TEMA 18. EFECTO DE LOS XENOBIÓTICOS SOBRE PROTEÍNAS Y ADN

Una extensa variedad de xenobióticos (Xbs) pueden ejercer efectos primarios o

secundarios sobre los ácidos nucleicos. Es interesante identificar los efectos directos ó

indirectos y los procesos bioquímicos implicados. En este tema veremos los aspectos

básicos, algunos ejemplos de tóxicos específicos, fundamentalmente del ADN y algún

método de estudio.

Como ya se ha comentado en otros temas, muchos Xbs (en su mayoría

carcinógenos) actúan en el organismo mediante la formación de especies reactivas de

oxígeno (ROS) o a través de la formación de aductos con las proteínas y con el ADN

(ver el tema 16). La formación de aductos requiere la existencia de grupos electrofílicos

(deficientes en electrones) en el Xb (ó carcinógeno) y de centros nucleofílicos (ricos en

electrones) tales como grupos amino, sulfhidrilo, hidroxilo, presentes en otras

moléculas (proteínas, ARN y ADN). Estos aductos distorsionan la estructura de Las

proteínas y/o ácidos nucleicos y, por tanto, su función o replicación en su caso. En el

caso del ADN, normalmente el daño producido puede ser reparado, pero si no lo es, se

introduce una base inapropiada en la nueva cadena de ADN, lo que originaría una

mutación.

UNION COVALENTE DE INTERMEDIARIOS REACTIVOS A

BIOMOLECULAS

La principal fuente de intermediarios reactivos derivados de los Xb es el hígado, ya

que es el lugar principal de su metabolismo. La unión covalente a proteínas celulares (del

citoplasma, retículo endoplásmico o núcleo), así como a ácidos nucleicos u otras

macromoléculas, causa un daño que dependerá, fundamentalmente, de:

- La reactividad del compuesto y su vida media

- La extensión de la unión

- La molécula a la que se une.

- Límite de tolerancia.

En el tema 16 veremos con más detalle la formación de aductos con proteínas y ác.

Nucleicos. A continuación se muestran, únicamente, algunos ejemplos.

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EJEMPLO de compuestos que inducen toxicidad mediante su unión covalente a

moléculas biológicas.Xenobiótico Metabolito reactivo propuesto Órgano blanco y sitio de unión

Bromobenceno 3,4-epóxido y/o orto-quinona Hígado

Acetaminofen N-acetil-p-benzo quinonimina Hígado

Cl4C radical triclorometil y/o fosgeno Hígado

p-aminofenol quinonimina Riñón

Ipomeanol epóxido Pulmón

PROTEINAS

La modificación covalente de proteínas puede tener profundos efectos sobre su

estructura y actividad biológica. Algunos efectos bien conocidos incluyen la

fosforilación, carboxilación, metilación, glicosilación y unión a ácidos grasos. Todo

ello puede afectar a la estructura de membranas, metabolismo energético, transporte de

metabolitos e iones, etc.

La disminución de la incorporación de aminoácidos radiactivos en proteínas es

con frecuencia secundario a los efectos de los tóxicos sobre la producción de energía o

sobre la síntesis de mARN. Muy pocos tóxicos inhiben la síntesis de proteínas por

inhibición de etapas implicadas en su síntesis. Entre ellos están la cicloheximida, que

bloquea la peptidil transferasa, la puromicina, que produce la terminación prematura de

la cadena y liberación de la recien sintetizada. Otros inhibidores (CCl4 y tolueno)

producen la disgregación de poliribosomas en monoribosomas y a veces en subunidades

ribosómicas.

Algunos tóxicos pueden inducir la síntesis específica de proteínas. La

metalotioneína, por ejemplo, es una proteína que une metales (Zn2+, Cd2+, Hg2+, Me-

Hg1+ y otros metales pesados catiónicos). Esta capacidad se debe al alto contenido en

cisteinas (33%) y grupos SH. La administración de éstos metales hace que aumente la

síntesis de metalotioneína al aumentar, previamente, la síntesis del mARN

correspondiente. Así, la metalotioneína del tejido renal aumenta por exposición repetida

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H

al mercurio. Otros agentes que inducen la síntesis de metalotioneina son los

corticosteroides y el CCl4.

REACCIONES CON PROTEÍNAS. Entre los intermediarios reactivos que pueden

unirse de forma covalente a las proteínas se encuentran los siguientes:

: ALDEHIDOS CARBONILOS Y :

HALUROSDE ALQUILO

EPÓXIDOS

ACIL GLUCURÓNIDOS

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FORMACION DE ADUCTOS DE ADN

Un gran número de Xbs pueden dañar el ADN. En el siguiente esquema se

observa la conversión de un carcinógeno en un aducto de ADN y las posibles

consecuencias.

Existen 4 grandes clases de compuestos que ejercen sus efectos mediante la

formación de aductos covalentes con bases del ADN (carcinógenos genotóxicos, sus

efectos se estudian en el tema 19):

a) hidrocarcuros aromáticos policíclicos (PAH),

b) aminas aromáticas,

c) nitrosaminas

d) otros agentes alquilantes.

Todos ellos tienen grupos electrofílicos o grupos que se pueden convertir en

electrofílicos metabólicamente (epóxidos, hidroxilaciones). Estos grupos forman

enlaces covalentes con nucleófilos presentes en el ADN, lo que origina la acción

cancerígena.

a) HIDROCARBUROS AROMATICOS POLICICLICOS

Se forman como productos de la combustión de petróleo y material biológico,

también se generan en el tabaco, whisky, carnes a la brasa y por combustión incompleta

de combustibles fósiles (carbón y gasolina). Forman aductos con bases púricas,

especialmente guanina, pero solamente tras la activación enzimática a carcinógeno

próximo o último.

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Carcinógeno Carcinógeno próximo

Carcinógeno último

Detoxificación

Reparación Mutación

Aducto de ADN

Muerte Normal

Cáncer

b) AMINAS AROMATICAS

Se usan en la industria del tinte ó del caucho (goma). Un ejemplo es el 2-

acetilaminofluoreno (AAF) que causa en animales múltiples cánceres (vejiga, hígado,

intestino, oído, tiroides y pecho) (en ratas necesita del orden de g). Se ha usado como

insecticida y algunos compuestos relacionados se encuentran en las carnes cocinadas

(millonésima de g).

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.

Carcinógeno Carcinógeno próximoCarcinógeno último

Carcinógeno

Carcinógeno próximo

Carcinógeno último

Región bahíabahía

bahía

Fenantreno inactivo

c) NITROSAMINAS

Se forman en las carnes y pescados ahumados por interacción entre aminas

naturales y nitritos añadidos como conservantes, pero su presencia mayoritaria está en

el tabaco y sus productos. Actualmente se sabe que los efectos carcinógenos de las

nitrosaminas están relacionados con los mecanismos bioquímicos que las activan (por

ej. las oxidasas microsomales de función mixta).

La mayoría de las nitrosaminas requieren la activación enzimática para formar el

carcinógeno último. El mecanismo bioquímico por medio del cual se produce el cáncer

se cree que tiene relación con la metilación de algunas bases nitrogenadas en el ADN,

probablemente con la escisión (eliminación) de las bases nitrogenadas alquiladas más

que con el nivel de alquilación.

d) OTROS AGENTES ALQUILANTES

Entre los carcinógenos químicos más significativos en la iniciación del cáncer

destacan los agentes alquilantes (metilo, etilo). Estos atacan grupos nucleofílicos del

ADN y pueden iniciar la secuencia de sucesos que dan lugar al crecimiento y

replicación de células neoplásicas (cancerosas).

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Espontánea

N-Methylnitrosourea

Un ejemplo es el cloruro de vinilo (gas descubierto en 1817, usado en la

industria del plástico como PVC):

Agente monofuncional

CH2=CH-Cl

Cloruro de vinilo

Otro ejemplo de este grupo es el gas mostaza, con grupos suficientemente

electrófilos que no requieren activación (carcinógeno directo). El término mostaza se

refiere a las ampollas que producen estos agentes en la piel. En agua, los compuestos

originarios forman un electrófilo que reacciona con nucleófilos biológicos. Las

mostazas nitrogenadas reaccionan con las bases de los ácidos nucleicos La reacción del

N7 de la guanina con la mecloretamina se ilustra en la figura.

La base modificada puede aparearse anormalmente durante la replicación (3) e

inducir mutaciones, pero tambien puede ser eliminada del ADN (4), lo que produce

escisión de la cadena, o producir la fragmentación del ADN (5) al romperse el anillo.

También puede haber entrecruzamiento de cadenas de ADN (6). Puesto que los agentes

alquilantes modifican el crecimiento celular, la mitosis, la diferenciación y la función

de la célula, las células que se están dividiendo más rápido, son las más susceptibles a la

acción de estos agentes. En células que se dividen lentamente, los procesos de

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Grupos metilo unidos a N (izqda)

u O (derecha)en Guaninas

contenidas en el ADN

Unión al resto de la molécula de ADN

reparación del ADN pueden revertir los efectos de la modificación del ADN. Las

mostazas nitrogenadas son, por tanto, mutágenas y carcinógenas. Sin embargo, y debido

a la propia acción de estos agentes sobre las células en división, muchos de ellos se usan

en el tratamiento contra el cáncer.

Finalmente, la estructura de las ADN polimerasas también influye en la

inhibición de las mismas por tóxicos. La polimerasa- contiene uno o más grupos SH

críticos, por lo que es muy sensible a sustancias que reaccionan con estos grupos, como

es el caso de la N-etilmaleimida. La polimerasa- no tiene grupos SH críticos por lo

que no es sensible a tales sustancias.

EFECTO DE LOS XENOBIOTICOS SOBRE EL ARN

La acción sobre el ARN no es tan importante como en el caso del ADN. Aunque

un tóxico puede inhibir la síntesis de todas las especies de ARN (mARN, tARN y

rARN), el mARN es el que exhibe las manifestaciones más tempranas de la toxicidad,

lo que implica una disminución de los niveles de enzimas y proteínas de vida media

corta.

En muchos casos la inhibición de la síntesis de mARN es secundaria a otros

mecanismos. Por ej. la actinomicina D (antibiótico, inhibidor específico de la síntesis de

ARN), se une a la desoxiguanosina del ADN (se intercala entre 2 pares G-C adyacentes)

y bloquea el movimiento de la ARN polimerasa (ARNp) sobre el molde de ADN. A

bajas dosis se inhibe la síntesis de rARN y a altas dosis la de mARN. Otro ej. es la

inhibición de la síntesis de mARN secundaria a la interferencia en la producción de

energía (inhibición de la fosforilación oxidativa o alteraciones en la estructura

mitocondrial).

La estructura de las ARNp también influye en la inhibición de las mismas por

tóxicos. Así, las ARNp muestran distinta sensibilidad a la -amanitina, toxina de la

amanita faloides (ver tema 17).

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TEST DE GENOTOXICIDAD (TEST DE AMES)

Se han desarrollado muchos tests de genotoxicidad para medir la capacidad de

mutágenos y carcinógenos de producir cambios cuantificables en el genotipo de células

procariotas y eucariotas detectables mediante cambios en el fenotipo. Normalmente se

utiliza para ello la mutación de genes, daño cromosómico, daño y reparación del ADN y

transformación celular. Se han desarrollado ensayos en bacterias, hongos, células de

roedores, humanas, etc.

La mayoría de los ensayos de transformación en mamíferos miden la aparición de

células alteradas morfológicamente por el agente mutágeno o carcinógeno. Suelen usarse

células derivadas de fibroblastos de ratón, que son células muy uniformes tanto en su

crecimiento como en la morfología. Sin embargo, si el efecto es mediante un mecanismo

no-genotóxico o epigenético, como ocurre con los promotores de tumores, no se detecta

mediante estas técnicas. Ello se refleja parcialmente en la pérdida de relación entre

mutagénesis y carcinogénesis. Hasta el momento se dispone de pocos ensayos para la

identificación de promotores tumorales, y la mayoría de ellos han sido identificados a

través de experimentos de iniciación-promoción en roedores.

Una de las pruebas que se utilizan para correlacionar la capacidad carcinogénica

con la capacidad de afectar al ADN celular es el denominado TEST de AMES. Se realiza

añadiendo a cultivos de Salmonella typhimurium el carcinógeno cuya mutagenicidad se

pretende analizar. Estos cultivos se realizan en un medio carente de histidina, de forma que

solamente crecen bactaerias con mutaciones en alguno de los genes que metabolizan este

aminoácido. A mayor número de colonias mayor capacidad mutagénica del carcinógeno.

El mayor problema de este Test es la utilización de bacterias, las cuales no son capaces de

activar metabólicamente muchos carcinógenos como ocurre en humanos y animales. Ello

llevó a la adición al medio de cultivo de extractos de hígado de animales. Así se consigue

reproducir, con bastante fiabilidad, la correlación observada en los ensayos con animales,

ahorrando tiempo y dinero.

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SITIOS DE ACCIÓN DE FÁRMACOS SELECCIONADOS USADOS EN EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER

MercaptopurinaSíntesis de Síntesis de TioguaninaPirimidinas purinas Inhibe la síntesis del anillo

de purinaInhibe las interconversiones de nucleótidos

Ribonucleótidos

Hidroxiurea Metotrexato

Inhibe la reductasa de Inhibe la síntesis del

Ribonucleótido anillo de purina

Inhibe la formación de dTMP

FluorouraciloInhibe la formación Desoxirribonucleótidos de dTMP

Arabinósido de C Daunorrubicina Mostazas nitrogenadas Doxorrubicina Agentes alquilantes Bleomicinas Modifica el ADN Etopósido ADN Dañan al ADN y previenen su reparación Actinomicina D

Inhibe la síntesis de ARN

ARN

CCl4 Asparaginasa Tolueno Desamina a la asparaginaDisgregación de e inhibe la síntesis de proteínas

polirribosomas

Vinblastina Vincristina ProteínaInhibe la función

Microtúbulos Enzimas, factores, etc.

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