LIETUVOS SVEIKATOS MOKSL UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

ivil emeckien

ASTMOS UDEGIMINIO BRANDUOLIO FAKTORIAUS

KAPA B KELIO GENETINI IR BIOCHEMINI YMEN BEI

J SSAJ PAIEKA

Daktaro disertacija

Biomedicinos mokslai, biologija (01B)

Kaunas, 2018

Disertacija rengta 20112018 metais Lietuvos sveikatos moksl universiteto Medicinos akademijos Laboratorins medicinos klinikoje. Mokslin vadov

prof. dr. Astra Vitkauskien (Lietuvos sveikatos moksl universitetas, biomedicinos mokslai, biologija 01B).

Disertacija ginama Lietuvos sveikatos moksl universiteto Medicinos akademijos biologijos mokslo krypties taryboje: Pirminink

prof. habil. dr. Vaiva Lesauskait (Lietuvos sveikatos moksl universite-tas, biomedicinos mokslai, biologija 01B).

Nariai:

prof. dr. Aura Mongirdien (Lietuvos sveikatos moksl universitetas, biomedicinos mokslai, medicina 06B); doc. dr. Rasa Ugenskien (Lietuvos sveikatos moksl universitetas, biomedicinos mokslai, biologija 01B); dr. Audron Eidukait (Inovatyvios medicinos centras, biomedicinos mokslai, medicina 06B); doc. dr. Denis Kainov (Helsinkio universitetas, biomedicinos mokslai, biologija 01B).

Disertacija ginama 2018 m. rugpjio 27 d. 14 val. vieame biologijos mokslo krypties posdyje Lietuvos sveikatos moksl universiteto ligonins Kauno klinik Laboratorins medicinos klinikos salje Nr. 217.

Adresas: Eiveni g.2, LT-50161 Kaunas, Lietuva.

LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY

ivil emeckien

THE SEARCH OF GENETIC AND

BIOCHEMICAL MARKERS OF ASTHMA INFLAMMATORY

NUCLEAR FACTOR KAPA B PATHWAY

Doctoral Dissertation Biomedical Sciences,

Biology (01B)

Kaunas, 2018

The Dissertation has been prepared at the Department of Laboratory Medicine of the Medical Academy of the Lithuanian University of Health Sciences during the period of 20112018. Scientific supervisor

Prof. Dr. Astra Vitkauskien (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Biology 01B).

The disertation is defended at the Biology Reseach Council of the Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences: Chairperson Prof. Dr. Habil. Vaiva Lesauskait (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Biology 01B). Members:

Prof. Dr. Aura Mongirdien (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Medicine 06B); Assoc. Prof. Dr. Rasa Ugenskien (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Biology 01B); Dr. Audron Eidukait (Center for Innovative Medicine, Biomedical Sciences, Medicine 06B); Assoc. Prof. Dr. Denis Kainov (University of Helsinki, Biomedical Sciences, Biology 01B).

Disertation will be defended at the open session of the Biology Research

Council on the 27th of August, 2018 at 2:00 PM in the Auditorium No. 217 of the Laboratory Medicine Department of the Hospital of Lithuanian Uni-versity of Health Sciences Kauno klinikos.

Adress: Eiveni 2, LT-50161 Kaunas, Lithuania.

TURINYS

SANTRUMPOS ............................................................................................. 7 VADAS......................................................................................................... 8 DARBO TIKSLAS IR UDAVINIAI .......................................................... 9 1. LITERATROS APVALGA ................................................................ 10

1.1. Bronchin astma ............................................................................ 10 1.2. Udegiminiai pokyiai sergant astma ............................................ 10

1.2.1. Udegimas ir NF-B signalinis kelias ................................. 11 1.2.2. NF-B ir astma .................................................................... 13 1.2.3. NF-B kelio reguliacija ubikvitino proteosom sistema ........................................................................................... 14 1.2.4. Ubikvitino proteosom sistema ........................................ 14

1.3. Astmos rizikos veiksniai ................................................................ 18 1.3.1. Aplinkos veiksniai ............................................................... 18 1.3.2. Genetiniai veiksniai ............................................................. 18

1.4. NF-B signalinio kelio baltymus koduojani gen polimorfizmas ....................................................................................... 24

1.4.1. Proteosom subvienetus koduojantys genai ........................ 24 1.4.2. NF-B branduolio faktori koduojantys genai .................... 25 1.4.3. Inhibitori IB koduojantys genai ...................................... 25

2. TYRIMO MEDIAGA IR METODAI ................................................... 27 2.1. Tiriamj kontingentas ir mgini surinkimas .............................. 28 2.2. DNR iskyrimas i periferinio kraujo ............................................ 28 2.3. Proteosomas koduojani gen polimorfizmo nustatymas ........... 29

2.3.1 Polimerazin grandinin reakcija (PGR) .............................. 29 2.3.2. PGR produkt karpymas ..................................................... 32 2.3.3. Sekoskaita ............................................................................ 33

2.4. NF-B polimorfizmo nustatymas .................................................. 33 2.5. Biochemini ymen koncentracijos kraujo serume nustatymas .. 34 2.6. Statistin ir bioinformacin analiz ............................................... 35

3. REZULTATAI ......................................................................................... 36 3.1. Tiriamj grups apibdinimas ..................................................... 36 3.2. Proteosomas koduojani gen polimorfizmo tyrimas ................. 36

3.2.1. PSMA6, PSMC6 ir PSMA3 gen polimorfizmai ................. 37 3.2.2. Proteosomini gen penki polimorfizm haplotip analiz ............................................................................................ 39 3.2.3. Tirt proteosomini gen aleli ir genotip reikm astmos isivystymui ....................................................................... 40

5

3.3. NFKB1 ir NFKBIA gen polimorfizmo tyrimas ............................ 42 3.3.1. NFKB1 ir NFKBIA gen polimorfizm analiz .................. 43 3.3.2. NFKBIA geno haplotip analiz .......................................... 45 3.3.3. NFKB1 ir NFKBIA gen aleli ir genotip reikm astmos isivystymui ....................................................................... 46

3.4. Udegiminio kelio biochemini ymen tyrimas .......................... 48 3.4.1. 26S proteosom koncentracijos kraujo serume tyrimas ...... 48 3.4.2. NF-B koncentracijos kraujo serume tyrimas ..................... 49

3.5. Biochemini ir genetini ymen ssaj tyrimas .......................... 50 3.5.1. PSMA6, PSMC6, PSMA3 gen polimorfizm ssajos su 26S koncentracija kraujo serume .............................................. 50 3.5.2 NFKB1 ir NFKBIA gen polimorfizm ssajos su NF-B koncentracija kraujo serume .......................................................... 53

4. REZULTAT APTARIMAS .................................................................. 56 4.1. Proteosomas koduojani gen polimorfzim reikm sergant astma ......................................................................................... 56 4.2. NFKB1 ir NFKBIA gen polimorfizm reikm udegimui ir astmai ................................................................................................. 58 4.3. 26S proteosom koncentracijos kraujo serume reikm ................ 59 4.4. NF-B koncentracijos kraujo serume reikm ............................... 61 4.5. Biochemini ir genetini ymen ssajos...................................... 61

6. IVADOS ................................................................................................ 63 8. LITERATROS SRAAS ................................................................... 64 PUBLIKACIJ SRAAS ......................................................................... 84 SUMMARY OF DOCTORAL DISERTATION ....................................... 108 CURRICULUM VITAE ............................................................................ 117 PADKA .................................................................................................... 118

6

SANTRUMPOS A adeninas ASA aleliui specifin amplifikacija, ATP adenozintrifosfatas Bp bazi poros C citozinas CAPS pagausintos ir sukarpytos polimorfins sekos (angl. Cleaved amplified polymorphic sequence) Del delecija (ikrita) DNR deoksiribonukleaz ELISA standartizuotas imunofermentinis (angl. Enzyme linked immunosorbent assay) metodas ET endoplazminis tinklas G guaninas GINA Pasaulin astmos iniciatyva (ang. Global Initiative for Asthma) GWAS plataus masto genomo asociacij analiz (angl. Genome wide association study) HRP krien peroksidaz IgE imunoglobulinas E IKK branduolio faktoriaus inhibitoriaus (IB) kinaz Ins insercija (intarpas) IB branduolio faktoriaus kapa B inhibitorius KASP konkuruojanti aleliui specifin PGR (angl. competetive allele specific PCR), MI miokardo infarktas NEMO branduolio faktoriaus kapa B moduliatorius NF-B transkripcijos faktorius branduolio faktorius kapa B S ans santykis (angl. Odds ratio) PGR polimerazin grandinin reakcija PI pasikliautinasis intervalas PSM proteosom subvienetus koduojantys genai RHD Rel eimos baltym homologijos domenas T timinas Th2 antro tipo T lstels pagalbininks UPS ubikvitino proteosom sistema VNP vieno nukleotido polimorfizmas

7

VADAS

Astma yra ltin udegimin kvpavimo tak liga, kuria sergamumas spariai auga, ir iuo metu visame pasaulyje serga apie 300 milijon moni [1]. Liga prasideda kaip netinkamas udegiminis atsakas vairius kvepia-mus alergenus, vedamas T lsteli pagalbininki (Th2) [2]. Daniausi ast-mos simptomai pasireikiantys suaugusiems yra krtins spaudimas, vok-timas, kosulys ir kvpavimo sutrikimas [3].

Viena svarbiausi astmos ypatybi udegimas [4]. Jo metu kvpavimo takus infiltruojasi daugyb udegimini lsteli (T limfocit, eozinofil, neutrofil), kurios kartu su kvpavimo tak struktrinmis lstelmis ap-link ileidia udegimini mediatori, citokin, chemokin, toliau skati-nani patologinius procesus [5, 6]. Pagrindinis udegimini gen raik reguliuojantis veiksnys lstelse yra branduolio faktorius kapa B (NF-B) [6]. NF-B atlieka svarb vaidmen ne tik udegiminiuose procesuose, bet ir imuninio atsako, lsteli proliferacijos, karcinogenezs, lsteli igyvenimo ir apoptozs reguliacijoje [7].

Vienas i svarbi NF-B signalinio kelio reguliatori yra ubikvitino proteosom sistema (UPS), atsakinga u daugelio vidulstelini baltym ardym [8]. Tiek NF-B, tiek UPS tvarkingas funcionavimas yra reikalingas normaliai lstels ir viso organizmo veiklai palaikyti, o sistem sutrikimai gali sukelti vairias ligas [911].

Astma daugiaveiksn liga, kylanti i sudtingos aplinkos ir genetini veiksni sveikos. Kitaip nei monogenini lig atveju, nra nustatyta vieno geno mutacij, kurios galt lemti ligos isivystym. Taiau toki daugia-veiksni lig isivystymui genetika taip pat labai svarbi. Polink susirgti gali lemti ir gen polimorfizmai tai genetiniai variantai, turintys bent du ale-lius, kuri retojo danis populiacijoje didesnis nei 1 proc. [12]. Daniausias polimorfizmas vieno nukleotido pokytis (VNP). VNP randami isidst visame genome madaug 1 i 1000 bazi por daniu. Ir nors jie yra stabils ir organizmui nealingi variantai, VNP, esantys reguliaciniuose DNR ele-mentuose, pvz., promotoriaus srityje, gali keisti geno raik [13]. Taip pat gali bti takojama ir baltym transliacija bei j stabilumas [14]. VNP tyrimai serganij grupse gali padti ne tik geriau suprasti ligos eig, prognoz, bet ir atrasti naujus farmakogenominius taikinius ir nuspti atsak gydym [14, 15].

Tad iame darbe buvo keliama hipotez, kad svarbius astmos udegi-minio signalinio kelio elementus koduojani gen polimorfizmai gali sietis su astmos isivystymu.

8

DARBO TIKSLAS IR UDAVINIAI

Darbo tikslas Nustatyti ir vertinti astmos udegiminio NF-B kelio genetinius ir bio-

cheminius ymenis bei j ssajas.

Darbo udaviniai 1. Nustatyti pasirinktus proteosomas koduojani gen (PSMA6, PSMC6 ir

PSMA3) polimorfizmus astma sergani ir sveik asmen grupse bei vertinti aleli, genotip bei haplotip ry su polinkiu sirgti astma.

2. Nustatyti gen, koduojani branduolio faktori kapa B (NFKB1) ir jo inhibitori IB (NFKBIA), pasirinktus polimorfizmus astma sergani ir sveik asmen grupse. vertinti aleli, genotip bei haplotip ry su po-linkiu sirgti astma.

3. Nustatyti 26S proteosom ir branduolio faktoriaus NF-B koncentracij astma sergani ir sveik asmen kraujo serume.

4. vertinti tirt genetini ir biochemini ymen ssajas.

Darbo mokslinis naujumas iame darbe pirm kart analizuojamos galimos proteosomas koduo-jani gen: PSMA6, PSMC6 ir PSMA3 polimorfizm ssajos su astma ne tik Lietuvoje, bet ir pasaulyje tyrimai atliekami kartu su Latvijos ir Tai-vanio mokslininkais. Tiriami branduolio faktori kapa B ir jo inhibitori IB koduojani gen polimorfizmai, kuri ryiai su astmos isivystymu dar nebuvo nustatyti. Taip pat tiriami nauji galimi astmos biocheminiai y-menys 26S proteosoma ir NF-B.

9

1. LITERATROS APVALGA

1.1. Bronchin astma

Bronchin astma yra ltin udegimin kvpavimo tak liga. Jos metu padidja bronch jautrumas tiesioginiams ar netiesioginiams dirgikliams, dl to atsiranda pasikartojantys vairaus stiprumo dusulio, voktimo, kr-tins verimo ir kosulio epizodai. Taip pat dana kvpavimo tak obs-trukcija [1]. Astma gali bti alergin, kai liga sutampa su alerginiu sijaut-rinimu, kurio metu serume atsiranda imunoglobulino E (IgE) antikn, ir nealergin. Be to pastaraisiais metais iskiriama ir daugiau astmos tip, vadinam endotipais [16]. Sergamumas ia liga auga visame pasaulyje ir iuo metu astma serga daugiau nei 300 milijon moni [1]. Patvirtint astmos atvej paplitimas tarp suaugusi moni siekia apie 34 proc., bet stebima didel variacija tarp ali, o didiausias sergamumas nustatomas isivysiusiose alyse [17]. Lietuvoje sergamumas taip pat didja ir Lietuvos higienos instituto sveikatos informacijos centro duomenimis 2015 metais 1000 gyventoj teko 14,7 astma sergani suaugusij ir 42,8 sergani vai-k [18].

Liga gali prasidti vairiame amiuje, ir pradios laikas yra svarbus fenotipo nustatymui. Ankstyvame amiuje prasidjusi astma daniausiai yra atopin, vyrauja Th2 udegimins lstels, yra geras atsakas gydym glu-kokortikoidais ir gera prognoz. Vlyvame amiuje prasidjusi (suaugusi-j) astma danai neatopin, ligos prognoz maiau palanki ir daugiau ans isivystyti nuolatiniam kvpavimo tak susiaurjimui [19].

1.2. Udegiminiai pokyiai sergant astma

Udegimas yra gimtas imuninis atsakas fizin, fiziologin ir oksidacin

stres [20]. Sergant astma padidjs kvpavimo tak jautrumas vairiems dirgikliams bei ltinis udegimas daniausiai ilieka net nesant ryki simp-tom ar esant normaliai plaui funkcijai [1]. Dl ilgai trunkani udegi-mini proces gali isivystyti negrtama kvpavimo tak remodeliacija [21]. U pokyius apimanius oro tak sienels sustorjim, epitelio hiper-trofij, gleivins pokyius, oro tak susiaurjim, atsakingos epitelio ir ir ly-giosios raumen lstels. Be to epitelio lstels inicijuoja oro tak udegim [22]. Jos gamina didelius kiekius udegimini citokin, kurie veikia vairias imunins sistemos lsteles, taip pat gamina chemokinus, pritraukianius lsteles (eozinofilus, neutrofilus, limfocitus, putliasias lstels) i cirkuliaci-ns sistemos kvpavimo takus. Jos aplink ileidia daugyb udegimini

10

mediatori: citokin, chemokin, adhezijos molekuli, toliau skatinani udegiminius procesus, kuriuose tarpusavyje sveikauja udegimins ir kv-pavimo tak struktrins lstels [21, 23].

Daugelio astmos metu udegiminiuose procesuose dalyvaujani lsteli gaminam citokin (IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13, TNF ir kt.) transkripcija yra reguliuojama transkripcijos faktoriaus NF-B [24,25].

1.2.1. Udegimas ir NF-B signalinis kelias NF-B vaidina svarb vaidmen imuninio atsako, udegimo, lstels

augimo, igyvenimo bei vystymosi ir kituose biologiniuose procesuose [26]. Jis yra pagrindinis veiksnys astmos metu reguliuojantis udegimini media-tori raik kvpavimo tak ir imuninse lstelse [6]. NF-B yra dimerinis transkripcijos faktorius, susidarantis i Rel eimos baltym per homo- arba hetero-dimerizacij. Trys i penki eimos baltym RelA (p65), c-Rel ir RelB turi transkripcij aktyvinant domen, o lik du p50 (NF-B1) ir p52 (NF-B2) transkripcij gali aktyvinti tik per heterodimerizacij su kitais baltymais [27,28]. p50 ir p52 baltymai susidaro proteolizs bdu i neaktyvi pirmtak p105 ir p100 baltym. Daniausiai susidarantis dimeras yra p50/p65 [29]. Visi Rel eimos baltymai turi labai konservatyv Rel homologijos domen (RHD), kuriuo jungiasi prie specifini 9-10 nukleotid ilgio DNR sek, vadinam kapa B vietomis ((5-GGGRNWYYCC-3 ; R A arba G; N bet koks nukleotidas; W A arba T; Y C arba T) [30].

Neaktyvus dimerinis NF-B faktorius kaupiasi lsteli citoplazmoje su-sijungs su kapa B inhibitoriais (IB), kurie neleidia jam pereiti branduolio membranos. IB eim sudaro septyni nariai, turintys ankyrino pasikarto-jimus. Keturi baltymai IB, Ik, IB ir IB gali tiesiogiai udengti NF-B lokalizacijos branduol signal citoplazmoje, o kiti trys Bcl-3, IB ir IBNS yra branduolyje ir ten sveikauja su NF-B reguliuodami transkripcij [31].

Aktyvinti NF-B gali vairs veiksniai, pvz., aplinkos stresas, bakterij ir virus molekuls, UV radiacija, oksidacinis stresas, udegiminia citokinai [32]. Kai lstel paveikiama i stimul IB baltymus fosforilina serino kinaz IKK (IB kinaz), kuri yra svarbaus NF-B keli reguliuojanio trimerinio komplekso dalis, sudaryta i dviej katalitini ir vieno regulai-cinio subvienet. Tuomet fosforilinti IB baltymai yra paymimi ubikvitino molekulmis ir suskaidomi proteosomoje, tad ilaisvintas NF-B gali pereiti branduol ir prisijungs prie DNR pradti udegim skatinani veiksni citokin, adhezijos molekuli, chemokin, augimo ir lstels ciklo regulai-tori bei kit gen transkripcij [33,34]. I viso NF-B reguliuoja beveik 500 gen transkripcij [35]. Kai kurie citokinai gali tiesiogiai aktyvinti

11

NF-B keli taip sukurdami teigiam reguliacin kilp, dl kurios udegi-minis atsakas gali sustiprti ir pailgti ltinio udegimo trukm [36].

NF-B aktyvinimas gali vykti bent dviem keliais: klasikiniu/kanoniniu ir alternatyviu (1.2.1.1 pav.). Kanoniniame kelyje udegiminiai citokinai, TNF, IL-1, lipopolisacharidai, mikroorganizm dalels prisijung prie atpastani receptori aktyvinina IKK kompleks, sudaryt i IKK, IKK, kurie yra struktrikai panas, ir pagrindinio NF-B moduliatoriaus (NEMO, dar kitaip vadinamo IKK). Tuomet IKK fosforilina IB, kur at-pasta ubikvitino ligazs kompleksas ir prie jo prijungia ubikvitino gran-dinl. Poliubikvitilint IB suskaido proteosomos, NF-B isilaisvina ir gali pereiti branduol [29, 37]. Kanoninis kelias reguliuoja gimt imunin atsak. Jo metu aktyvinama udegimini citokin (IL,4, IL95, IL-6, TNF- ir kt.), chemokin (MIP-1, IL-8), adhezijos molekuli ir kit baltym gen transkripcija [38].

1.2.1.1 pav. Klasikinio ir alternatyvaus NF-B signalinio kelio schema

12

Alternatyvus kelias aktyvinamas TNF eimos baltym limfotoksino , CD40 ligando, B lsteles aktyvinanio faktoriaus ir kt. Jo metu kinaz NIK fosforilina IKKIKK homodimer, kuris sukelia p100 baltymo, esanio komplekse su RelB, fosforilinim. p100 baltymo C-galin dalis veikia kaip IB. Fosforilintas p100 yra ubikvitilinamas ir dalinai suskaidomas proteo-somoje. Taip susidaro p52 baltymas ir aktyvus heterodimeras p52/RelB, kuris gali pereiti branduolio membran ir aktyvina gen transkripcij [37]. io NF-B signalinio kelio mechanizmai skiriasi nuo kanoninio ir reguliuoja limfoidini organ formavimasi, B lsteli brendim ir igyvenim, dendri-tini lsteli aktyvacij ir kaul metabolizm [39].

Tad pagrindin vaidmen ltini udegimini lig, toki kaip reumatoi-dinis artritas, astma, ltin obstrukcin plaui liga, patogenezje atlieka kanoninis NF-B aktyvacijos kelias, prasidedantis nuo mikroorganizm da-leli ir udegim skatinani citokin [40]. ias molekules atpasta TLR receptoriai ekspresuojami vairi imunini lsteli (makrofag, B lsteli, dendritini lsteli) ir neimunini (fibroblast, epitelio lsteli ir keratino-cit) paviriuje [31].

1.2.2. NF-B ir astma

vairi tyrim duomenys rodo, jog NF-B vaidina svarb vaidmen l-

tinio udegimo palaikyme astmos metu. Stebima padidjusi NF-B koncen-tracija oro tak lsteli branduoliuose, ir udegiminse lstelse indukuot skrepli mginiuose [6], bei padidjusi p65, IB, IKK baltym sintez serganij stipria nekontroliuojama astma periferinio kraujo lstelse [41]. Taip pat astmos metu stebimas citokin, kuri gen raik reguliuoja NF-B, koncentracijos padidjimas oro tak epitelyje [42]. Be to tyrimai su pelmis, kuri kvpavimo tak epitelio lstelse buvo nuslopinta NF-B aktyvacija, parod, kad po poveikio kvepiamais alergenais isivysto silp-nesnis udegiminis atsakas, nustatoma sumajusi citokin ir chemokin koncentracija [43].

NF-B reguliuoja udegimini T lsteli aktyvinim, diferenciacij ir funkcijas [44, 45]. Nustatyta, kad alergins astmos pamjimo metu (po bronch provokacijos alergenais), tiek ankstyvoje, tiek vlyvoje fazse stebimas padidjs Th17 limfocit kiekis periferiniame kraujyje bei didesn IL-17 koncentracija serume ir indukuotuose skrepliuose [46, 47]. O IL-17 yra vienas i NF-B signalin keli aktyvinani veiksni [48, 49].

Vienas efektyvi astmos gydymo bd yra gliukokortikoidai, kurie veikia per NF-B reguliuojam udegimini gen transkripcijos inhibicij [50, 51].

13

1.2.3. NF-B kelio reguliacija ubikvitino proteosom sistema NF-B aktyvacijos ir veikimo keliai yra sudtingi ir ypatingai reguliuo-

jami [52]. Vienas pagrindini reguliatori yra ubikvitino proteosom sistema, dalyvaujanti bent trijose skirtingose NF-B signalinio kelio vietose (1.2.3.1 pav.) [53].

p50 ir p52 lstelse sintetinami kaip dideli neaktyvs baltymai pirmtakai p105 ir p100. Tam, kad susidaryt aktyvs baltymai, reikalinga ubikvitino-proteosom sistema, kurioje p105 ir p100 baltymai yra specifikai ir tiksliai ardomi. C galinis domenas yra suskaidomas, o i N-galins dalies susidaro p50 ar p52 [54]. Tad proteosomos pirmiausia dalyvauja aktyvaus NF-B dimero susiformavime.

Susidarius aktyv NF-B faktori slopina prisijungs IB baltymas, kuris veikia kaip inhibitorius paslpdamas p65 dal, reikaling translokacijai branduol. Kad kompleksas p50/p65/IB suirt, vykdomas dvigubas IB fosforilinimas. Fosforilint IB form atpasta ubikvitino ligaz, kuri j poliubikvitilina ir po to inhibitorius suardomas proteosomoje. Kai nebelieka IB, p50/p65 kompleksas gali laisvai lokalizuotis i citoplazmos branduol [29].

Taip pat UPS sistema dalyvauja sudtingame IKK komplekso aktyvini-me, kuris prasideda nuo lstels receptori, pvz., TNF receptoriaus [55]. Suadintas receptorius pritraukia didel grup vairi baltym, skaitant TRADD (su TN-1 receptoriumi susijs mirties domeno baltymas), kelet ubikvitino E3 ligazi TRAF2, TRAF5 (su TNF receptoriumi susij fak-toriai), baltym kinaz RIP1 ir kt. Dl komplekso susidarymo RIP1 yra poliubikvitilinamas ir gali aktyvinti IKK kompleks, kuris toliau fosforilina IB [29,56]. iame signaliniame kelyje ypatingai svarbus baltymo RIP1 ubikvitilinimas, kuris priklausomai nuo ubikvitino prijungimo vietos atlieka skirtingas funkcijas aktyvina baltym arba nukreipia j skaidymui proteo-somose [57].

1.2.4. Ubikvitino proteosom sistema Ubikvitino proteosom sistema yra atsakinga u daugumos lstelini

baltym, ypa trumpaami reguliacini ir vairi veiksni sugadint balty-m, skaidym [58]. Taip i sistema sveikaudama su kitais reguliaciniais lstels komponentais yra btina utikrinant normal lstels funkcionavim [59,60]. Pagrindin UPS dalis yra 26S proteosoma, vadinama tiesiog pro-teosoma. Tai ferment kompleksas, eantis vis eukariotini lsteli bran-duoliuose ir citoplazmoje [61]. 26S proteosom sudaro du subkompleksai: 20S erdin ir 19S reguliacin dalels (1.2.4.1 pav.) [62].

14

1.2.3.1 pav. Ubikvitino proteosom sistemos vaidmuo NF-B signaliniame kelyje

UPS dalyvauja: A susidarant aktyviam p50 baltymui, B IKK komplekso aktyvinime, C IB inhibitoriaus skaidyme.

15

20S dalel yra cilindro formos, sudaryta i keturi vienas ant kito sudt ied, kuri kiekvien sudaro septyni atskiri subvienetai. Du ioriniai iedai sudaryti i identik tipo subvienet, o du vidiniai i tipo subvienet [54, 63, 64]. edai kartu su 19S reguliacine dalele suformuoja siaur ka-nal, pro kur gali praeiti tik denatruoti baltymai [61]. O iedai, kuri kiekviename yra po tris aktyvias vietas, suformuoja katalitin ertm, kurioje laipsnikai vyksta baltym skaidymas. Aktyvios vietos skiriasi savo akty-vumu ir specifikumu substratui, todl jos pavadintos pagal fermentus, kurie turi pana proteolitin aktyvum ir specifikum: panaus chimo-tripsin, panaus tripsin ir panaus post-glutamil peptido hidrolaz [61, 65, 66]. Baltymai proteosomose suskaidomi iki 325 aminorgi ilgio peptid [67].

Abu 20S galus dengia 19S reguliacins dalels, sudarytos i 17 skirting subvienet: 9 subvienetai, kuri 6 yra ATPazs, suformuoja pagrind, o 8 ne ATPaziniai subvienetai dangtel [64, 68]. Reguliacin dalel atlieka daug funkcij: atpasta ubikvitinu ymtus baltymus ir kitus proteosomai tinka-mus substratus, sukuria kanal iede, per kur substratai galt patekti proteolitin ertm. Kadangi nedenatruoti baltymai negali praeiti pro iedo kanal, 19S dalel pirmiausiai paalina poliubikvitino grandin, tuomet ilanksto substrat ir veda proteolitin erd [59]

Paprastai UPS veikia dviem vienas paskui kit sekaniais ingsniais: ubikvitino molekuli prijungimas prie substrato, kur atlika trys skirting tip fermentai E1, E2 ir E3, ir paymto baltymo suskaidymas 26S proteo-somoje bei ubikvitino perdirbimas (1.2.4.1 pav.). Pirmiausia, naudojant ATP energij, ubikvitin aktyvinantis baltymas E1 aktyvina ubikvitino C-galin glicino liekan. Tuomet aktyvinta ubikvitino dalel perkeliama ant E2 ubikvitin perneanio baltymo. E3 eimos baltymas, ubikvitino ligaz, atpasta ir prisijungia baltym taikin, prie kurio E2 perkelia aktyvint ubikvitin. is ciklas kartojasi, kol suformuojama pakankamo ilgio ubikvi-tino grandinl ant baltymo taikinio [60, 64, 69]. Trumpiausia ubikvitino grandinl reikalinga skmingam nukreipimui proteosomas yra sudaryta i keturi molekuli [70]. Tam tikr baltym paymjimui ubikvitino gran-dinle reikalingas dar vienas baltymas E4, grandins ilginimo faktorius [71].

Nustatyta, kad proteosomos gali ardyti baltymus, nepaymtus ubikvi-tinu, be to baltym skaidyme gali dalyvauti tik 20S dalel, be 19S [72, 73]. Taip daniausiai bna esant esant oksidaciniam stresui, kurio metu nuo 26S disocijuoja 19S dalel [74]. Be to 20S dalel gali bti susijungusi su kitomis reguliacinmis dalelmis PA200, PA28, kuri veikimui nereikia ATP energijos ir baltym ymjimo ubikvitinu, dl to tokios proteosomos gali ardyti kitokius substratus nei 26 proteosoma [75, 76].

16

1.2.4.1 pav. Ubikvitino proteosom sistemos kelias ir 26S proteosomos sandara

Tad UPS yra sudtingas ir svarbus lstels mechanizmas, atsakingas ne

tik u baltym proteoliz. is mechanizmas skaidydamas baltymus daly-vauja svarbi lstels funkcij reguliavime [61, 77, 78]. Daugja rodym, kad neproteolitinis ios sistemos veikimas yra toks pats svarbus lstels funkcionavimui ir lig isivystymui [78].

UPS sistema svarbi ir normaliam plaui lsteli funkcionavimui [79], o proteosom inhibitoriai gali sumainti udegimini citokin gamyb, ude-gimin atsak [80], ir gali bti panaudoti su T lstelmis susijusio udegimo gydymui [81]. Taiau proteosom inhibitori poveikis kvpavimo tak u-degimui pasitvirtina ne visuose tyrimuose [82].

17

1.3. Astmos rizikos veiksniai Astma yra heterogenin liga, kuri kyla dl sudting sveik tarp gene-

tini ir aplinkos (ne genetini) veiksni [83]. Tad vardinti vien veiksn, galint lemti ligos isivystym, yra nemanoma.

1.3.1. Aplinkos veiksniai Atliekama daug vairi epidemiologini tyrim, iekant astmos isivys-

tym ir ligos eig bei sunkum takojani veiksni. Jau nustatyta, kad di-desnis kno svoris ir nutukimas gali padidinti rizik susirgti net iki 50 proc. [84]. Lytis taip pat turi takos astsmos isivystymui. Ankstyvame amiuje didesnis sergamumas stebimas tarp berniuk, taiau vyresniame amiuje moterys turi 20 proc. didesn tikimyb nei vyrai susirgti astma ir j ligos eiga bna sunkesn [17, 19].

Danai su astmos isivystymu siejami aplinkos veiksniai yra oro tara, danos kvpavimo tak infekcijos, rkymas ir kiti [19, 85]. Aplinkos veiks-niai yra svarbs ne tik ligos atsiradimui, bet gali bti jos pasikartojimo bei pamjimo prieastis. Oro taros dalels gali paeisti oro takus, sukelti si-jautrinim ar udegim, tad mons, ypa vaikai, gyvenantys labiau uter-tuose regionuose turi didesn rizik susirgti ar sulaukti ligos pamjimo [86]. Virusiniai susirgimai (rinoviruso infekcijos) taip pat siejami su astmos pamjimu [87]. Be to tiek vidaus, tiek lauko ore yra vairi alergen: ie-dadulks, kai ir un epidermio dalels, nam dulki erkuts, gryb spo-ros ir k.t. Esant nuolatiniam i alergen poveikiui galimas organizmo si-jautrinimas ir padidinta tikimyb susirgti astma ar kitomis alerginmis li-gomis [88].

Taip pat tyrinjamos psichosocialini faktori, toki kaip stresas, de-presija, ssajos su astma [19].

1.3.2. Genetiniai veiksniai Genetiniai veiksniai yra labai svarbs astmos isivystymui. Genetins

variacijos svarb parodo ir tai, kad ne visiems asmenims tas pats poveikis duoda vienod rezultat. Vidutinikai 50 proc. rizikos susirgti astma gali lemti genetins variacijos tarp asmen [83]. Tyrim su dvyniais duomeni-mis astmos paveldimumas svyruoja tarp 35 ir 70 procent [83].

Astma sudtinga liga ir jos isivystymui tak gali daryti daugyb gen bei j variant, kiekvienas su skirtingo stiprumo poveikiu. Ir nors nustatyta nemaai gen kanditat, kol kas dar nra klinikinje praktikoje svarbi

18

genetini variant. Tad intensyvios nauj gen polimorfizm ir j takos astmai mechanizm paiekos vyksta toliau.

Nustatyti galimus, su astmos isivystymu susijusius, genus ir j variantus yra naudojami keli pagrindiniai tyrimo metodai. Gen kandidat ssaj analiz (angl. Candidate gene association study), kurios metu pasirenkami ymenys gen polimorfizmai, tiriami serganij grupje ir rezultatai lyginimai su kontrolins grups, neturinios ligos poymi, duomenimis. Danai iam tyrimui pasirenkami genai ar j polimorfizmai dl inomos funkcijos, susijusios su liga, ar dl jau nustatyt ssaj su panaiomis ligo-mis. is tyrimo modelis naudojamas ir iame moksliniame darbe. Kitas me-todas viso genomo ryi tyrimai (angl. Genome wide linkage), koncent-ruojasi eimas, kuriose pasireikia tiriama liga. Ir naujausia plataus masto genomo asociacij analiz (angl. Genome wide association study, GWAS), naudojanti VNP ymenis, kurie dengia beveik vis mogaus genom. Taip galima aptikti net visikai naujus su liga susijusius genus bei j variantus. Be to iam tyrimo metodui nereikia eim su pasikartojaniais ligos atvejais [89].

Naudojant iuos metodus yra nustatyta nemaai chromosomini region ir juose esani gen variant, galini prisidti prie asmos isivystymo. J yra beveik visose chromosomose. 1.3.2.1 lentelje surayti ssajas su astma rodantys regionai ir genai, pagal viet chromosomose. Daugumos j funkci-jos siejasi su udegiminiu ir imuniniu atsaku. Pagal Donata Vercelli apval-g [90] su astma ssajas rodanius genus galima suskirstyti 4 pagrindines grupes: genai susij su gimtu imunitetu ir imunoreguliacija; genai susij su Th2 lsteli diferenciacija ir efektorinmis funkcijomis; genai susij su epitelio biologija ir gleivins imunitetu; genai susij su plaui funkcija, kvpavimo tak remodeliacija ir ligos sunkumu.

Tiriama daug udegiminius citokinus koduojani gen. Interleukin 13, kuris yra pagrindinis udegiminis citokinas alerginio udegimo metu, ko-duojantis genas IL13 rodo stiprias ssajas su astma vairiuose tyrimuose. io geno polimorfizmai rs20541 (+2044G>A, lemia Arg pakeitim Gln) ir rs1800925 (12C>T), esantys IL13 promotoriaus regione, rodo ssajas ne tik su astma, bet ir atopija, atopiniu dermatitu, padidjusiu bendru serumo IgE kiekiu bei ltine obstrukcine plaui liga [9092]. Interleukin 4 koduo-janio geno IL4 promotoriaus polimorfizmai rs2243250 (589C>T) ir rs2070874 (33C>T) taip pat rodo ssajas ir su astma, ir alerginiu rinitu bei bendru serumo IgE kiekiu [9395].

Yra kit gen, kuri polimorfizmai rodo ssajas ne tik su astma bet ir su kitomis su astma nesusijusiomis ligomis. Pvz., CD38 variantai rodo ry su ltine limfocitine leukemija [96], IL13 ir IL4R su inkst karcinoma [97], ORMDL3 su opinio kolito isivystymu [98].

19

iuo metu labiausiai tyrinjamas yra 17q12-21 regionas. Pirm kart nustatytas tiriant GWAS metodu astma serganius vaikus [99]. iame re-gione esantys ORMDL3 ir GSDMB genai ir j VNP parod statistikai reik-ming ry su astma ir kituose tyrimuose [99101]. Dauguma studij rodo, kad is regionas siejasi su labai ankstyvojo amiaus astma, ir suaugusij ligos netakoja [102104]. Taiau koks tikslus 17q regiono gen polimorfiz-m takos astmai mechanizmas dar nra aiku [100].

ORMDL3 geno koduojamas baltymas priklauso konservatyvi transmem-branini baltym eimai, kurie lokalizuoti endoplazminiame tinkle (ET). ORMDL baltymai reguliuoja sfingolipid gamyb, dalyvauja metaloprotea-zi ir citokin signalini keli reguliacijoje. Taip pat aktyvina ATF-6 signalin keli, kuris reguliuoja kalcio pompos SERCA2b (sarkoplazminio/ endoplazminio tinklo ATPazs) gen raik ir taip gali bti susijs su kv-pavimo tak remodeliacija astmos metu [98, 102]. Tyrimai su pelmis pa-rod, kad po provokacijos alergenais ORMDL3 geno transkripcija bronch epitelio lstelse stipriai iaugo [106], be to padidinta ORMDL3 baltymo ekspresija sukel kvpavimo tak pokyius, bdingus astmai [107]. Gasder-minas B, koduojamas GSDMB geno, yra gasdermino domen turini bal-tym eimos narys. ie baltymai dalyvauja daugelyje lstelini proces, susijusi su lsteli diferenciacija, lstels ciklo kontrole, apoptoze [108]. Ir nors nra inoma, koks tikslus geno veikimo mechanizmas astmos metu, nustatyta, kad astma sergani moni plaui bronch epitelio lstelse GSDMB baltymo kiekiai yra ymiai didesni nei sveik asmen lstelse, o transgeninms pelms, kurios ekspresuoja didelius kiekius mogaus GSDMB baltymo, isivysto padidintas oro tak jautrumas ir j pokyiai [109].

ADAM33 genas, pirmkart nustatytas viso genomo ryi analizs metu tiriant 460 kaukaziei eim [110]. Geno koduojamas baltymas yra disin-tegrino ir metaloproteazi eimos narys. Manoma, kad ADAM baltymai atlieka svarb vaidmen lsteli adhezijos, proliferacijos, diferenciacijos, apoptozs procesuose, dalyvauja signaliniuose keliuose ir udegiminiuose procesuose [111]. Nustatytos ADAM33 variant ssajos su vairiais astmai bdingais pokyiais: padidjusiu bronch jautrumu, kvpavimo tak remo-deliacija, susilpnjusiomis plaui funkcijomis, ir kt. [112]. Taip pat nu-statyta padidjusi ADAM33 baltymo sintez serganij astma bronch epi-telio, lygiojo raumens ir mezenchiminse lstelse [113]. Ir nors nra i-nomos tikslios ADAM33 biologins funkcijos, manoma, kad dl didels raikos epitelio, fibroblast ir lygij raumen lstelse, baltymas gali da-lyvauti kvpavimo tak remodeliacijoje, ir yra potencialus astmos taikinys [114].

20

Ne visi gen variant ryiai su astma pasitvirtina atliekant tyrimus kitais metodais ar su kitomis etninmis grupmis. Ir vienuose tyrimuose ssajas su liga rod polimorfizmai, nepasitvirtina kituose [108, 115, 116], arba pra-randa statistin reikmingum atliekant platesnio masto tyrimus ar metaana-lizes. Pvz., CC10 geno, kuris koduoja Klara lsteli gaminam 10 kilo-dalton baltym, polimorfizmo rs3741240 (+38A/G) tyrimai rod ssajas su astma atskiruose tyrimuose [117, 118], polimorfizmo poveik patvirtino ir 10 studij metaanaliz [119], bet po poros met atlikta atnaujinta meta-analiz (15 studij) ssaj neaptiko [120]. Dl to labai svarbus tiriamj grupi parinkimas.

Gali bti, kad didel dalis rizikos susirgti astma kyla dl genotipui spe-cifinio atsako aplinkos poveikius viso gyvenimo metu, ypa ankstyvos vai-kysts periodu. Skirtingi polimorfizm variantai gali sietis tiek su padid-jusia ligos rizika, tiek su apsauga nuo jos. Taip pat daugiaveiksnms ligoms bdingi sudtingi ryiai tarp gen ir tarp aplinkos faktori. Dl to kiekvieno mogaus asmenin rizika susirgti tam tikra liga gali kisti dl nuo genotipo priklausomo atsako daugel veiksni [83, 90].

21

1.3.2.1 lentel. Nustatyti chromosom regionai ir genai, susij su astmos isivystymu

Chromo-soma Regionas Genas Apraymas, funkcija* Nuorodos

1 2 3 4 5 1 1p31

1p13.2 1q21.3 1q32.1

NFIA CHIA ILR6 IL10

Branduolio transkripcijos faktorius. Rgtin induoli chitinaz. Dalyvauja Th2 imuniniame atsake. Interleukino 6 receptorius. Interleukinas 10, imonoreguliacija. Citokin sintezs slopinimas.

[121] [122] [123, 124] [125]

2 2q12 IL1RL1, IL18R1

Interleukino 33 receptorius. Gali dalyvauti T helperi veikloje. Interleukino 18 receptorius. Dalyvauja imuniniame atsake.

[126,127]

3 3p21.3 CCR Chemokin receptoriai. [128] 4 4q31 USP38-

GAB1 Ubikvitino peptidaz. Dalyvauja UPS kelyje. Adaptorinis baltymas. Dalyvauja vidulsteliniuose signaliniuose keliuose.

[129]

5 5q31 5q31-32

RAD50 IL13 IL4 SLC6A7 ADRB2

DNR taisantis baltymas. Komplekso, tvarkanio DNR, dalis. Interleukinas 13. Imunoreguliacinis ir udegiminis citokinas. Interleukinas 4. B lsteli aktyvacija, imuninis atsakas. Nuo natrio priklausomas pernaos baltymas. Beta 2 adrenerginis receptorius.

[130] [131] [94] [132] [90]

6 6p23 6p21 6q21

CD38 HLADR/DQ FOXO3

Transmembraninis glikoproteinas. HLA II klass molekuls. Dalyvauja baltym pateikime ir imuninje lsteli veikloje. Transkripcijos faktorius. Dalyvauja apoptozs reguliacijoje.

[126] [129, 130, 133] [134]

7 7p14 7p15

GPRA IL6

Neuropeptid receptorius. Dalyvauja lsteli augimo reguliacijoje. Interleukinas 6. Dalyvauja imunini lsteli brendime, udegiminiuose procesuose.

[135] [136]

8 8p22 NAT2 N-acetiltransferaz. Arilamino ir hidrazino jungini bei karcinogen deaktyvacija. [137, 138] 9 9q33 TLR4 Receptorius. Dalyvauja imuniniame atsake bakterinius lipoposisacharidus. [139]

22

LSMU135Rectangle

1.3.2.1 lentels tsinys 1 2 3 4 5 10 10p14 GATA3 Transkripcijos faktorius. Dalyvauja Th2 lsteli diferencijacijoje. [129, 140]

11 11q13.5 11q12.3

CC10

Ma sekretuojam baltym eimos narys. Dalyvauja prieudegiminiuose procesuose.

[124] [119]

12 12q13 STAT6 STAT eimos transkripcijos faktorius. Dalyvauja IL4 ir IL13 signaliniuose keliuose.

[129, 141, 142]

14 14q24 14q11

CMA1

Chimaz, ekspresuojama putlij lsteli.

[143] [144146]

15 15q22 SMAD3 RORA

Baltymas dalyvauja vairi vidulstelini signal perdavime. Baltymo receptorius. Dalyvauja lsteli diferencijos, imuniteto ir kt. procecuose.

[144] [127, 147]

16 16p12 IL4R Interleukin IL4 ir IL13 receptori grandin. [148, 149]

17 17q12-21 17p13

ORMDL3/ GSDMB NLRP1

Sfingolipid sintezs reguliatorius. Gasdermino domen turini baltym eimos narys. Inflamasomos dalis. Dalyvauja imuniniuose ir udegiminiuose procesuose.

[126, 127, 150, 151] [152, 153]

19 19q13 TGFB1 Augimo faktorius. Dalyvauja lsteli proliferacijoje, diferenciacijoje ir imunoreguliacijoje.

[154, 155]

20 20p13 ADAM33 Disintegrino ir metaloproteinazs domen turini baltym eimos narys. Dalyvauja lstels-lstels ir lstels-matrikso sveikose.

[156, 157]

22 22q12 22q11

IL2RB GSTT1

Interleukino 2 receptorius. Dalyvauja T lsteli imuniniame atsake. Glutationo S transferaz. Dalyvauja lsteli detoksifikaciniuose procesuose.

[127] [158, 159]

X Xq13 CXCR3 Chemokin receptorius. Dalyvauja lsteli proliferacijoje. [160, 161] *Baltym apraymai ir funkcijos pateiktos pagal UniProt [162] ir NCBI gene [163] duomen bazi informacij 2017 m.

23

1.4. NF-B signalinio kelio baltymus koduojani gen polimorfizmas

1.4.1. Proteosom subvienetus koduojantys genai

Proteosomoms dalyvaujant udegiminiuose ir kituose svarbiuose lstels

procesuose, daugja hipotezi, jog proteosomas koduojantys genai ar j variantai gali turti takos vairi mogaus lig isivystymui.

iuo metu didiausias susidomjimas skiriamas PSMA6 proteosom alfa tipo 6 subvienet koduojaniam genui, kuris yra 14 chromosomos 14q13.2 regione [164]. is genas yra vienas evoliucikai konservatyviausi alfa eimos nari, dl to manoma, jog net nedideli pokyiai jo raikoje gali pakeisti proteosomos veikim.

Nustatyta, kad PSMA6 geno variantai gali slygoti miokardo infarkt Ja-pon populiacijoje. Kouichi Ozaki ir koleg atlikto genotipavimo rezultatai parod, kad vienas VNP (8C/G, rs1048990) esantis PSMA6 geno pirmo egzono 5` netransliuojamame regione buvo reikmingai susijs su miokardo infarktu (MI). Manoma, kad G alelis, padidina PSMA6 transkripcij, dl kurios gali sustiprti udegimas per NF-B faktoriaus aktyvacij [165]. Stu-dija su kin populiacija taip pat patvirtino io VNP svarb MI [166]. Be to nustatytos PSMA6 polimorfizmo ssajos su antro tipo cukriniu diabetu [167,168] ir diabetu sergani moni jautrumu miokardo infarktui [169]. Spjama, kad antro tipo diabetu sergani moni padidjusi PSMA6 geno transkripcija gali prisidti prie sustiprjusio udegiminio atsako per greitesn IB inhibitoriaus skaidym ir dl to padidjusi NF-B aktyvacij [169].

Taip pat nustatytos keli mikrosatelitini ymen, esani PSMA6 gero regione ir aplink j, polimorfizmo ssajos su Greivso autoimunine skyd-liauks liga [170]. O PSMA6 rs1048990 G alelis daugins mielomos atveju gali bti igyvenimo prognozs faktorius [171].

Kiti proteosomas koduojantys genai taip pat rodo ssajas su vairiomis ligomis skirtinguose tyrimuose. PSMB8 (LMP7, proteosom beta tipo 8 subvienetas) ir PSMB9 (LMP2, proteosom beta tipo 9 subvienetas) gen VNP gali bti susij su pirmo tipo cukrinio diabeto isivystymu [172]. Taip pat PSMB8 VNP variantai gali padidinti didelio jautrumo pneumonito i-sivystymo rizik [173]. PSMA4 proteosom alfa tipo 4 subvienet koduo-jantis genas yra 15q24-15q25.1 regione, kuriame nustatytas ryys su plaui viu [174,175], o in vitro studijos parod, kad is genas atlieka svarb vaidmen vio lsteli proliferacijoje [166].

Nors daugelis tyrim rodo proteosomini gen polimorfizm svarb skirting, ypa udegimini, lig isivystymui, kai kurie rezultatai yra

24

prietaringi [168, 176, 177]. Ir visa proteosom subvienetus koduojani gen bei j polimorfizm taka ligoms dar nra aiki.

1.4.2. NF-B branduolio faktori koduojantys genai NF-B faktoriaus p50/p105 subvienet koduoja NFKB1 genas. NFKB1

yra sudarytas i 24 egzon ir lokalizuotas 4 chromosomos ilgojo peties q24 segmente [178]. Vienas i labiausiai tyrinjam io geno polimorfizm yra 4 nukleotid pokytis 94 ins/del ATTG (rs28362491) promotoriaus regione. is polimorfizmas gali reguliuoti promotoriaus aktyvum ir reguliacini baltym prisiriim. Susilpnjs del/del varianto promotoriaus aktyvumas buvo nustatytas in vitro tyrimais [179].

Promotoriaus regione esantys polimorfizmai gali turti takos NFKB1 geno ekspresijai, ir taip keisti vairi udegimini citokin transkripcij bei vairi udegimini ir kit lig vystymsi ir eig. Ities tyrim duomenimis rs28362491 variantai gali prisidti prie lig isivystymo rizikos. Buvo nustatyta, kad ins alelis 1,8 karto padidino rizik susirgti Behceto (Behet) liga, o tiriamiesiems, turintiems homozigotin ins/ins genotip, rizika padi-djo iki 2,5 karto [180]. Taip pat nustatyta ins/del ir del/del genotip ssaja su padidjusia krties vio rizika [181], opiniu kolitu [179], ir diabetine nefropatija [182]. Be to is polimorfizmas gali turti takos ir kit tip vio isivystymui [183185].

NFKB1 polimorfizmas rs12509403 (C/T), esantis introne, taip pat gali bti susijs su geno ekspresija, kepen funkcijos pokyiais [186]. O kito introninio polimorfizmo rs4648068 (A/G) genotipas GG buvo reikmingai susijs su padidjusia skrandio vio rizika [187]. Su skrandio viu s-sajas rod ir NFKB1 polimorfizm, esani nepusiausvyroje sankiboje, haplotipai [188].

RELA geno, koduojanio p65 subvienet, polimorfizmas rs11820062 rod ssajas su polinkiu ltines kepen ligas [186], izofrenij [189] bei padidjusia rizika C hepatito viruso infekcijai [190].

1.4.3. Inhibitori IB koduojantys genai Transkripcijos faktoriaus NF-B inhibitorius (IB) yra koduojamas

NFKBIA geno sudaryto i 6 egzon 14 chromosomos ilgojo peties q13 seg-mente (14q13) [178]. IB yra svarbus NF-B aktyvum reguliuojantis veiksnys, todl NFKBIA geno pokyiai taip pat gali bti reikmingi NF-B signalinio kelio reguliacijai udegimini proces metu. Dl to tiriamos NFKBIA polimorfizm ssajos su vairiomis ligomis.

25

Netransliuojamam NFKBIA geno 3UTR regione esanio rs696 (+2758G>A) polimorfizmo AA genotipas reikmingai daniau nustatytas Behceto liga sergantiems nei sveikiems asmenims [180]. Be to is polimor-fizmas svarbus ir Krono ligos isivystymui [191]. Taip pat rs696 rodo s-sajas su vio isivystymu. Nustatytas rs696 genotipo AA ryys su nosia-rykls karcinoma [192], o GG su storosios arnos viu [185].

NFKBIA geno promotoriaus regione esantys VNP rs3138053 (881A>G), rs2233409 (297C>T) ir rs2233406 (826C>T) gali takoti promotoriaus aktyvum, geno ir IB baltymo ekspresij. Genas, turintis i VNP ret aleli haplotip GTT, ekspresuojamas silpniau nei ACC variantas [193]. Retas rs2233406 alelis buvo susijs su padidjusia sunkaus bron-chiolito rizika [193], rs2233406 ir rs2233409 polimorfizmai su daugins mielomos isivystymo rizika [194]. O pirmame geno egzone esantis rs1957106 (+81C>T) polimorfizmas buvo susijs su susilpnjusia NFKBIA geno raika glioblastomos lstelse [195].

NFKBIB genas, koduojantis inhibitori IB, taip pat turi funkcin poli-morfizm rs9403, kuris susijs su pasikeitusia geno raika ir baltymo kiekiu, priklausomai nuo lsteli tipo. Didiausias jo kiekis nustatomas kepenyse [196]. NFKBIB geno polimorfizmai rodo ssajas su reumatoidiniu artritu [197], nors ne visuose tyrimuose [198].

Dar vienas genas NFKBIE koduoja inhibitori IB. Nustatyta, kad jo variantai gali bti svarbs reumatoidinio artrito isivystymui, ypa rs2233434 (T>C) polimorfizmas, kuris keiia aminorgtis baltymo sekoje (Val194Ala) ir gali takoti NFKBIE geno raik [199], taip pat pakeisti metotreksato sisavinim [200]. Kitas io geno polimorfizmas rs529948 (G>T) statistikai patikimai siejosi su invazine pneumokokine liga, tiriant serganius vaikus [201].

Tad IB polimorfizmai prisiddami prie inhibitori gen raikos poky-i, gali bti svarbs NF-B signalinio kelio pokyiams ir udegimini pro-ces reguliavimui vairi lig metu.

26

2. TYRIMO MEDIAGA IR METODAI

Mokslinis tyrimas buvo atliktas 20112016 m. Lietuvos sveikatos moks-l universiteto (LSMU) Medicinos akademijos (MA) Laboratorins medi-cinos klinikoje. 20112013 m atliktas tyrimas buvo Lietuvos moksl tary-bos finansuoto projekto Proteosomini gen aleli, kaip bronch astmos rizikos veiksni tyrimas, Latvijoje, Lietuvoje ir Taivanyje (TAP LLT 08/2012) dalis, vykdyta kartu su LSMU MA Pulmonologijos ir imuno-logijos klinika. Tyrimui atlikti buvo gautas Kauno regioninio Biomedici-nini tyrim etikos komiteto leidimas (Nr. BE-2-31). 2016 m. darbo tsimui buvo gautas Kauno regioninio Biomedicinini tyrim etikos komiteto leidi-mas (Nr. BE-2-10), tyrimas dalinai finansuotas LSMU MA mokslo fondo. Mokslinio tyrimo schema pateikiama 2.1 paveiksle.

2.1 pav. Mokslinio tyrimo schema

27

2.1. Tiriamj kontingentas ir mgini surinkimas mokslin tyrim buvo trauktas 321 asmuo, i j 169 buvo diagnozuota

astma remiantis pasaulins astmos iniciatyvos (GINA) 2010 m. kriterijais. Visi tiriamieji 20112014 m. lanksi LSMUL Kauno klinikose ar Kauno mecinos eimos centre ir buvo atrinkti gydytojo alergologo klinikinio imunologo pagal nustatytus kriterijus.

Bendrieji traukimo kriterijai: ne jaunesni nei 18 met amiaus, nesergantys infekcinmis ligomis, nesergantys autoimuninmis, vinmis ar kitomis ltinmis ligomis

(iskyrus astm). Papildomas traukimo kriterijus astma sergantiems: astmos simptomai trunkantys ne trumpiau nei 2 metus iki tyrimo pra-

dios. Papildomas traukimo kriterijus kontrolinei grupei: nra pasireikiani alergijos simptom. Visi asmenys, sutik dalyvauti tyrime, buvo supaindinti su mokslinio

tyrimo protokolu ir pasira informuoto asmens sutikimo formas. Vizito metu dalyviams buvo paimti periferinio kraujo mginiai: 2 ml kraujo deok-siribonukleino rgties (DNR) iskyrimui imti mgintuvlius su EDTA ir 5 ml kraujo serumo tyrimams mgintuvlius be pried.

Mgintuvliai, skirti DNR iskyrimui, buvo laikomi aldytuve + 8 C temperatroje ne ilgiau nei 2 savaites, mgintuvliai serumo tyrimams buvo palaikomi kambario temperatroje apie 30 min, nucentrifuguoti, serumas ipilstytas po 300 l ir aldomas 80 C temperatroje.

2.2. DNR iskyrimas i periferinio kraujo

DNR i periferinio kraujo buvo iskirta, naudojant komercin QIAamp

DNA Blood mini kit rinkin (Qiagen, Vokietija), pagal gamintojo protokol. Mgintuvliai su krauju buvo nucentrifuguoti. Imta po 200 l susidariusi leukocit sluoksnio ir atlikta lsteli liz, pridedant 20 l proteazs ir 200 l lizs buferio. Miinys buvo gerai imaiomas ir inkubuotas kaitinimo bloke 56 C temperatroje 10 min. DNR isodinta miin pilant 200 l 96100 proc. etanolio ir gerai sumaiant purtykle. Mginiai trumpai nucentrifu-guoti. Susidars lizatas i mgintuvli buvo atsargiai perkeltas ant QIAamp MinElute kolonli, udt ant 2 ml surinkimo mgintuvli. Kolonls nucentrifuguotos 8000 rpm greiiu 1 min. Supernatantas su lstels lieka-

28

nomis, esantis surinkimo mgintuvlyje paalintas, kolonls perkeltos ant nauj mgintuvli. Prie membranos prisiriusi DNR praplauta dviem plo-vimo buferiais. Ant kolonls membranos upilta 500 l buferio AW1. Kolonls nucentrifuguotos 8000 rpm greiiu 1 min, kolonls perkeltos ant nauj mgintuvli. Ant kolonli upilta 500 l buferio AW2, nucentrifu-guota 8000 rpm greiiu 1 min. Kolonls darkart perkeltos ant nauj mgintuvli ir centrifuguotos 3 min. 14 000 rpm greiiu. Tuomet kolonls perkeltos varius 1,5 ml mgintuvlius, ant membran upilta po 200 l eliucijos buferio ir inkubuota kambario temperatroje 5 min. Viskas centri-fuguota 14 000 rpm greiiu 1 min., kad iskirtos DNR eliucija bt atskirta nuo membranos.

DNR koncentracija buvo matuota, naudojant Quant-iT dsDNA BR Assay Kit rinkin ir matavimo prietais Qubit fluorometer (Invitrogen, JAV) pagal gamintojo pateiktas rekomendacijas.

Iskirta DNR buvo saugoma 20 C aldiklyje.

2.3. Proteosomas koduojani gen polimorfizmo nustatymas iame darbe PSMA3, PSMA6 ir PSMC6 gen pasirinkti VNP buvo nu-

statyti naudojant aleliui specifins amplifikacijos (ASA, angl. Allele specific amplification) ir pagausint bei sukarpyt polimorfini sek (CAPS, angl. Cleaved amplified polymorphic sequence, kitaip PGR-RFIP polimerazins grandinins reakcijos restrikcijos fragment ilgio polimorfizmo) metodus (2.3.1 lentel).

ASA metodu skirtingi VNP genotipai yra nustatomi naudojant skirtin-giems aleliams specifinius pradmenis atskirose PGR reakcijose. CAPS metodu nustatomi PGR bdu pagausint fragment VNP, kurie sukuria ar panaikina restrikcijos ferment prisijungimo vietas. Dl to skiriasi sukarpyt fragment ilgiai, analizuojant juos agarozs gelyje.

ie metodai proteosomini gen polimorfizm tyrimui buvo pritaikyti ir naudojami pradmenys sukurti prof. Tatjanos Sjakstes ir jos koleg i Lat-vijos universiteto biologijos instituto

2.3.1 Polimerazin grandinin reakcija (PGR)

Kiekvienam polimorfizmui buvo ruoiami atskiri PGR reakcijos miiniai,

dedant atitinkamus pradmenis. Tyrimui buvo naudojama po 5 l DNR (koncentracija apie 50 g/ml). Reakcij bendras tris 30 l. Kit reakcijos dali kiekiai priklaus nuo naudojamos polimerazs ir yra nurodyti 2.3.1.1 lentelje. iame darbe buvo naudotos trys skirtingos polimerazs ir

29

gamintojo joms pritaikyti reakcij buferiai: KapaTaq DNR polimeraz 5U/l (KAPA Biosystems, JAV), Taq DNR polimeraz, rekombinantin 5U/l (Thermo Scientific, Lietuva) ir DreamTaq polimeraz (DreamTaq Green PCR Master mix 2X sudtyje, Thermo Scientific, Lietuva).

Atliekant PSMA6 rs2277460 polimorfizmo PGR, vienam mginiui buvo ruoiami du reakcijos miiniai su skirtingais tiesioginiais pradmenimis (pradmen sekos nurodytos 2.3.1 lentelje).

Visos PGR reakcijos buvo atliekamos atitinkamomis slygomis: 1. pradin denatracija 94 C 5 min; 2. 3540* cikl:

a. denatracija 94C 30 s, b. pradmen prisijungimas esant atitinkamai temperatrai (5561 C)*

30 s, c. sintez 72C 45 s;

3. papildoma sintez 72 C 7 min; 4. pabaiga 4 C neribot laik. *Tikslus reakcijos cikl skaiius ir pradmen prisijungimo temperatra

kiekvienam polimorfizmui nurodyta 2.3.1 lentelje. PGR produkt patikrinimui ir rs2277460 polimorfizmo genotipo

nustatymui buvo atliekama elektroforez 2 proc. agarozs gelyje. Kartu su mginiais buvo leidiamas DNR molekulins mass ir dydio standartas Ultra Low Range ar pUC19 (Thermo Scientific, Lietuva).

2.3.1.1 lentel. PGR reakcij paruoimas, pagal naudotas DNR polimerazes

Reakcijos komponentai DNR Polimeraz

KapaTaq Taq DNA DreamTaq Sterilus vanduo 19,5 17,8 8,0 Reakcijos buferis 3,0 3,0 15 MgCl2, 25 mM * 1,5 * Tiesioginis pradmuo, 10 M 1,0 1,0 1,0 Atvirktinis pradmuo, 10 M 1,0 1,0 1,0 dNTP miinys, 25 mM 0,3 0,5 * DNR polimeraz, 5U/l 0,2 0,2 * Tiriamoji DNR 5,0 5,0 5,0 Bendras reakcijos tris: 30

*Reakcijos buferyje yra i komponent, dl to papildomai nedta. Visi kiekiai nurodyti mikrolitrais.

30

2.3.1 lentel. Proteosomas koduojani gen VNP nustatymas

Genas VNP kodas (Pokytis)

Genotipa-vimo

metodas

Pradmen seka

Pradmens prisijungimo temperatra / cikl skaiius

PGR produkto ilgis. bp

Restrikcijos fermentas/

veikimo temperatra

PSMA6

rs2277460 (110C>A) ASA F

A -5-ATGCAAGAGCGGAAGAAAA-3 FC -5-ATGCAAGAGCGGAAGAAAC-3 R-5-TACCATGACAGGGCAATTCAG-3

55C / 35 255

rs1048990 (8C>G) CAPS RsaI/37 C

PSMC6

rs2295826 (128104A>G)

CAPS F-5-GCTTAAACAAGTATTGCCGATCA-3

R-5-AAGGAAGAAAATAAAAAGCATTACTT-3

54C / 40

411

HpyF3I (DdeI)/ 37 C rs2295827

(12846C>T)

PSMA3 rs2348071 (543+138G>A) CAPS F-5-GTCTAAGGCAGGGATGTCCA-3 R-5-ACCAGCTTTCCCATTCAGTG-3 61C / 35 232

TscAI (TspRI)/ 65 C

VNP vieno nukleotido polimorfizmas, ASA aleliui specifin amplifikacija, CAPS pagausintos ir sukarpytos polimorfins sekos.

2.3.2. PGR produkt karpymas PGR produktai buvo karpomi, naudojant restrikcijos fermentus pagal

gamintojo pateikt protokol (Thermo Scientific, Lietuva). Kiekvieno poli-morfizmo genotipo nustatymui buvo naudojamos skirtingos restriktazs: rs1048990 RsaI (paprasta ir greito veikimo angl. Fast digest), rs2348071 TspRI (TscAI) (greito veikimo), rs2295826 ir rs2295827 buvo nustatomi vienos reakcijos metu naudojant DdeI (HpYF3I).

reakcijos miin buvo dedama po 10 l gauto PGR produkto. 0,51 l fermento, 3 l reakcijos buferio ir sterilaus vandens. Reakcij bendras t-ris 30 l. Reakcijos buvo vykdomos fermentams tinkamoje temperatroje (2.3.1 lentel) 1016 val. paprastoms ir 5 min. greito veikimo restriktazms.

Gauti fragmentai analizuoti 4 proc. agarozs gelyje pagal DNR molekulins mass ir dydio standart. Kiekvieno polimorfizmo sukarpyt PGR produkt fragmentai parodyti 2.3.2.1 paveiksle.

2.3.2.1 pav. Tirt polimorfizm restrikcijos fragment variantai

ir j analiz agarozs gelyje M molekulins mass standartas Ultra Low Range, MP molekulins mass standartas

pUC19, FI fragment ilgiai. A - rs1048990 variantai: 1 CC genotipas, 2 GG genotipas, 3 GG genotipas, 4 CG genotipas; B - rs2295826 ir rs2295827 variantai:

1 AA/CC genotipas, 2 AA/CC genotipas, 3 AG/CT genotipas, 4 GG/TT genotipas; C rs2348071 variantai: 1- AA genotipas, 2 AG genotipas, 3 GG genotipas.

32

2.3.3. Sekoskaita Norint patikrinti tyrimo rezultatus, 20 atsitiktinai parinkt mgini buvo

amplifikuoti anksiau nurodytais tirt VNP pradmenimis. PGR produktai ivalyti ir nusisti sekoskaitai Sanger metodu (Baseclear, Nyderlandai). Gauti rezultatai analizuoti programa Chromas 2.4.6 (laisvai prieinama inter-nete https://technelysium.com.au/wp/chromas/). Rezultat sutapimas buvo 100 proc.

2.4. NF-B polimorfizmo nustatymas

NFKB1 ir NFKBIA gen polimorfizmai buvo nustatyti naudojant metod,

pagrst konkuruojania aleliui specifine PGR KASP (angl.: competetive allele specific PCR), kuriuo galima nustatyti VNP ir ins/del variantus. Skir-tingi aleliai yra atpastami dl dviems skirtingiems aleliams tinkani tie-siogini pradmen konkuruojanio prisijungimo. Abu pradmenys yra y-mti unikaliomis sekomis, atitinkaniomis universalias FRET (angl.: Fluo-rescence resonant energy transfer) kasetes, paymtas skirtingais daais FAMTM ir HEXTM. Pasibaigus KASP reakcijoms, imatuojama gauta fluo-rescensija ir vertinami tiriam variant genotipai: homozigotai ir hetero-zigotai (2.4.1 pav.).

2.4.1 pav. KlusterCaller programos langas su genotipavimo rezultatais Raudonai ir mlynai paymti atitinkam aleli homozigotai, aliai heterozigotai,

o juodai neigiama kontrol.

33

https://technelysium.com.au/wp/chromas/

iame darbe KASP genotipavimas buvo atliktas naudojant paruotus, kiekvienam polimorfizmui pritaikytus, rinkinius (LGCgroup, Anglija) pagal gamintojo pateikt protokol. Vienai reakcijai imama 5 l DNR (550 ng) ir 5 l reakcijos miinio, ruoiamo i 5 l 2 KASP Master miinio ir 0,14 KASP Assay miinio tirpal. Bendras reakcijos tris 10 l. Kiekvienkart leidiant reakcijas buvo paruoiama neigiama kontrol, kuri sudar tik reakcijos miinys ir vanduo.

KASP reakcijos buvo vykdomos ir fluorescencijos duomenys imatuoti Rotor Gene Q tikro laiko PGR prietaisu su programine ranga (Qiagen, Vo-kietija) pagal 2.4.1 lentelje pateiktus nustatymus. Pagal gautus duomenis polimorfizm genotipai buvo vertinti naudojant KlusterCaller program (demonstracin versija, LGCgroup, Anglija) 2.4.1 pav.

2.4.1 lentel. KASP PGR reakcijos slygos

ingsnis Apraymas Temperatra Laikas Cikl skaiius 1. aktyvinimas 94 C 15 min; 1 2. denatracija 94 C 20 s

10 pradmen prisijungimas/sintez

6155 C 60 s

3. denatracija 94 C 20 s 26 pradmen

prisijungimas/sintez 55 C 60 s

Papildomas (jei reikia, palei-diamas pasibai-gus 3 ingsniui)

denatracija 94 C 20 s 3 pradmen prisijungimas /

sintez 57 C 60 s

2.5. Biochemini ymen koncentracijos kraujo serume nustatymas iame tyrime buvo nustatyti dviej biochemini ymen 26S proteosom

ir NF-B transkripcijos faktoriaus koncentracijos. Naudotas standartizuotas imunofermentinis ELISA (angl. Enzyme linked immunosorbent assay) meto-das. Abiej ymen koncentracija tirta pagal gamintojo pateiktas rekomen-dacijas: 26S proteosom Elabscience Biotechnology (Kinija) ir Abbexa (Anglija); NF-B Elabscience Biotechnology (Kinija).

Naudotos 96 ulinli ELISA ploktels padengtos specifiniais antik-nais. ulinlius buvo pilta po 100 l serumo mgini ir praskiest stan-dartini tirpal, vykdoma inkubacija 90 min 37 C temperatroje. Tuomet upilta po 100 l biotinu ymt antikn ir inkubuota 60 min. Ploktel tris kartus plauta su plovimo buferiu. Tuomet ulinlius pilta po 100 l avidino ymto krien peroksidaze (HRP). Inkubuota 30 min. Praplovus

34

ploktel 5 kartus, buvo pilta po 90 l substratinio buferio ir inkubuota 1530 min tamsoje, kol standartini tirpal ulinliuose atsirasdavo spalv gradientas. Imunofermentin reakcija sustabdyta ulinlius pilant po 50 l specialaus stop tirpalo. Visos inkubacijos buvo vykdomos 37 C tempera-troje. Mgini optinis tankis nuskaitytas, naudojant 450 nm bangos ilg, ir ymen koncentracija pagal standartini tirpal optinius tankius apskai-iuota naudojant Gemini ELISA analizatori (Stratec Gemini version 1.11.1, Vokietija) (26S proteosom koncentracijos nustatymas). Arba opti-nis tankis buvo nuskaitytas mikroplokteli skaitytuvu (Epoch Bio-Tek instruments, JAV) ir koncentracijos apskaiiuotos Curve expert 1.4 prog-rama (bandomoji versija) (NF-B koncentracijos nustatymas). Standartiniai tirpalai buvo paruoti pagal gamintojo pateiktas instrukcijas. Maiausia nustatoma koncentracija 26S 0,3 ng/ml, NF-B 0,16 ng/ml.

2.6. Statistin ir bioinformacin analiz

Hardio Vainbergo pusiausvyros nustatymui buvo naudojama internete

esanti skaiiuokl (http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml) [202]. Programa DnaSP6 [203] buvo naudota proteosomini gen ir NFKBIA

geno VNP haplotip sudarymui. Haplotipai buvo sukurti naudojant progra-mos funkcij PHASE.

Programa Haploview v4.2 [204] buvo naudojama vertinti sankibos pu-siausvyr (LD) tarp VNP, sudaryti VNP nepusiausvyros sankibos scehmas ir haplotip blokus. Taip pat apskaiiuoti haplotip, esani nepusiausvyros sankibos blokuose, dan tiriamose grupse bei skirtumo tarp grupi sta-tistin vertinim (Chi-kvadrato testu).

Statistin analiz buvo atlikta programa R v3.4.3 su RStudio vartotojo aplinka (IDE) [205]. Genotip ir aleli daniai buvo apskaiiuoti tiesioginio skaiiavimo bdu ir pateikti dani lentelmis ir procentais. Genotip ir aleli dani skirtumai tarp tiriamj grupi nustatyti naudojant Chi-kvadrato test. Tikimyb (ans santykis) sirgti astma turint tam tikr geno-tip ar alel buvo apskaiiuota naudojant daugianars logistins regresijos model, kontroliuojant pagal ami ir lyt. Ataskaitos takais buvo parinkti daniausi (prastiniai) genotipai ar aleliai.

Aleli ir genotip pasiskirstymas tarp grupi ir lyi buvo apskaiiuotas naudojant Cochran-Mantel-Haenszel Chi-Squared test.

Biochemini ymen koncentracijos pagal skirtingus genotipus buvo ap-skaiiuotos naudojant daugianars tiesins regresijos modelius. Modelio tinakamumas buvo patikrintas QQ grafikais ir liekamj reikmi grafikais dl galim nuokrypi.

P reikm p < 0,05 buvo laikoma statistikai reikminga.

35

http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml

3. REZULTATAI

3.1. Tiriamj grups apibdinimas

Buvo itirti 321 asmens kraujo mginiai. 169 asmen, kuriems diagno-zuota astma (serganij astma grup), ir 152 sveik, astma nesergani, asmen. Abiejose grupse amiaus intervalas buvo panaus, taiau sergan-ij astma grups amiaus vidurkis buvo didesnis nei sveik asmen (ati-tinkamai 4716 ir 3614 metai). Vyr ir moter santykis buvo panaus abiejose grupse.

Tiriamj demografiniai duomenys nurodyti 3.1.1 lentelje.

3.1.1 lentel. Tyrime dalyvavusi asmen demografiniai duomenys Poymis Sergantys astma Sveiki asmenys

Tiriamieji, n 169 152

Amius, vidurkis SEM (amiaus ribos), metai

47 16 (1879)

36 14 (2282)

Lytis (vyrai/moterys), n 56/113 54/98

3.2. Proteosomas koduojani gen polimorfizmo tyrimas

Buvo itirti proteosomas koduojani gen (PSM) penki vieno nukleo-tido polimorfizmai:

PSMA6 geno rs2277460 (110C>A), esantis promotoriaus regione, ir rs1048990 (8C>G), esantis netransliuojamame 5UTR regione,

PSMC6 geno rs2295826 (128104A>G) ir rs2295827 (12846C>T), esantys pirmame introne,

PSMA3 geno rs2348071 (543+138G>A), esantis 7 introne. ie polimorfizmai pasirinkti dl kituose tyrimuose nustatyt ssaj su ude-

giminmis ir kitomis ligomis. Polimorfizm isidstymas 14 chromosomoje vienas kito atvilgiu ir ne-

pusiausvyros sankibos schema pavaizduota 3.2.1 paveiksle. PSMC6 geno abu VNP buvo visikoje nepusiausvyroje sankiboje (D = 1, r2 = 1).

36

3.2.1 pav. Tirt proteosomas koduojani gen VNP isidstymo ir nepusiausvyros sankibos schema.

Kvadratli spalvos: raudona D = 1, LOD 2, meslva - D = 1, LOD 2 (D santykinis nepusiausviros sankibos koeficientas, LOD nepusiausviros sankibos

tikimybs vertis). Juoda linija apibrti VNP sudarantys blok, esant visikoje nepusiausvyroje sankiboje.

3.2.1. PSMA6, PSMC6 ir PSMA3 gen polimorfizmai

Pasirinkti vieno nukleotido polimorfizmo ymenys buvo itirti visiems tyrim trauktiems asmenims. Pagal gautus VNP genotipus atliktas HardioVainbergo pusiausvyros vertinimas atskirai serganij astma ir sveik asmen grupms. Visi ymenys buvo pusiausvyroje (p > 0,05).

PSMA6 geno rs2277460 polimorfizmo nustatyti du genotipai: homozi-gotinis pagal dan alel C ir heterozigotinis CA. Reto A alelio homozi-got nebuvo nustatyta nei serganij astma, nei sveik asmen grupse. Gauti rezultatai pateikti 3.2.1.1 lentelje. Serganij astma grupje reto A alelio danis buvo tik 11,24 proc. Vyravo homozigotinis CC genotipas (77,52 proc.). Sveik asmen grupje nustatyti aleli ir genotip daniai buvo panas.

Tiriant rs1048990 polimorfizm, nustatyti trys genotip variantai (3.2.1.1 lentel). Serganij astma grupje vyravo CC genotipas (68,64 proc.), homozigotinis GG genotipas nustatytas tik 3,55 proc. daniu, o heterozi-gotinis CG 27,81 proc. Sveik asmen grupje genotip pasiskirstymas nesiskyr, lyginant su serganiaisiais astma (3.2.1.1 lentel). Reto G alelio daniai tiriamj grupse buvo panas ir nesiek 20 proc. (3.2.1.1 lentel).

37

3.2.1.1 lentel. PSMA6 geno aleli ir genotip dani pasiskirstymas tiria-mj grupse

Genas VNP kodas

Pokytis

Alelis / genotipas

Sergani astma grup

Sveik asmen grup

2 p Danis

(n) Danis (proc)

Danis (n)

Danis (proc)

PSMA6 rs2277460 110C>A

C 300 88,76 276 90,79 0,57 0,44

A 38 11,24 28 9,21

CC 131 77,52 124 81,58 0,58 0,45

CA 38 22,48 28 18,42

PSMA6 rs1048990

8C>G

C 279 82,54 258 84,87 1,67 0,43

G 59 17,46 46 15,13

CC 116 68,64 108 71,05

1,67 0,43 CG 47 27,81 42 27,63

GG 6 3,55 2 1,32

PSMC6 geno tirti du polimorfizmai rs2295826 ir rs2295827 buvo vi-

sikoje nepusiausvyroje sankiboje (4.2.1 pav.), todl j genotip ir aleli daniai nesiskyr (3.2.1.2 lentel). 3.2.1.2 lentel. PSMC6 geno aleli ir genotip dani pasiskirstymas tiria-mj grupse

Genas VNP kodas

Pokytis

Alelis / genotipas

Sergani astma grup

Sveik asmen grup 2 p Danis

(n) Danis (proc)

Danis (n)

Danis (proc)

PSMC6 rs2295826

128104A>G

A 293 86,69 251 82,57 2,24 0,33

G 45 13,31 53 17,43

AA 127 75,15 105 69,08 2,24 0,33 AG 39 23,08 41 26,97

GG 3 1,78 6 3,95

PSMC6 rs2295827

12846T>C

C 293 86,69 251 82,57 2,24 0,33

T 45 13,31 53 17,43 CC 127 75,15 105 69,08

2,24 0,33 CT 39 23,08 41 26,97 TT 3 1,78 6 3,95

38

Serganij astma grupje vyravo homozigotinis genotipas pagal dan alel (AA/CC), o homozitog pagal ret alel (GG/TT) nustatyta tik 1,78 proc. Reto alelio G danis grupje buvo 13,31 proc. Sveik asmen grupje dani pasiskirstymas buvo panaus (3.2.1.2 lentel).

PSMA3 polimorfizmo rs2348071 nustatyti trys genotip variantai (3.2.1.3 lentel). Serganij astma grupje homozigotinis genotipas pagal dan alel (GG) nustatytas 44,38 proc. daniu buvo beveik 10 proc. Ma-esnis nei sveik asmen grupje (53,95 proc). O heterozigotinis GA genotipas serganij astma grupje buvo nustatomas beveik 10 proc. daniau (47,93 proc. ir 38,82 proc. atitinkamai). Taiau skirtumai nebuvo statistikai reikmingi (p = 0,22). 3.2.1.3 lentel. PSMA3 geno aleli ir genotip dani pasiskirstymas tiria-mj grupse

Genas VNP kodas

Pokytis

Alelis / genotipas

Sergani astma grup

Sveik asmen grup

2 p Danis

(n) Danis (proc.)

Danis (n)

Danis (proc.)

PSMA3 rs2348071

543+138G>A

G 231 68,34 223 73,36 2,93 0,23

A 107 31,66 81 26,64

GG 75 44,38 82 53,95

3,04 0,22 GA 81 47,93 59 38,82

AA 13 7,69 11 7,24

3.2.2. Proteosomini gen penki polimorfizm haplotip analiz

Norint patikrinti bendras tirt VNP ssajas su astma, buvo apskaiiuoti

galim haplotip daniai abiejose tiriamj grupse ir palyginti tarpusavyje. Haplotipai buvo sudaryti visiems 5 tirtiems VNP ir atskirai dviems (rs2295826 ir rs2295827), sudarantiems sankibos blok (3.2.1 pav.).

Sudarius proteosomas koduojani gen 5 VNP haplotipus, buvo gauti 9 pagrindiniai variantai (haplotipai, kuri bendras danis nesiek 1 proc. neparodyti). Daniausias variantas buvo CCACG, kurio danis serganij astma ir sveik asmen grupse virijo 40 proc. O daniausi trij haplotip CCACG, CCACA ir CCGTG bendras danis serganij astma ir sveik asmen grupse virijo 70 proc. Likusi haplotip danis grupse nesiek 10 proc, ir bendrai sudar maiau nei 30 proc. Vis nustatyt haplotip daniai tarp grupi skyrsi nereikmingai (p > 0,05) (3.2.2.1 lentel).

39

3.2.2.1 lentel. PSM penki polimorfizm haplotip daniai Haplotipas

1 2 3 4 5

Serganij astma grup Sveik asmen grup

Danis (n) Danis (proc.) Danis (n) Danis (proc.) C C A C G 140 41,42 134 44,08 C C A C A 66 19,53 50 16,45 C C G T G 32 9,47 39 12,83 A C A C G 28 8,28 24 7,89 C G A C A 31 9,17 21 6,91 C G A C G 22 6,51 20 6,58 C C G T A 4 1,18 8 2,63 C G G T G 5 1,48 4 1,32 A C A C A 6 1,78 2 0,66

Haplotipas: 1 rs2277460 alelis, 2 rs1048990 alelis, 3 rs2295826 alelis, 4 rs2295827 alelis, 5 rs2348071 alelis.

Sankibos bloke buvo nustatyti du rs2295826/rs2295827 haplotipai AC ir GT. J dani skirtumas sergani astma ir sveik asmen grupi buvo ne-didelis ir statistikai nereikmingas (p = 0,15). Danesnis haplotipas abiejo-se tiriamj grupse virijantis 80 proc. buvo AC (3.2.2.2 lentel). 3.2.2.2 lentel. Haplotip, esani sankibos bloke, daniai ir j pasiskirsty-mas tiriamose grupse

Haplotipas rs2295826/rs2295827

Sergani astma grup

Sveik asmen grup

2 p Danis

(n) Danis (proc)

Danis (n)

Danis (proc)

AC 293 86,69 251 82,57 2,1 0,15

GT 45 13,31 53 17,43

3.2.3. Tirt proteosomini gen aleli ir genotip reikm astmos isivystymui Buvo apskaiiuota tikimyb (ans santykis) susirgti astma turint tam

tikr PSMA6, PSMA3 ir PSMC6 gen alel ar genotip, lyginant su da-niausiu (prastu) variantu (3.2.3.1 lentel).

Vis itirt polmorfizm reti aleliai ir genotipai rizikos susirgti astma nekeit. Nustatytas an santykis nesiek 2, iskyrus PSMA6 rs1048990 polimorfizm, kur asmenims, turintiems GG genotip, apskaiiuotas ans

40

santykis buvo 5,03. Taiau is pokytis statistikai nereikmingas (p = 0,26), turintis labai plat pasikliautinj interval (3.2.3.1 lentel). Statistinis pa-tikimumas galjo bti nepasiektas ir dl mao tiriamj, turini G alel, skaiiaus. Sergani astma asmen grupje GG genotipas nustatytas tik 3,5 proc., o sveik asmen 1,3 proc. daniu (3.2.1.1 lentel).

3.2.3.1 lentel. Rizika susirgti astma turint atitinkam alel ar genotip

Genas Polimorfizmas

Alelis, genotipas S 95 proc. PI p

PSMA6 rs2277460

C 1 A 0,97 0,511,84 0,94

CC 1 CA 0,94 0,392,19 0,89

PSMA6 rs1048990

C 1 G 1,83 0,661,77 0,75

CC 1 CG 1,31 0,62,87 0,49 GG 5,03 0,35141,23 0,26

PSMC6 rs2295826

A 1 G 0,68 0,421,09 0,12

AA 1 AG 1,41 0,633,16 0,39 GG 0,87 0,096,58 0,89

PSMA3 rs2348071

G 1 A 1,08 0,721,61 0,72

GG 1 AA 0,69 0,241,95 0,49

S ans santykis. PI pasikliautinasis intervalas.

PSMC6 geno rs2295827 varianto ans santykio rezultatai 3.2.3.1 len-telje nepateikti, nes, VNP esant visikoje nepusiausvyroje sankiboje su rs2295826, abiej rezultatai buvo identiki ir statistikai nereikmingi.

Apskaiiavus PSM gen haplotip ans santyk, nustatyta, kad asme-nims, kurie turi haplotip CCGTA tikimyb susirgti astma patikimai su-maja 4,3 karto (S = 0,23; p = 0,046), lyginant su turiniais daniausi haplotip CCACG. Kit haplotip ans santykio reikms skyrsi nereik-mingai (3.2.3.2 lentel).

41

3.2.3.2 lentel. Rizika susirgti astma, turint atitinkam PSM haplotip PSM gen haplotipas S 95 proc. PI p

CCACG 1 CCACA 1,09 0,671,78 0,72 CCGTG 0,87 0,491,54 0,63 ACACG 1,20 0,622,35 0,59 CGACA 1,28 0,662,50 0,46 CGACG 1,37 0,682,77 0,38 CCGTA 0,23 0,040,89 0,046 CGGTG 0,93 0,194,51 0,93 ACACA 1,27 0,259,30 0,78

S ans santykis, PI pasikliautinasis intervalas.

3.3. NFKB1 ir NFKBIA gen polimorfizmo tyrimas

Tyrimui buvo pasirinktas vienas NFKB1 geno (4q24) polimorfizmas, esantis promotoriaus regione, kur gali bti keturi nukleotid ATTG ikrita rs28362491 (94ins/del ATTG), ir trys NFKBIA geno (14q13) VNP rs2233406 (826C>T) ir rs3138053 (881A>G), esantys promotoriaus regione, ir rs696 (+2758G>A), esantis netransliuojamam 3UTR regione (3.3.1 pav.).

3.3.1 pav. NFKBIA geno schema, kurioje pavaizduotas tirt VNP isidstytmas

Nustatyta, kad ie polimorfizmai yra funkciniai, siejami su pakitusia gen

raika ir vairiomis udegiminmis bei vinmis ligomis.

42

3.3.2 pav. Tirt NFKBIA geno polimorfizm isidstymo ir nepusiausvyros sankibos schema.

Kvadratli spalvos: raudona D = 1, LOD 2, rausvi atspalviai D < 1, LOD 2 (D santykinis nepusiausviros sankibos koeficientas, LOD nepusiausviros sankibos tikimybs vertis). Juoda linija apibrti VNP sudarantys blok, esant nepusiausvyroje

sankiboje. Langeliuose nurodyta D reikm.

NFKBIA geno polimorfizm isidstymas 14 chromosomoje vienas kito atvilgiu ir nepusiausvyros sankibos schema pavaizduota 3.3.2 paveiksle. Du polimorfizmai rs2233406 ir rs3138053 buvo stiprioje nepusiausvyroje sankiboje (D = 0,96, r2 = 0,93) ir sudar haplotip blok.

3.3.1. NFKB1 ir NFKBIA gen polimorfizm analiz Pasirinkti gen polimorfizmai buvo nustatyti visiems tiriamiesiems, i-

skyrus rs28362491 ir rs696, kuri kontrolinje grupje nepavyko nustatyti vieno asmens genotipo, ir rs3138053, kur nepavyko nustatyti vieno genotipo astmos grupje.

Pagal gautus VNP genotip danius atliktas HardioVainbergo pusiau-svyros vertinimas atskirai serganij astma ir sveik asmen grupse. Visi ymenys buvo pusiausvyroje (p > 0,05).

Gauti NFKB1 geno polimorfizmo rs28362491 trys genotip variantai (homozigotinis pagal dan alel, homozigotinis pagal ret alel ir hetero-zigotinis) (3.3.1.1 lentel). Serganij astma grupje retas del alelis nusta-tytas 40,24 proc. daniu. Sveik asmen grupje danis buvo panaus 43,04 proc. Serganij astma grupje daniausiai nustatomas genotipas

43

buvo heterozigotinis ins/del 48,52 proc. Sveik asmen grupje taip pat vyravo is genotipas (3.3.1.1 lentel). 3.3.1.1 lentel. NFKB1 geno aleli ir genotip daniai ir j pasiskirstymas tiriamj grupse

Genas VNP kodas

Pokytis

Alelis / genotipas

Sergani astma grup

Sveik asmen grup

2 p Danis (n)

Danis (proc.)

Danis (n)

Danis (proc.)

NFKB1 rs28362491 94ins>del

ins 202 59,76 172 56,95 1,21 0,54

del 136 40,24 130 43,05 ins/ins 60 35,50 46 30,46

0,94 0,62 ins/del 82 48,52 80 52,98 del/del 27 15,98 25 16,56

NFKBIA geno vis tirt polimorfizm nustatyti trys genotip variantai.

Serganij astma grupje rs696 polimorfizmo homozigotinis GG ir he-terozigotinis GA genotipai buvo nustatyti panaiu daniu (atitinkamai 40,24 proc. ir 42,01 proc.), o homozigotinis AA reiau 17,75 proc. Sveik asmen grupje GG genotipas buvo nustatytas reiau (30,46 proc), lyginant su serganiais astma, taiau skirtumas nebuvo statistikai reikmingas (p = 0,19) (3.3.1.2 lentel). rs696 reto alelio A danis tarp grupi taip pat nesiskyr (3.3.1.2 lentel).

Tiriant rs2233406 polimorfizm retas T alelis serganij astma grupje buvo nustatytas 25,44 proc. daniu, sveik asmen grupje jo danis buvo maesnis (3.3.1.2 lentel). Vyraujantis genotipas serganij astma ir sveik asmen grupse buvo CC (57,40 proc. ir 63,16 proc. atitinkamai). Reik-ming skirtum, lyginant genotip ir aleli pasiskirstym tarp grupi, nenu-statyta.

NFKBIA geno rs3138053 polimorfizmas buvo stiprioje nepusiausvyroje sankiboje su rs2233406, dl to j aleli ir genotip daniai pasiskirsto pa-naiai (3.3.1.2 lentel). Serganij astma ir sveik asmen grupje taip pat vyravo homozigotinis genotipas pagal dan alel AA (57,14 proc. ir 63,16 proc. atitinkamai). Reikming dani pasiskirstymo skirtum tarp grupi nenustatyta.

44

3.3.1.2 lentel. NFKBIA geno aleli ir genotip daniai ir j pasiskirstymas tiriamj grupse

Genas VNP kodas

Pokytis

Alelis/ Genotipas

Serganij astma grup

Sveik asmen grup

2 p Danis

(n) Danis (proc.)

Danis (n)

Danis (proc.)

NFKBIA rs696 +2758G>A

G 207 61,24 167 55,30 3,35 0,19

A 131 38,76 135 44,70 GG 68 40,24 46 30,46

3,35 0,19 GA 71 42,01 75 49,67 AA 30 17,75 30 19,87

NFKBIA rs2233406 -826C>T

C 252 74,56 243 79,93 3,72 0,16

T 86 25,44 61 20,07 CC 97 57,40 96 63,16

3,83 0,15 CT 58 34,32 51 33,55 TT 14 8,28 5 3,29

NFKBIA rs3138053 -881A>G

A 251 74,70 244 80,26 4,41 0,11

G 85 25,30 60 19,74 AA 96 57,14 96 63,16

4,42 0,11 AG 59 35,12 52 34,21 GG 13 7,74 4 2,63

3.3.2. NFKBIA geno haplotip analiz

Buvo apskaiiuoti galim NFKBIA geno haplotip daniai pagal tirtus polimorfizmus. NFKB1 genas netrauktas analiz, nes jis yra kitoje (4) chromosomoje.

Haplotipai buvo nustatyti visiems tirtiems NFKBIA polimorfizmams ir atskirai dviems, esantiems sankibos bloke (3.3.2 pav.).

Sudarius trij NFKBIA polimorfizm haplotipus, nustatyti keturi pagrin-diniai haplotipai ACA, GCA, GTG ir ATG (haplotipai, kuri danis siek maiau nei 1 proc. analiz netraukti) (3.3.2.1 lentel).

Serganij astma grupje haplotipas GTG buvo nustatytas patikimai daniau nei sveik asmen grupje (22,62 proc. lyginant su 17,22 proc., p = 0,048).

Serganij astma grupje daniausias haplotipas buvo GCA, o sveik asmen ACA. Taiau pasiskirstymo tarp grupi skirtumai nebuvo reik-mingi (p > 0,05).

45

3.3.2.1 lentel NFKBIA geno haplotipai ir j pasiskirstymas grupse Haplotipas

1 2 3 Serganij astma grup Sveik asmen grup

p Danis (n) Danis (proc) Danis (n) Danis (proc)

A C A 122 36,31 127 42,05 0,08

G C A 128 38,09 114 37,75 0,85

G T G 76 22,62 52 17,22 0,048

A T G 8 2,38 9 2,98 0,95 Haplotipas: 1 rs696 alelis, 2 rs2233406 alelis, 3 rs3138053 alelis.

3.3.2.2 lentelje pateikti rs2233406/rs3138053 du pagrindiniai haplotipai

CA ir TG (haplotipai, kuri danis siek maiau nei 1 proc. netraukti). Ser-ganij astma grupje haplotipas TG buvo nustatomas daniau o CA re-iau, lyginant su sveikais asmenimis (3.3.2.2 lentel), taiau skirtumai nebu-vo statistikai reikmingi (p > 0,05).

3.3.2.2 lentel. Haplotip, esani sankibos bloke, daniai ir j pasiskirsty-mas tiriamj grupse

Haplotipas rs2233406/ rs3138053

Sergani astma grup

Sveik asmen grup

2 p Danis

(n) Danis (proc)

Danis (n)

Danis (proc)

CA 249 73,67 242 79,61 3,14 0,076

TG 85 25,14 58 19,08 3,39 0,066

3.3.3. NFKB1 ir NFKBIA gen aleli ir genotip reikm astmos isivystymui

Buvo apskaiiuota rizika susirgti astma turint tam tikr NFKB1 ir

NFKBIA gen alel ar genotip, lyginant su daniausiu (prastu) variantu, rezultatai pateikti 3.3.3.1 lentelje.

Nustatyta, kad NFKBIA geno polimorfizmo rs2233406 genotipas TT gali padidinti rizik susirgti astma net 5 kartus (S = 5,03; p = 0,04). Taiau T alelis lyginant su C rizikos nepadidina (S = 0,48; p = 0,4). rs3138053 po-limorfizmo GG genotipas modelyje koreliuoja su TT genotipu ir duoda to-ki pai ans santykio reikm (S = 5,03).

46

3.3.3.1 lentel. Rizika susirgti astma turint atitinkam alel ar genotip Genas

Polimorfizmas Alelis,

genotipas S 95 proc. PI p

NFKB1 rs28362491

ins 1 del 0,87 0,611,26 0,46 ins/ins 1 ins/del 0,75 0,331,69 0,75 del/del 1,11 0,373,36 0,86

NFKBIA rs696

G 1 A 0,69 0,481,01 0,06 GG 1 GA 0,80 0,282,27 0,67 AA 1,86 0,625,83 0,28

NFKBIA rs2233406

C 1 T 0,48 0,062,19 0,40 CC 1 CT 0,28 0,018,05 0,39 TT# 5,03 1,1727,68 0,04

NFKBIA rs3138053

A 1 G 2,53 0,5519,36 0,29 AA 1 AG 2,74 0,0978,15 0,50 GG# 5,03 1,1727,68 0,04

#NFKBIA rs2233406 TT genotipas koreliuoja su NFKBIA rs3138053 GG ir j S reikms yra tokios paios. S ans santykis. PI pasikliautinasis intervalas.

Tiriant haplotip ans santykius, nustatyta, kad haplotipai GCA ir GTG, didino rizik susirgti astma lyginant su daniausiu ACA, (3.3.3.2 lentel). Didiausi tak astmos isivystymui rod GTG haplotipas, kuris rizik susirgti padidino beveik 2 kartus (S = 1,86). Haplotipas GCA rizik didino 1,5 karto (S = 1,52; p = 0,04). 3.3.3.2 lentel. Rizika susirgti astma turint atitinkam NFKBIA haplotip

NFKBIA haplotipas S 95 proc. PI p ACA 1 GCA 1,52 1,032,28 0,04 GTG 1,86 1,143,04 0,013 ATG 1,08 0,363,18 0,89

S ans santykis. PI pasikliautinasis intervalas.

47

3.4. Udegiminio kelio biochemini ymen tyrimas

3.4.1. 26S proteosom koncentracijos kraujo serume tyrimas Buvo nustatyta 26S proteosom koncentracija 245 tiriamj kraujo

serumo mginiuose. Ji tarp sergani astma ir sveik asmen grupi nesiskyr (3.4.1.1 lentel).

3.4.1.1 lentel. 26 koncentracija tiriamj grupse

Grup Tiriamieji, n Koncentracija,

ng/ml Intervalas

(min.maks.) p

Sergantys astma asmenys 130 2,21 0,1313,73 0,19

Sveiki asmenys 115 2,01 0,2224,43 Lentelje koncentracija pateikiama mediana.

Koncentracijos pasiskirstymas tiriamj grupse buvo panaus (3.4.1.1 pav.). Skirtumai tarp lyi taip pat nebuvo reikmingi (duomenys nepa-teikti).

3.4.1.1 pav. 26S koncentracij pasiskirstymo tiriamj grupse palyginimas Diagramose koncentracijos suskirstytos intervalais, kuri plotis 4 ng/ml.

Kiekis nurodo asmen, turini 26S koncentracij, patenkani atitinkam interval, skaii. 0 sveiki asmenys, 1 sergantys astma asmenys.

48

3.4.2. NF-B koncentracijos kraujo serume tyrimas

Tyrimo metu buvo nustatyta branduolio faktoriaus NF-B (p105 sub-vieneto) koncentracija 78 tiriamj kraujo serume (3.4.2.1 lentel). Sergan-ij astma grupje koncentracijos vidurkis buvo didesnis nei sveik as-men (atitinkamai 20,28 ng/ml ir 16,36 ng/ml), taiau skirtumas nebuvo statistikai reikmingas (p = 0,07). 3.4.2.1 lentel. NF-B koncentracija tiriamj grupse

Grup Tiriamieji, n Koncentracija

ng/ml Intervalas

(min.maks.) p

Sergantys astma asmenys 42 20,28 (10,3) 1,4337,73 0,07

Sveiki asmenys 36 16,36 (9,7) 1,5536,90 Lentelje koncentracija pateikiama vidurkis (standartinis nuokrypis).

3.4.2.1 pav. matoma, jog serganij astma pacient yra daugiau turini didesnes NF-B koncentracijas, o sveik asmen grupje koncentracijos kiekis pasiskirsto beveik tolygiai tarp tiriamj.

3.4.2.1 pav. NF-B koncentracij pasiskirstymo tiriamj grupse palyginimas

Diagramose koncentracijos suskirstytos intervalais, kuri plotis 4 ng/ml. Kiekis nurodo asmen, turini NF-B koncentracij, patenkani atitinkam interval, skaii.

0 sveiki asmenys, 1 sergantys astma asmenys.

49

Iskirsius visus tiriamuosius pagal lyt, nustatyta, jog vyrai turi dvigubai didesn NF-B koncentracij nei moterys (24,78 7,9 ng/ml lyginant su 12,78 8,6 ng/ml), ir is skirtumas statistikai reikmingas (p = 0,0001) (3.4.2.2 pav.).

3.4.2.2 pav. NF-B koncentracijos pasiskirstymas pagal lyt Diagramoje rezultatai pavaizduoti kaip medianos su tarpkvartiliniais ploiais.

NF-B koncentracija nurodyta ng/ml.

3.5. Biochemini ir genetini ymen ssaj tyrimas

3.5.1. PSMA6, PSMC6, PSMA3 gen polimorfizm ssajos su 26S koncentracija kraujo serume

Buvo patikrinta, ar skiriasi 26S proteosom koncentracija esant skirtin-

giems genotipams tiriamj grupse ir tarp j (3.5.1.1 pav.). Esant PSMA6 rs2277460 CC ir CA genotipams (3.5.1.1 pav, A), sergan-

ij astma grupje 26S proteosom koncentracija nesiskyr, o sveik as-men grupje esant CA genotipui buvo didesn (CC 2,78 ng/ml, CA 3,90 ng/ml). Reikming skirtum tarp astma serganij ir sveik asme-n nebuvo nustatyta, nors esant CA genotipui astma sergani grupje koncentracija buvo maesn, lyginant su kontroline grupe (2,91 ng/ml ir 3,90 ng/ml).

50

Esant skirtingiems rs1048990 polimorfizmo genotipams skirtum tarp grupi nebuvo nustatyta (3.5.1.1 pav., B). Abiejuose tiriamj grupse as-men, turini CG genotip, 26S koncentracija buvo didesn, lyginant su homozigotiniais variantais, o GG genotip maesn, lyginant su turiniais CC ir CG genotip (3.5.1.1 pav., B).

PSMC6 geno rs2295826 ir rs2295827 polimorfizm rezultatai 3.5.1.1 paveiksle pateikti kaip vienas rs2295826, nes j rezultatai identiki dl ne-pusiausvyros sankibos (3.5.1.1 pav., C). Esant skirtingiems genotipams reikming skirtum tarp grupi nebuvo nustatyta. Skirtum nenustatyta ir tarp genotip grupse.

3.5.1.1 pav. 26S proteosom koncentracijos kraujo serume skirtumai pagal proteosomas koduojani gen polimorfizm genotipus ir tiriamj grupes

Duomenys paveiksle pavaizduoti kaip vidurkis + standartinis nuokrypis. Skaiiai diagramose nurodo koncentracijos vidurk, skaiiai skliausteliuose emiau genotip nurodo tiriamj, turini atitinkam genotip, skaii (serganij astma/sveik asmen grups).

51

Esant PSMA3 rs2348071 skirtingiems genotipams, reikming skirtum tarp grupi nebuvo nustatyta (3.5.1.1 pav., D), nors esant GA genotipui astma sergani asmen kraujo serume 26S koncentracija atrod maesn, lyginant su sveikais asmenimis (3,08 ng/ml ir 4,03 ng/ml atitinkamai).

Astma sergani asmen, turini rs2348071 turini GA genotip 26S koncentracija buvo didesn, lyginant su homozigotiniais variantais. Sveik asmen grupje 26S proteosom koncentracija priklausomai nuo genotip nesiskyr (3.5.1.1 pav., D).

Taip pat buvo patikrinta, ar tirti PSM polimorfizm genotipai turi takos 26S proteosom koncentracijos pokyiams kraujo serume, jei koncentracija priklauso tik nuo genotip, ir nepriklauso nuo tiriamj grups (3.5.1.1 len-tel).

Nustatyta, kad asmen, turini PSMA6 polimorfizmo rs1048990 CG genotip, 26S koncentracij kraujo serume yra 1,54 kartus didesn nei tu-rini daniausi CC genotip (p = 0,03).

3.5.1.1 lentel. 26S koncentracijos pokytis pagal tirtus genotipus

Genotipas Pokytis 95 proc. PI p

PSMA6 rs2277460 CA 1,04 0,701,56 0,82 PSMA6 rs1048990 CG 1,54 1,052,27 0,03 PSMA6 rs1048990 GG 0,59 0,191,87 0,37 PSMC6 rs2295826 AG 0,74 0,511,09 0,12 PSMC6 rs2295826 GG 0,79 0,252,59 0,71 PSMA3 rs2348071 GA 1,12 0,691,79 0,65

PI pasikliautinasis intervalas. *Statistikai reikmingas rezultaras (p < 0,05).

Kiti tirti PSM genotipai 26S proteosom koncentracijai kraujo serume patikimos reikms neturjo (p > 0,05) (3.5.1.1 lentel).

26S koncentracija pagal PSMA6 rs1048990 genotipus parodyta 3.5.1.2 paveiksle.

52

3.5.1.2 pav. 26S proteosom koncentracija kraujo serume pagal PSMA6 rs1048990 polimorfizmo genotipus.

Diagramoje rezultatai pavaizduoti kaip medianos su tarpkvartiliniais ploiais ir iskirtimis. 26S koncentracija nurodyta ng/ml.

3.5.2 NFKB1 ir NFKBIA gen polimorfizm ssajos su NF-B koncentracija kraujo serume

Buvo patikrinta, kaip skiriasi NF-B koncentracija kraujo serume pagal

skirtingus genotipus tiriamj grupse. Koncentracija buvo matuota prie nustatant genotip, todl tiriamj, turini skirtingus genotipus, skaiius skiriasi, o kontrolinje grupje asmenims turintiems rs2233406 TT ir rs3138053 GG genotipus visai nebuvo pamatuota koncentracija (3.5.2.1 pav.).

Esant NFKB1 rs28362491 polimorfizmo ins/del genotipui tiriamj gru-pse nustatytas NF-B koncentracijos sumajimas, lyginant su kitais geno-tipais (3.5.2.1 pav., A). Serganij astma NF-B koncentracija buvo di-desn, lyginant su sveikais asmenimis (18,05 ng/ml ir 12,31 ng/ml). Taiau skirtumai nebuvo statistikai reikmingi.

53

3.5.2.1 pav. NF-B koncentracijos kraujo serume skirtumai pagal NFKB1 ir NFKBIA gen polimorfizm genotipus ir tiriamj grupes.

Duomenys paveiksle pavaizduoti kaip vidurkis + standartinis nuokrypis. Skaiiai diagramose nurodo koncentracijos vidurk, skaiiai skliausteliuose emiau genotip nurodo tiriamj, turini atitinkam genotip, skaii (serganij astma/sveik asmen grups).

Serganij astma asmen, turini NFKBIA rs696 AA ir GA genotipus

NF-B koncentracija serume buvo didesn, lyginant su GG genotipu ir kontroline grupe (3.5.2.1 pav., B). Taiau skirtumai nebuvo reikmingi. Sk