IZOLAREA ŞI CONFIRMAREABACTERIILOR COLIFORME

Bacteriile coliforme sunt - bacili aerobi sau facultativ anaerobi, nesporulaţi, Gram negativi;

- fermentează lactoza la 370C, cu producere de gaze, în condiţiile indicate incubării uzual pe mediul B.B.L.V.;

Cele mai multe STANDARDE descriu procedurile de izolare a speciilor care fermentează lactoza şi produc gaze la 35-37°C, de formă bacilară sau cocobacilară: E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter şi Serratia.

• Limitele contaminării cu bacterii coliforme în cazul produselor alimentare de origine animală sunt foarte largi.

• Bacteriile coliforme, nu sunt în general, bacterii patogene;• sunt INDICATOR SANITAR (igienic);

este recunoscut faptul că şi numărul mare, de bacterii coliforme poate produce fenomene nedorite produsului sau consumatorului

• Limitele contaminării cu bacterii coliforme în cazul produselor alimentare de origine animală sunt foarte largi.

• Bacteriile coliforme, nu sunt în general, bacterii patogene;• sunt INDICATOR SANITAR (igienic); • este recunoscut faptul că şi numărul mare, de bacterii coliforme poate produce fenomene nedorite

produsului sau consumatorului. În grupa bacteriilor coliforme sunt cuprinse , în principal, genurile:

- Escherichia, - Enterobacter şi - Klebsiella (Bărzoi D., 1978).

În grupa bacteriilor coliforme sunt cuprinse , în principal, genurile: - Escherichia, - Enterobacter şi - Klebsiella (Bărzoi D., 1978).

• Criteriile morfologice nu sunt suficiente pentru identificarea genurilor. • Configuraţia biochimică este importantă, însă examenele serologice bazate pe structura lor antigenică,

sunt considerate exacte. • Confirmarea serologică a speciei de cercetat, urmează apoi doar ca o continuare firească a finalizării

rezultatelor – nu este utilizata în mod curent. • Pentru efectuarea unor examene serologice precise este nevoie de decodificarea profilului biochimic. • Profilul biochimic a fost stabilit prin utilizarea galeriilor ID 32 E sau galeriilor tip 32 GN, • utilizate pentru identificarea tulpinilor de Enterobacteriaceae. • Pentru efectuarea unor examene serologice precise este nevoie de decodificarea profilului biochimic. • Profilul biochimic a fost stabilit prin utilizarea galeriilor ID 32 E sau galeriilor tip 32 GN, • utilizate pentru identificarea tulpinilor de Enterobacteriaceae.

Directive generale pentru stabilirea numărului de bacterii coliforme. Tehnica numărului cel mai probabil

SR ISO 4831/2009

SR ISO 4831/2009– Directive generale pentru stabilirea numărului de bacterii coliforme – Tehnica numărului cel mai probabil prevede directivele generale pentru stabilirea numărului cel mai probabil de bacterii coliforme din produsele ALIMENTARE DE ORIGINE ANIMALĂ destinate consumului uman.

Din cauza diversităţii produselor alimentare care intră în acest domeniu de aplicare se vor aplica pe cât posibil aceste directive cu exactitate şi nu se va recurge la derogări, decât atunci când acest lucru nu poate fi evitat. Metoda este mai puţin precisă decât SR ISO 4832 metoda prin numărarea coloniilor obţinute pe mediu solid, însă permite o analiză mai substanţială. Definiţie Utilizarea prezentului Standard Internaţional, se aplică următoarea definiţie:

• coliforme sunt bacterii care cresc/se dezvoltă la temperatura specificată (35oC sau 37oC), • produc fermentarea lactozei, cu producere de gaz, atunci când analiza este efectuată pe mediile de

cultura şi în condiţiile prevăzute în metoda specificată conform SR ISO 4831. INCUBAREA Tuburile însămânţate se vor incuba la 30oC, 35oC sau 37oC (ultimele două temperaturi fiind preferate), timp de 24 ore sau 48 de ore (dacă la 24 de ore nu se constată creştere microbiană). Principiu de lucru

• Însămânţarea a trei eprubete cu mediul de îmbogăţire B.B.L.V., la trei diluţii succesive (de ex. 10-3, 10-4, 10-5), cu o cantitate determinată de eşantion pentru analiză (1 ml), dacă produsul care se examinează este lichid sau cu o cantitate determinată de suspensie-mamă, în cazul produselor solide.

• Identic se procedează cu însămânţarea diluţiilor obţinute din eşantionul pentru analiză sau din suspensia-mamă, dar se utilizează mediu BBLV dublu concentrat.

• Reînsămânţarea se face din culturile aflate în eprubetele cu mediul bulion cu triptoză şi lauril sulfat (LST) dublu concentrat şi din culturile provenite din prima serie de eprubete cu mediul bulion cu triptoză şi lauril sulfat (LST) simplu concentrat, care sunt opace, tulburi sau care au provocat o degajare de gaz, într-o serie de eprubete cu mediu de confirmare bulion lactozat cu bilă şi verde briliant (BBLV)

METODA ORIZONTALĂ PENTRU ENUMERAREA BACTERIILOR COLIFORME.METODA NUMĂRĂRII COLONIILOR.

SR ISO 4832/2009

SR ISO 4832/2009 Acest Standard Internaţional stabileşte directivele generale privind obţinerea numărului de bacterii

coliforme din produsele alimetare destinate consumului uman, prin numărarea directă a coloniilor caracteristice obţinute pe un mediu solid specific - VRBL, după incubare la 35oC sau 37oC şi fermentarea lactozei cu producere de gaz pe mediul BBLV - specificat de standard.

Stabilirea numărului de bacterii coliforme se efectuează prin numărarea directă a coloniilor obţinute pe un mediu solid (VRBL –mediu cu cristal violet, roşu neutru, bilă şi lactoză), după incubare la 30oC sau 37oC, temperatura făcând obiectul unui acord între părţile interesate.

Definiţie La utilizarea prezentului Standard Internaţional (S.I.), se aplică următoarea definiţie: prin bacterii

coliforme se înţeleg bacteriile care cresc/se dezvoltă, la temperatura specificată (adică 35oC sau 37oC, conform înţelegerii), formează colonii caracteristice în mediu de VRBL (geloză-lactoză, bilă, cristal violet şi cu roşu neutru), atunci când analiza este efectuată după metoda specificată în prezentul S.I.

Principiu • Însămânţarea în profunzimea unui mediu selectiv solid (VRBL), turnat în două plăci Petri, cu o cantitate

determinată de eşantion pentru analiză, dacă produsul care se examinează este lichid sau cu o cantitate determinată de suspensie-mamă.

• Însămânţarea a cel puţin încă o diluţie următoare, obţinute din eşantionul pentru analiză sau din suspensia-mamă.

• INCUBAREA plăcilor se face la 35oC sau 37oC, timp de 24 - 48 ore.

• ATENŢIE! • ÎNSĂMÂNŢAREA • Pe mediul VRBL se efectuează între 2 straturi de mediu. Aceasta presupune turnarea unui strat în

cantitate de 12-15ml, se lasă la solidificat, se adaugă inoculum, iar după ce acesta a pătruns în mediu se adaugă un al doilea strat de mediu (4 ml la temperatura de 44oC, maxim 47oC), pentru a limita dezvoltarea coloniilor şi a fi numărate cu uşurinţă.

• INCUBAREA plăcilor se face la 30oC, 35oC sau 37oC, timp de 24 - 48 ore.

CITIREA sau NUMĂRAREA Se consideră colonii prezumtive de bacterii coliforme, acele colonii care prezintă coloraţie roz şi au un

diametru mai mare de 0,5 mm. Se citesc plăcile cu colonii tipice care conţin între 10 şi 150 de colonii. Citirea coloniilor caracteristice pe mediul VRBL trebuie diferenţiate de coloniile de Escherichia coli şi

alte tipuri de coliformi.Coliformi totali ≠ Coliformi termotoleranţi Coliformi totali sunt bacteriile care cresc pe medii specifice pentru coliformi la temperatura de

incubare de 35oC sau 37oC.

Tipul de bacterii Care se dezvoltă

Incubare le 30 oC Incubare le 44 oC sau 44,5 oC

Coliformi totali Colonii roz Diametru <0,5 mm

Inhibate sau colonii necaracteristice

Coliformi –termotoleranţi Colonii roz Diametru > 0,5 mm

Colonii roz Diametru > 0,5 mm

Alte bacterii Necoliforme

Colonii incolore sau de alte culori Diametru < 0,5 mm

Inhibate sau colonii necaracteristice

Coliformi termotoleranţi sunt reprezentanţi de bacteriile care cresc pe medii specifice pentru coliformi la temperatura de incubare de 44oC.

CONFIRMAREA Se prelevează câte 5 colonii minim din fiecare placă în care s-au identificat colonii tipice de bacterii coliforme şi se însămâţează în câte un tub cu câte 10 ml de BBLV (bulion , bila, lactoză şi verde briliant ).INCUBAREA Tuburile cu câte 10 ml de bulion lactoză şi verde briliant însămânţate se vor incuba 35oC sau 37oC, timp de 24 - 48 ore. Se considera coliformi - bacteriile care formează colonii tipice pe mediul VRBL şi formează gaz în tubuleţele DURHAM - la To de incubare din SR ISO pe mediul BBLV.

IZOLAREA ŞI CONFIRMAREA SPECIEI ESCHERICHIA COLI DIN PRODUSELE ALIMENTARE DE ORIGINE ANIMALĂ Izolarea şi confirmarea Escherichia coli din produsele alimentare se efectuează - conform SR ISO/TS 16 649 – 1,2,3/2009 sau – conform SR ISO 7251/2009  E. coli reprezintă cel mai bun indicator al CONTAMINĂRII FECALE a produselor alimentare. E. coli reprezintă un bun indicator al CONTAMINĂRII RECENTE a produselor alimentare. Trebuie sublinat aspectul de adaptabilitate al bacteriilor în general şi al speciei E. coli în special, la modificări de temperatură: frig, congelare, modificări de umiditate (uscăciune), modificări de pH, rezistenţă la antibiotice, etc. Escherichia coli sau colibacilii sunt bacterii aerobe din grupul coliformelor, se prezintă sub formă de bastonaş, sunt mobile, nesporogene, fermentează lactoza la 440C, cu producere de gaze şi formare de indol din triptofan . Ross T., Ratkowsky D.A., Mellefont L.A., McMeekin, (2003), consideră că dezvoltarea speciei E. coli este influenţată de mai mulţi factori: temperatură - este favorizată de o temperatură cuprinsă între 7,63 şi 47,43ºC, existenţa unor soluţii, la o activitatea a apei cuprinsă între 0,951 şi 0,999, ajutată de soluţii de clorură de sodiu şi la un pH situat între 4,0 şi 8,2.

Mecanismele adaptărilor sunt de natură genetică, traduse prin modificări în genom şi al transcripţiei expresiei acestor modificări la nivelul genelor. COLIBACILII sunt bacterii care au formă de bastonaşe mici, drepte - bacili sau cocobacili (2,0-6,0/1,1-1,5 micrometri, vii şi 1,0-3,0/0,4-0,7 micrometri, moarte şi colorate), Gram negative, aşezate izolat sau în perechi, adesea mobile dar şi imobile, unele tulpini capsulează, formând microcapsule, asporogene.

Temperatura optimă de dezvoltare este de 37 0C, dar se dezvoltă foarte bine şi la 44-450 C. Această ultimă temperatură fiind un criteriu de difernţiere, denumit testul Eyjkman-Mackensie. În laboratoare de bacteriologie alimentară, aceast test se utilizează pentru diferenţierea lui E. coli de speciile înrudite, de tip Enterobacter, Klebsiella sau alte enterobacterii. • E. coli se dezvoltă foarte bine în prezenţa sărurilor biliare şi a bilei, a sărurilor de seleniu, a colorantului

verde briliant, a tetrationatului, etc. • Se dezvoltă bine la pH neutru; nu se dezvoltă la pH mai mic de 5,9 şi mor la pH acid.• Pe medii nutritive simple se dezvoltă bine, producând turbiditate intensă, uneori cu inel la suprafaţă pe

bulionul simplu, cu adunarea unui depozit în cazul culturilor vechi, iar pe suprafaţa agarului nutritiv cresc colonii netede, de 2-6 mm, uşor convexe, opace, nepigmentate, de tip S. Culturile degajă miros fecaloid, amoniacal.

• Bârzoi D. şi colab., (1999), descriu că aproximativ 95% din tulpinile de E. coli sunt indol pozitive, roşu-metil pozitive, Voges-Proskauer negative, citrat negative, beta-galactozidază şi beta-glucuronidază pozitive şi sunt cuprinse în E. coli biotipul 1. Celelalte tulpini răspund diferit, fiind indol negative, nu elaborează enzime de tipul beta-galactozidază şi beta-glucuronidază şi sunt catalogate ca aparţinând E. coli biotipului 2.

Testele biochimice cele mai importante şi care sunt utilizate pentru identificarea speciei E. coli au fost următoarele:

• creştere aerobă la 44-450C; • producere de gaze captate în tubuleţe Durham în medii specifice BBLV, LST, etc.; • producerea indolului;• fermentarea glucozei şi/sau lactozei;• formarea de colonii roşii-violacee, cu centrul mai închis la culoare, cu reflexe metalizate auriu-verzui,

caracteristice pe suprafaţa mediului GEAM sau Levine • utilizarea glucozei cu formarea de produşi acizi stabili, ceea ce determină reacţia roşului de metil

pozitivă; • metabolizarea glucozei cu producere de acetoin, reacţia Voges-Proskauer negativă; • neutilizarea citratului ca unică sursă de carbon; • fermentarea sorbitolul şi producerea beta-galactozidazei, exceptând tulpinile de E. coli O157 H7 -

enterohemoragică. • utilizarea glucozei cu formarea de produşi acizi stabili, ceea ce determină reacţia roşului de metil

pozitivă; • metabolizarea glucozei cu producere de acetoin, reacţia Voges-Proskauer negativă; • neutilizarea citratului ca unică sursă de carbon; • fermentarea sorbitolul şi producerea beta-galactozidazei, exceptând tulpinile de E. coli O157 H7 -

enterohemoragică. • Speciile din genul Escherichia fermentează glucoza, lactoza, manita, trehaloza, produc lizin-

decarboxilază. Există şi unele excepţii, de exemplu, tulpinile enteroinvazive, care sunt lactoză şi lizindecarbixilază negative.

• Diferenţierea tulpinilor aparţinând biotipului 1 faţă de biotipul 2 se efectuează pe baza testului IMVIC.