

27. Sul Sy, Kim HJ, Kim TW và Kim KY (2007), “Rapid Identification of

Lactobacillus and Bifidobacterium in Probiotic Products Using Multiplex

PCR ”, J. Microbiol. Biotechnol , 17 (3), p.490-495.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schell%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12381787


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Karmirantzou%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12381787



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Snel%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12381787



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Vilanova%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12381787



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Berger%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12381787



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pessi%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12381787




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Zwahlen%20MC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12381787



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Desiere%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12381787



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bork%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12381787



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Delley%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12381787



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pridmore%20RD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12381787



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Arigoni%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12381787



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Singh%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9111222

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rivenson%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9111222

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tomita%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9111222

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shimamura%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9111222

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ishibashi%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9111222

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Reddy%20BS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9111222

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Reddy%20BS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9111222

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ishibashi%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9111222

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shimamura%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9111222

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tomita%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9111222

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rivenson%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9111222

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Singh%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9111222
















77

28. Temmerman R, Pot B, Huys G, Swing J (2001), “A quality analysis of

commercial probiotic products”, BiomedExperts 66 (3b), p. 535, 537-542.

29. Tuomola E, Crittenden R, Playne M, Isolauri E, and Salminen S(2001),

"Quality assurance criteria for probiotic bacteria", The American Journal of

Clinical Nutrition, 73(2), p.393-398.

30. UELI VON AH (2006), Identification of Bifidobacterium thermophilum

RBL67 isolated from baby faeces and partial purification of its bacteriocin,

Zurich.

31. Wasilewska Ewa, Bielecka Maria, Markiewicz Lidia(2003), “Numerical

analaysis of biochemical and morphological features of bifidobacteria as atool for species characteristic and identification ”, Polish jounal of food and

nutrition sciences, 12(53), p 149-156.

32. World Health Organization (2002), “Guidelines for the Evalution of

Probiotics in Food ”, FAO of the United Nations.

33. Zinedine. A and Faid. M (2007), “Isolation and Characterization of Strains

of Bifidobacteria with Probiotic Proprieties In vitro”, World Journal of Dairy

& Food Sciences, 2(1), p. 28-34.

34. Zoppi G, Cinquetti M, Benini A, Bonamini and Minelli EB (2001),

"Modulation of the Intestinal Ecosystem by Probiotics and Lactulose in

children during treatment with Ceftiazone", Current Therapeutic Research,

62(5), p. 418 - 435.

35. http://www.questhealthlibrary.com/news/bifidobacterium-longum

36. http://www.powerofprobiotíc.com/Bifidobacterium.html

37. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

http://www.questhealthlibrary.com/news/bifidobacterium-longum


http://www.xn--powerofprobiotc-ipb.com/Bifidobacterium.html






PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Xử lý k ết quả định danh vi sinh vật trong chế phẩm

SamubioTHYMO (mẫu A) bằng phần mềm Apiweb

Phụ lục 2. Xử lý k ết quả định danh vi sinh vật trong chế phẩm Safikid

BIO (mẫu B) bằng phần mềm Apiweb

Phụ lục 3. Xử lý k ết quả định danh vi sinh vật trong chế phẩm L-Bio-3D

(mẫu C) bằng phần mềm Apiweb

Phụ lục 4. Xử lý k ết quả định danh vi sinh vật trong chế phẩm Lackid

(mẫu D) bằng phần mềm Apiweb

Phụ lục 5. Xử lý k ết quả định danh vi sinh vật trong chế phẩm Probiotic

Lactomin Plus (mẫu E) bằng phần mềm Apiweb

Phụ lục 6. Xử lý k ết quả định danh B. longum JCM 1217 bằng phần mềm

Apiweb

Phụ lục 7. K ết quả giải trình tự vi sinh vật trong chế phẩm

SamubioTHYMO (mẫu A)

Phụ lục 8. K ết quả giải trình tự vi sinh vật trong chế phẩm Safikid BIO(mẫu B)

Phụ lục 9. K ết quả giải trình tự vi sinh vật trong chế phẩm Lackid (mẫu

D)

Phụ lục 10. K ết quả giải trình tự vi sinh vật trong chế phẩm Probiotics

Lactomin Plus (mẫu E)

Phụ lục 11. Quy trình định lượng, định tính B. longum trong các chế phẩm

probiotics



Phụ lục 1



Phụ lục 2



Phụ lục 3



Phụ lục 4



Phụ lục 5



Phụ lục 6



Phụ lục 7

Kết quả giải trình tự của VSV phân lập từ mẫu SamubioTHYMO

CGGTTTGCATCCAACGCGTTGGTGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCA

GGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTTTCCAGTTGATCGCATGGTCTTCTG

GGAAAGCTTTCGCGGTATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCCGCTTGACGGCGGGGTAACGGCCCACCGTGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGG

CGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGG

CAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACG

CCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTATCGGGGA

GCAAGCGAGAGTGAGTTTACCCGTTGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG

CCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTG

GGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCAT

CGCTTAACGGTGGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAG

GGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGA

AGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC

GCCGTAGACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTG

TCGGAGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAGGGC

TAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGC

GGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTC

CCGACGGTCGTAGAGATACGGCTTCCCAATCGAATTCCCGCGGCCGCCA

TGGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCAGGCCCAATTCGCCCTATATGGAGGTCGTATTAAT



Kết quả so sánh trình tự đã giải với các trình tự trong ngân hàng gen thế giới bằng ứng dụng BLAST



Phụ lục 8

Kết quả giải trình tự của VSV phân lập từ mẫu Safikid BIO

CGCGGGTCTATGTGATCTTACAGTGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCG

GGAATTCGTATCTGGGAAGCCGTATCTCTACGACCGTCGGGAACATGTC

AAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCC

GTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTAGCTCCGACACGGAACCCG

TGGAACGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCA

GGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTA

ACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACAC

ATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCAAGCCC

GCCCGTACCCGGCGCGGATCCACCGTTAAGCGATGGACTTTCACACCGG

ACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAAC

GCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTG

CTTATTCAACGGGTAAACTCACTCTCGCTTGCTCCCCGATAAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTT

GCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGC

CGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGT

CGAAGCCACGGTGGGCCGTTACCCCGCCGTCAAGCGGATAGGACGCGA

CCCCATCCCATACCGCGAAAGCTTTCCCAGAAGACCATGCGATCAACTG

GAAAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAG

AGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATCTATAGTAGTCACCTAAAT



Kết quả so sánh trình tự đã giải với các trình tự trong ngân hàng gen thế giới bằng ứng dụng BLAST.



Phụ lục 9

Kết quả giải trình tự của VSV phân lập từ mẫu Lackid

TGGGTGGGTACACGCATTGGGAGGGTCCCACATGGCGACCTGCAGGCGT

CCGCGAATTCACAAATGATTTTCCAGTTGATCTTATGGTCTTCTGGGAAA

GCTTTCGCGGTATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCCGCTTGACGGCGGGGTAACGGCCCACCGTGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACC

GGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA

GTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCG

TGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTATCGGGGAGCAAG

CGAGAGTGAGTTTACCCGTTGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGC

AGCCGCGGTAATACGTAGGGTGGAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGT

AAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTT

AACGGTGGATCCGCGCCGGGTAAGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGA

GACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAAC

ACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGT

AAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTGTCGGA

GCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCGAGGCTAAA

ACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGAT

TAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTCCCGA

CGGTCGTAGAGATACGGCTTCCCAATCGAATTCCCGCGACCGCCATGGC

GGCCGGGAGCATGCGACGTCGGGCCCATTTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCC

TGGCGTTACCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTG

GCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCACAGTTGCGCA

GCCTGAATGGCGAATGGACGCGGCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGC

GGGGGGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCAGGGCCTAG

CGCCGCTCCTTTCCCTTTCTTCCCTTCTTTCTCGCCCGTTCGCGGGTTCCC

GTCAAGTTTAATCGGGGGCTCCCTTTAGGTTCGATTATGGCTTTACGGAC

CTCAACCCCAAAACTTGATAAGGGGGTGGTCAGGGTTTG



Kết quả so sánh trình tự đã giải với các trình tự trong ngân hàng gen thế giới bằng ứng dụng BLAST.



Phụ lục 10

Kết quả giải trình tự của VSV phân lập từ mẫu Probiotics Lactomin Plus

CCGATGTTCTCTGTACTCTCGTCGAGTCGTTCTCTGCGCTCCGGCCGCCT

GGCGGCCGCGGGAATTCGTTCTGGGAAGCCGTATCTCTACGACCGTCGG

GAATTGCCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCC

TTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTAGCTCCGACAC

GGAACCCGTGGAACGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTG

GACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAG

CGTCAGTAACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGAT

ATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCAC

TCAAGCCCGCCCGTACCCGGCGCGGATCCACCGTTAAGCGATGGACTTT

CACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCGAATAATTC

CGGATAACGCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTG

AGCCGGTGCTTATTCAACGGGTAAACTCACTCTCGCTTGCTCCCCGATAAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCTCACGCGGGTCGCTGCTC

AGGCTTGCGCCCATTGTACAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGATC

TGGGCCGTATCTCATCCCAATGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGTAC

CCGTCAAAGCCCGGGGGGGCCGTTACCCCGCCGTCAAGCGGATAGGAC

GCGACCCCATCCATACCGGGAAAGCTTTCCCAGAAGACCATGCGTTCAA

CTGGAAAAATCACTAATGAATTCGGGGGCCGCCTGTAGGCGACCATATG

GGAA



Kết quả so sánh trình tự đã giải với các trình tự trong ngân hàng gen thế giới bằngứng dụng BLAST



Phụ lục 11

1. Định lượng B. longum trong các chế phẩm probiotics Cân và xác định khối lượng trung bình của 20 gói chế phẩm. Cân chính xác

khoảng 10,0g bột thuốc vào bình nón vô trùng, thêm dung môi pha loãng với thểtích tính theo mililit bằng 9 lần khối lượng bột thuốc đã cân và vài viên bi thuỷ

tinh vô trùng. Lắc mạnh trong 30 phút để vi sinh vật phân tán đều trong dung dịch,

thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10 -1. Lấy 1000 l hỗn dịch trên cho vào ống

nghiệm đã chứa sẵn 9,0ml dung môi pha loãng, lắc đều bằng máy lắc trộn Vortex

được hỗn dịch có độ pha loãng 10 -2. Tiếp tục pha loãng 10 lần như trên để thu

được hỗn dịch có có độ pha loãng 10-5, 10

-6 và 10

-7.

Tiến hành: Chuẩn bị ba đĩa petri vô trùng, chuyển vào mỗi đĩa chính xác

1000 l hỗn dịch có độ pha loãng 10-5. Tiếp tục làm như trên với hỗn dịch có độ pha

loãng 10-6

và 10-7. Cấy trộn với môi trường BSM đặc (đã được tiệt trùng và để nguội

xuống khoảng 45oC), để môi trường trong đĩa đông tự nhiên. Lật ngược đĩa petri và

ủ ở 37 1oC trong 48 - 72 giờ trong điều kiện kị khí. Sau thời gian ủ, đếm số lượng

khuẩn lạc trong các đĩa petri (chỉ đếm các đĩa petri có số khuẩn lạc nằm trong

khoảng 25 - 250).

Tính kết quả: Số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm được tính theo công

thức:

A = nTB d MTB

Trong đó:

A : số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm (CFU/gói),

nTB : số lượng khuẩn lạc trung bình trong 3 đĩa petri (CFU),

MTB : khối lượng trung bình của bột thuốc trong gói chế phẩm (g/gói),

d : hệ số pha loãng của hỗn dịch thử.

2. Định danh đến chi Bifidobacterium bằng kit APi 20A

Sau khi nuôi cấy vi sinh vật như mô tả trong mục định lượ ng (mục 1), lựa

chọn một khuẩn lạc đặc trưng, tách biệt và cấy chuyển sang 5,0ml môi trườ ng MRS

lỏng, có bổ sung khoảng 0,5ml dầu khoáng ở lớ p bề mặt và ủ trong điều kiện k ị khí

ở 37 1o

C trong 24 giờ .



2.1. Nhuộm Gram

Tiến hành nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram và soi dướ i kính hiển

vi vớ i vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần.

Nếu vi sinh vật bắt màu tím, hình que, không có bào tử thì k ết luận vi sinh vậ là

tr ực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử.

2.2. Định danh vi sinh vật bằ ng kit API 20A

Sau khi xác định vi sinh vật là tr ực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử thì

tiế p tục cấy một quai cấy canh chủng từ ống MRS lỏng ở trên lên môi trườ ng thạch

máu, ủ trong điều kiện k ị khí ở 37 1oC trong 18-24 giờ . Gặt vi sinh vật trên bề

mặt đĩa thạch và phân tán đều trong ống nghiệm có sẵn 1ml nướ c cất vô trùng thu

đượ c hỗ n d ịch g ố c.

Nhỏ từ từ từng giọt hỗ n d ịch g ố c ở trên vào một ống nghiệm đã chứa sẵn 4ml

nướ c cất vô trùng đến khi độ đục trong ống tương đương với độ đục chuẩn

McFarland số 3. Ghi lại số giọt hỗn dịch gốc đã cho vào ống nghiệm trên.

Cho vào 4ml môi trườ ng API 20A số giọt hỗn dịch gốc bằng số giọt đã cho vào

ống nghiệm trên và lắc đều. Như vậy, nồng độ vi sinh vật trong môi trườ ng API

20A tương đương với độ đục chuẩn McFarland số 3 (so sánh độ đục bằng mắt

thườ ng).

Nhỏ môi trườ ng API 20 đã cấy vi sinh vật vào các giếng của bộ kit API 20A bắt

đầu từ giếng số 0 đến giếng 20, chú ý tránh tạo bọt khí trong giếng, chú ý chỉ nhỏ

phần tube. Riêng đối vớ i giếng IND nhỏ dung dịch dầu khoáng vô trùng lên trên bề

mặt giếng để tạo điều kiện k ị khí cho vi sinh vật phát triển. Đối vớ i giếng GEL nhỏ

cả phần tube và phần miệng giếng. Ủ ở 36 ± 2oC trong điều kiện k ị khí trong vòng

24± 2h.

Cách đọc k ết quả: Sau 24h nuôi cấy, quan sát và đọc k ết quả.

- Đối vớ i giếng IND: Thêm 1 giọt thuốc thử XYL vào lớ p dầu khoáng phía trên, tr ộn

đều và để 2-3 phút. Sau đó thêm 1 giọt thuốc thử EHR. Đọc k ết quả trong vòng 5

phút. K ết quả là dương tính nếu xuất hiện màu đỏ.



- Đối vớ i các giếng có chứa các đườ ng khác nhau: Thêm vào mỗi giếng một giọt

thuốc thử BCP. K ết quả đượ c ghi là dương tính nếu xuất hiện màu vàng hoặc vàng-

xanh.

- Phản ứng CAT: Để kit tiế p xúc vớ i không khí khoảng 30 phút, sau đó thêm 2 giọt

thuốc thử H2O2 3% vào một giếng dương tính bất k ỳ. K ết quả được ghi là dương

tính nếu thấy xuất hiện bọt khí.

Cách đọc giếng dương tính và giếng âm tính đượ c trình bày ở Bảng 1



Bảng 1. Cách đọc k ế t quả kit Api 20A

Giếng Chất nền

Hàm

lượ ng(mg/gi

ếng)

Phản ứng

K ết quả

âm tính Dương tính

IND L-tryptophan 0,98 Sự hình thành indol

XYL-tr ộn đ u /2-3 phút + HER/5 phút

Vàng Đỏ

URE Urea 0,648 Urease Vàng-cam Đỏ

GLU

MAN

LAC

SACMAL

SAL

XYL

ARA

D-glucose

D-manitol

D-lactose

D-saccharoseD-maltose

Salicin

D-xylose

L-arabinose

1,96

1,96

1,96

1,861,96

1,64

1,64

1,64

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóaAcid hóa

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóa

BCP

Tím Vàng/ vàng-xanh

GEL gelatin 0,6Sự thủy phân gelatin

Không có sự khuếch tán chất

màu

Có sự khuếch tán

chất màu đen

ESCEsculin

Sắt (III) citrat

0,36

0,11Sự thủy phân Esculin

Vàng Nâu-đen

Soi dưới đèn UV 365nm

Phát quang Không phát quang

GLY

CEL

MNE

MLZ

RAF

SOR

RHA

TRE

Glycerol

D-cellobiose

D-mannose

D-melezitose

D-raffinose

D-sorbitol

L-rhamnose

D-trehalose

1,82

1,86

1,96

1,96

2,18

2,18

1,96

1,96

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóa

Acid hóa

BCP

Tím Vàng/ Vàng-xanh

Sau khi tiế p xúc vớ i không khí 30 phút, thêm H2O2

vào 1 giếng dương tính

CAT - Catalase Không có bọt khí Xuất hiện bọt khí

SPOR - Bào tử Không có Có

GRAM - H ng Tím

COCC - Hình thái Que C u



Ghi k ết quả vào phiếu theo dõi. Nhậ p số liệu vào phần mềm Apiweb để định

danh chính xác vi sinh vật trong chế phẩm.

3. Định danh đế n loài B. longum b ằng k ỹ thu ật PCR vàgi ải trình t ự

3.1. Sơ đồ chung định tính B. longum trong các chế phẩ m probiotics bằ ng k ỹ

thuật PCR và giải trình t ự

Sau khi lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng tách biệt, tiến hành tăng sinh trong môi

trườ ng MRS lỏng có bổ sung 0,5ml dầu khoáng và được định danh đến chi

Bifidobacterium bằng kit API 20A như mô tả trong mục 2, tiế p tục cấy tăng sinh

VSV từ phần sinh khối còn lại sang môi trườ ng MRS lỏng, bổ sung thêm 0,5ml dầu

khoáng vô khuẩn, ủ ở 37±10C trong điều kiện k ỵ khí trong 24 giờ. Sau đó VSVtrong ống môi trườ ng MRS lỏng này sẽ đượ c tách chiết DNA và định danh bằng k ỹ

thuật PCR và giải trình tự theo sơ đồ sau

VSV trong môi

trường MRS lỏng

Tách chiết DNA

Kiểm tra sản phẩmtách

Tiến hành phản ứngPCR với mồi đặc hiệu

Nhân dòng và giảitrình tự



3.2. Tách DNA vi khuẩ n bằ ng WizardR Genomic DNA Purification Kit

DNA của các chủng nghiên cứu và của các vi sinh vật phân lập trong các

mẫu được tách và tinh sạch bằng kit của Promega có cải tiến. Quy trình thực hiện

như sau:

Các chủng chuẩn được tăng sinh từ các ống gốc bằng môi trường MRS lỏng, ủ ở

370C trong 48 giờ. Đối với các mẫu nghiên cứu, tiếp tục tăng sinh VSV trong môi

trường MRS lỏng từ phần sinh khối của VSV được phân lập sau khi đã định danh

đến chi Bifidobacterium (mục 2 )

- Lấy 1,0 – 1,5ml môi trường tăng sinh chủng trên vào ống nhựa 1,5ml. Mang ly

tâm 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút loại dịch nổi thu lấy cắn. - Thêm 480µl dung dịch EDTA 50mM vào ống cắn, lắc đều.

- Thêm tiếp 120µl dung dịch lysozyme (nồng độ 20mg/ml) trộn đều.

Ủ ở 370C trong 30-60 phút, sau đó ly tâm ở 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút.

Bỏ dịch nổi thu lấy cắn.

- Thêm 600µl dung dịch Nuclei Lysis vào ống cắn vừa thu được. Dùng pipet đảo

nhẹ tạo thành hỗn dịch. Ủ hỗn dịch trên ở 800C trong 5 phút để ly giải tế bào, sau

đó để nguội đến nhiệt độ phòng

- Thêm 3µl dung dịch RNAse vào dịch ly giải tế bào, trộn đều bằng cách đảo ống từ

5-7 phút. Ủ ở 370C trong 15-60 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng.

- Thêm 200µl dung dịch Protein Precipitation (dung dịch kết tủa protein) vào hỗn

hợp trên, lắc mạnh trong 20 giây. Ủ trong đá lạnh 5 phút. Đem ly tâm 10000-12000

vòng/phút trong 3 phút.

- Chuyển dịch nổi chứa DNA vào một ống nhựa 1,5ml sạch khác chứa 600µl

isopropanol. Trộn đều bằng cách đảo ngược ống từ 5-7 lần. Ly tâm 10000-12000

vòng/phút trong 2 phút. Loại bỏ dịch nổi, thu lấy cắn.

- Thêm 600µl dung dịch ethanol 70% vào ống, đảo nhẹ nhàng để rửa cắn DNA. Ly

tâm 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút. Cẩn thận loại hết ethanol thừa, để khô tự

nhiên trong 10-15 phút.

- Thêm 100µl dung dịch DNA Rehydration (dung dịch hòa tan DNA) vào ống chứa

cắn DNA, ủ 650C trong 1 giờ.



Bảo quản dung dịch DNA vừa tách được ở -200C.

3.3. Định lượ ng DNA bằng phương pháp đo độ hấ p thụ ánh sáng t ử ngoại ở

bướ c sóng 260 nm (A260 )Lấy 20µl dung dịch DNA trên, thêm 1,98 ml nước cất siêu tinh khiết vô

khuẩn. Tiến hành đo quang ở bước sóng 260nm thu được A260. Dựa vào kết quả đo

tính toán nồng độ dung dịch DNA gốc rồi pha loãng dung dịch DNA gốc đến nồng

độ 50 ng/µl.

- Kiể m tra khả năng tách DNA

Kiểm tra sản phẩm DNA tách được bằng phản ứng nhân bản đoạn gen đặc

hiệu 16S rDNA của vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR. Thành phần phản ứng được trình

bày ở Bảng 2.

Bảng 2. Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra DNA mới tách


1 Đệm PCR (10X) 2,5

2 dNTPs (2mM) 2,5

3 Dung dịch MgCl2 (50mM) 0,754 ID16R08F (10 pmol) 1

5 IDL16R09R (10 pmol) 1





Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen 16S rDNA: 940C trong

5 phút để biến tính hoàn toàn DNA khuôn, tiếp theo là 30 chu kỳ của 3 bước: 94 0C

trong 45 giây để làm biến tính DNA, 560C trong 45 giây để gắn mồi và 720C trong 1

phút 30 giây để kéo dài chuỗi. Mẫu sau đó được ủ tiếp ở 720C trong 5 phút và giữ ở

40C cho đến khi phân tích.

* Điện di trên gel agarose



Chuẩn bị bản gel có nồng độ 1% (kl/tt) trong đệm TBE (pH 8,0) (Tris -Boric

acid-EDTA), tiến hành điện di sản phẩm bằng máy điện di gel XL-ULTRA-V-2 ở

100V trong 30 phút. Nhuộm sản phẩm bằng dung dịch ethidium bromide 0,1%

trong 15-30 phút. Ghi lại kết quả bằng máy chụp ảnh bản gel UVDI- 312.

3.4. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của các đối tượ ng nghiên cứ u bằ ng k ỹ thuật

PCR

Tiến hành phản ứng PCR với các thành phần ghi trong Bảng 3

Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR đơn mồi


1 Đệm PCR (10X) 2,5

2 dNTPs (2mM) 2,5


4 BlonF (10pmol) 1

5 BlonR (10pmol) 1





Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu: : 94oC trong

5 phút để biến tính hoàn toàn DNA khuôn, tiếp theo là 30 chu kỳ của 3 bước: 94 0C

trong 45 giây để làm biến tính DNA, 56oC trong 45 giây để gắn mồi và 720C trong

30 giây để kéo dài chuỗi. Mẫu sau đó được ủ tiếp ở 72 oC trong 5 phút và giữ ở 4o

C

cho đến khi phân tích.

3.5. Nhân dòng và giải trình t ự

3.5.1. Tinh sạch DNA/dsRNA từ gel agarose bằng bộ kit Fermentas.

Quy trình được thực hiện ở nhiệt độ phòng bao gồm những bước như sau:

- Băng DNA/dsRNA quan tâm được cắt chính xác bằng lưỡi dao sạch từ gel agarose

và đưa vào ống eppendorf 1,5 ml. Bổ sung đệm bám (binding buffer) với 1 thể



tích bằng khối lượng miếng gel (1µl : 1 mg) và ủ trong bể ổn nhiệt 60°C trong

khoảng 10 phút đến khi gel tan hoàn toàn.

- Dung dịch gel agarose đã hòa tan được chuyển lên cột tinh sạch và ly tâm 10000

vòng/phút trong 1 phút. Sau đó phần dịch đi qua màng được gạn bỏ.

- Bổ sung 500 µl đệm rửa (wash buffer) vào cột và ly tâm 1 phút với vận tốc 10000

vòng/phút. Phần dịch đi qua màng được gạn bỏ. Lặp lại bước này một lần nữa.

- Cột tinh sạch có chứa DNA/dsRNA được chuyển sang ống eppendorf 1,5 mới và

bổ sung 100 µl elution buffer vào chính giữa lớp màng silica của cột. Sau đó

DNA/dsRNA được thu bằng cách ly tâm 1 phút với tốc độ 10000 vòng/phút.

Lượng DNA/dsR NA tinh sạch được giữ ở -20°C để phục vụ cho thí nghiệm tiếptheo.

3.5.2. Nhân dòng sản phẩm PCR bằng bộ kit pGEMT-Easy cloning.

- Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEMT- Easy.

Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEMT-Easy đầu T được thực hiện

theo quy trình kèm theo của bộ kit, với các thành phần như trong Bảng 4

Hỗn hợp phản ứng gắn sau đó được ủ trong bể ổn nhiệt 16°C qua đêm.

Bảng 4. Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector.

TT Thành phần Thể tích (µl)

1 Đệm phản ứng 2X 10 µl

2 Sản phẩm PCR 3 µl

3 Vector đầu T pGEMT-T 1 µl

4 T4 DNA ligase (5 u/µl) 1 µl

5 H2O cất khử ion vô trùng 5 µlTổng thể tích 20 µL

Biến nạp DNA vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α.

Tế bào khả biến E.coli DH5α (bảo quản trong tủ lạnh sâu -80°C) được làm tan

trên đá trong 10 phút. Tiếp đó, bổ sung 10µl hỗn hợp phản ứng gắn sản phẩm PCR

vào vector pGEMT-easy vào dung dịch tế bào đã rã đông và ủ trên đá 20 phút để

tạo điều kiện cho vector bám vào thành tế bào. Tế bào được sốc nhiệt bằng cách

chuyển sang bể ổn nhiệt 42°C trong 45 giây, sau đó được chuyển lại ủ trên đá trong



2 phút. Tiếp theo, bổ sung 450µl LB lỏng vào hỗn hợp biến nạp và ủ ở nhiệt độ

37°C trong vòng 20 phút trước khi được nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong

thời gian 30 phút. Hỗn hợp tế bào biến nạp được cấy trải trên đĩa môi trường LB

đặc có bổ sung ampicillin 100 µg/ml, phủ trên bề mặt cơ chất X-gal (20 l, nồng độ

20 mg/ml) và IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, 20 l, nồng độ

100mM), ủ ở 37°C qua đêm.

3.5.3. Tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep.

DNA tái tổ hợp được tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E. coli bằng bộ kit

GenJETTM

Plasmid Miniprep (Fermentas). Quy trình được thực hiện như sau:

-

Một khuẩn lạc dương tính được nuôi lắc trong 5ml môi trường LB lỏng có bổ sungkháng sinh ampicillin 100 µg/ml với tốc độ 220 vòng/phút ở 37°C qua đêm.

- Tế bào được thu bằng cách ly tâm ở vận tốc 6000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4oC.

Tế bào được hòa trở lại trong 250 µl đệm P1 (Resuspension solution) đã bổ sung

enzyme RNase A.

- Bổ sung 250 µl đệm P2 (lysis solution) vào dịch tế bào và đảo nhẹ 3-5 lần, ủ ở

nhiệt độ phòng 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid.

-

Hỗn hợp được trung hòa bởi 350 µl đệm P3 (neutralization solution), đảo đều 4-6

lần. Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính được loại bỏ bằng cách ly tâm hỗn hợp với

vận tốc 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C.

- Dịch nổi sau khi ly tâm được đưa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 10000

vòng/phút trong 1 phút. Plasmid được giữ lại trên lớp màng silica còn dịch qua cột

Documents

Xây Dựng Quy Trình Xác Định (Định Tính, Định Lượng) Bifidobacterium Longum Trong Các Chế Phẩm Probiotics