7/25/2019 Biohemijske metode u zatiti ivotne sredine
1/10
1. METODE IZOLACIJE DNK
Mnogo razliitih metoda je razvijeno za izolaciju genomske DNK. Metode i protokoli za
izolaciju DNK prilagoeni su biolokom materijalu, tj. polaznoj osnovi iz koje se ekstrahuje
DNK. svim metodama za izolaciju DNK postoje tri osnovne !aze"
# pucanje i liziranje elija u polaznom materijalu
! ot"lanjanje proteina i o#tali$ "ontaminanata iz lizata
! #e%imentacija i ra#t&aranje DNK.
$rvom !azom posti%e se razbijanje &elijskog zida u cilju oslobaanja &elijskih
konstituenata. 'atim se &elijske organele moraju razoriti kako bi se DNK oslobodila u
ekstrakcioni pu!er. (vaj deo procedure posti%e se kori&enjem deterd%enata, poput natrijum
dodecil#sul!ata )*D*+ ili cetiltrimetil#amonijum#bromida )-/+. 0tilendiamin#tetrasir&etna
kiselina )0D-+ je heliraju&i agens koji vezuje dvovalentne Mg12jone koji slu%e kao ko!aktor za
ve&inu nukleaza ime dolazi do njihove inhibicije. Konano potrebno je ekstrahovati DNK iz
ekstrakcionog pu!era, tkz. lizata, to se mo%e uraditi razliitim metodama" metod isoljavanja,
metod organske ekstrakcije, metod centri!ugiranja sa gradijentom gustine cezijum hlorida, metodizmene anjona, metod selektivne adsorpcije DNK putem silicijumske gel membrane . 0kstrakcija
visoko molekulske DNK je deo procedure, jer inicijalni DNK ekstrakt sadr%i velike koliine
3NK, proteina, polisaharida, tanina i pigmenata, koje je u nekim sluajevima teko odvojiti od
DNK. Najve&i deo proteina se mo%e ukloniti denaturacijom i precipitacijom iz ekstrakata
koriste&i !enol i 4 ili hloro!orm .
prolom veku dve osnovne metode su kori&ene za ekstrakciju biljne DNK i to" -/
metod )5ombergen and /achmann, 6778+ i metod po Dellaporta et al. )679:+. (ve metode
pokazale su se uspenim za irog opseg vrsta daju&i po%eljnu koliinu DNK odgovaraju&e
molekulske mase i zadovoljavaju&e isto&e. Danas se esto koriste standardizovani protokoli sa
gotovim pu!erima );kit
7/25/2019 Biohemijske metode u zatiti ivotne sredine
2/10
$ostoji nekoliko metoda za kvantitativnu i kvalitativnu analizu izolovane DNK"
0lektro!oreza na agaroznom gelu,
C spektro!otometrija,
3eal#time $3,
$icogreen reagens
uantiblot itd.
(d ovih nabrojanih metoda naje&e se koriste elektro!oreza na agaroznom gelu i C
spektro!otometrija.
1.1. ELEKT'O(O'EZA
0lektro!oreza oznaava kretanje estica u elektrinom polju, dok elektro!oreza DNK
predstavlja tehniku koja se primjenjuje za separaciju biolokih molekula, baziranu na !izikim
osobinama molekula, kao to su veliina, oblik ili izoelektrina taka molekula. Naje&e seprimenjuje u analitike svrhe, za separaciju i analizu DNK !ragmenata razliite veliine. *naga
elektrinog polja podstie migraciju !ragmenata DNK kroz gel.
Molekuli koje se elektro!oretski razdvajaju naje&e u svojoj strukturi sadr%e anjonske ili
katjonske grupe. Eragmenti DNK di!unduju ka pozitivnoj elektrodi, anodi, zbog negativnog
naboja koji nosi DNK molekul. Eragmenti ve&e molekulske mase migriraju sporije kroz gel, u
odnosu na !ragmente manje molekulske mase ija je migracija br%a. Celiina !ragmenata
razdvojenih na gelu se odreuje uporeivanjem uzorka sa DNK ladder#om, koji sadr%i !ragmente
DNK poznate veliine i slu%i kao re!erentni sistem.
7/25/2019 Biohemijske metode u zatiti ivotne sredine
3/10
Fzbor sistema pu!era je bitan, jer o njemu zavisi koliina elektrine energije koja se mo%e
primeniti na sistemu. ko je dovod struje previsok, dolazi do preteranog zagrevanja, to mo%e
uzrokovati denaturaciju uzorka, a ako je dovod struje prenizak, ne dolazi do znaajnijeg
zagrevanja, ali elektro!oreza traje dugo pa razdvojene zone nisu otre zbog di!uzije.
Kao standardna metoda za razdvajanje, identi!ikaciju i prei&avanje DNK !ragmenata
koristi se elektro!oreza na agaroznom ili poliakrilamidnom gelu. garozni gelovi su manje
toksini, jednostavniji i laki za upotrebu od poliakrilamidnih gelova, pa se iz tog razloga e&e
koriste za elektro!orezu DNK.
'a pripremu gela potrebne su slede&e komponente"
6. 6?-/0 pu!er,1. agaroza i
:. etidijum bromid )6G mg4mH+.
*astav 6?-/0 )-ris#borat#0D-+ pu!era"
#G,G97M -ris,
# G,G97M borna kiselina,
# G,GG1M 0D-.
$riprema gela"
# 6 I " odmeriti 6,8 g agaroze i preneti u staklenu au, agarozu preliti sa 68G mH 6?-/0 pu!era.
Jau prekriti sahatnim staklom i staviti u mikrotalasnu pe& oko minuta )do vrenja+, kako bi se
rastvorila agaroza. Nakon rastvaranja agaroze, rastvor hladiti do L G o pod mlazom hladne
vode. Kada se uspostavi %eljena temperatura dodati 6G H etidijum bromida )6G mg4mH+.
3astvor pa%ljivo izliti u kadicu za elektro!orezu i ostaviti 8 minuta da se polimerizuje.
# 1 I " odmeriti : g agaroze i preneti u staklenu au, agarozu preliti sa 68G mH 6?-/0 pu!era.
Jau prekriti sahatnim staklom i staviti u mikrotalasnu pe& oko minuta )do vrenja+, kako bi se
rastvorila agaroza. Nakon rastvaranja agaroze, rastvor hladiti do L G o pod mlazom hladne
7/25/2019 Biohemijske metode u zatiti ivotne sredine
4/10
vode. Kada se uspostavi %eljena temperatura dodati 6G H etidijum bromida )6G mg4mH+.
3astvor pa%ljivo izliti u kadicu za elektro!orezu i ostaviti 8 minuta da se polimerizuje.
Oel postaviti u kadicu za elektro!orezu u kojoj se nalazi 6?-/0 pu!er i podesiti da tee
pri konstantnom naponu od 61G C u trajanju od 6h.
1.). *+ ,-EKT'O(OTOMET'IJA
*pektro!otometrija je jedan od naina kvanti!ikacije biomolekula. (na predstavlja !otoelektrino
merenje zraenja koje neka supstanca apsorbuje na odreenoj talasnoj du%ini. $rema podrujima
talasnih du%ina izvora svetla, razlikuju se ultraljubiasta )1GG # GG nm+, vidljiva )GG # PG nm+
i in!racrvena )iznad PG nm+ spektro!otometrija.(va metoda slu%i za kvantitativno odreivanje malih koliina rastvorenih supstanci. Koliina
apsorbovanog svetla odreene talasne du%ine odgovara koncentraciji ispitivane supstance.
Maksimalna apsorpcija DNK i 3NK je na talasnoj du%ini od 1G nm, a minimalna na 1:G nm.
Fzmeu apsorpcije svetla i koncentracije nukleinskih kiselina postoji linearan odnos.
Hamber#/eerov zakon de!inie zavisnost energije apsorbovane na odreenoj talasnoj du%ini kao
!unkciju koncentracije apsorbovanog molekula"
FB FG#Qdc
Ode je" F#intenzitet proputenog svetla, FG# intenzitet upadnog svetla, Q # molarni ekstincijski
koe!icijent, d# du%ina puta zraka svetlosti kroz uzorak, c#koncentracija apsorbovanog molekula.
$rilikom odreivanja koncentracije nukleinskih kiselina, spektro!otometrom se meri
apsorbancija na"
1:G nm # apsopcijski minimum nukleinskih kiselina, a apsorpcijski maksimum peptidnih veza u
proteinima, apsorpcija !enola, ugljenih hidrata, 0D-R
1G nm # apsopcijski maksimum nukleinskih kiselinaR
19G nm # apsorpcija aromatinih aminokiselina, proteina i peptida, kao i jedinjenja sa
aromatinim prstenomR
:1G nm S proteini i nukleinske kiseline ovde ne apsorbuju.
7/25/2019 Biohemijske metode u zatiti ivotne sredine
5/10
3aunanjem odnosa ovih apsorbancija mo%e da se utvrdi isto&a DNK uzorka.
(dnos 1G419G je naje&i nain za odreivanje proteinske kontaminacije. koliko je vrednost
6,9 smatra se da rastvor sadr%i istu DNK. Crednosti manje od 6,9 ukazuju na kontaminaciju
proteinima, a vrednosti ve&e od 6,9 na kontaminaciju sa 3NK.
(dnos 1:G41Gje jo bolji indikator proteinske, poli!enolne ili ugljenohidratne kontaminacije.
Crednosti manje od G,8 ukazuju na ist uzorak.
'a odreivanje koncentracije DNK dobijene izolacijom, uzorak DNK jedinine apsorbancije na
1G nm ima koncentraciju 8G Tg4mH DNK, jer je proseni ekstincijski koe!icijent dvolanane
DNK je 8G )Tg4mH+#6cm#6.
Da bi se kvanti!ikovala DNK spektro!otometrijskom analizom potrebno je uzorak DNK
razbla%iti, izmeriti apsorbanciju na 1:G, 1G, 19G i :1G nm, i koncentraciju raunati prema
!ormuli"
cDNK )Tg4mH+ B 1G? 3 ? 8G Tg4mH, gde je 3 S !aktor razbla%enja
7/25/2019 Biohemijske metode u zatiti ivotne sredine
6/10
).-C' -ol/mera#e C$ain 'eaction0
Hanana reakcija polimeraze )-olUmerase Chain 'eaction # -C'+ je biohemijska i
molekularno bioloka tehnika tokom koje se %eljeni !ragment ili sekvenca DNK eksponencijalno
umno%ava putem jednostavne enzimske replikacije. $3 je in vitro tehnika koja se mo%e
sprovoditi bez ogranienja u pogledu porekla &elija iz kojih se izoluje DNK i mo%e se
ekstenzivno modi!ikovati, to omogu&uje njenu veoma iroku primenu. (snov koji ini $3
tehniku iroko primenjivom je to to genetski materijal svih %ivih bi&a, biljaka ili %ivotinja,
bakterija ili virusa, poseduje nukleotidne sekvence )DNK ili ponekad 3NK+, jedinstvene i
speci!ino prisutne samo u njihovim sopstvenim vrstama. -akoe, slo%eni organizmi kao to su
ljudska bi&a, poseduju DNK sekvence koje su jedinstveno i speci!ino prisutne samo kod
odreene individue. -e jedinstvene varijacije ine mogu&im svrstavanje genetskog materijala
prema njegovom poreklu, identi!ikuju&i sa velikom precizno&u kojoj vrsti pripada dati
organizam i esto o kojem pojedinanom lanu te vrste se radi.
$rvobitno $3 eksperimenti su izvoeni sa DNK polimerazom iz bakterijeEscherichia
coli i nakon svakog koraka denaturacije morala se dodavati nova koliina enzima, jer se ova
polimeraza inaktivira na visokim temperaturama denaturacije. Fz tog razloga otkri&e
termostabilnih DNK polimeraza omogu&ilo je e!ikasnu in vitro ampli!ikaciju, bez potrebe
naknadnog dodavanja novih koliina enizima. -a> polimeraza je prvi predstavnik termostabilnihDNK polimeraza . (tporna je na relativno brza i velika temperaturna kolebanja. Fzolovana je iz
bakterije Thermus aquaticus koja %ivi u toplim izvorima Veloustonskog nacionalnog parka u
*D u kojima temperatura dosti%e i preko 2PG o. (sim -a> polimeraze postoji jo niz
termostabilnih DNK polimeraza izolovanih iz drugih bakterija koje %ive u toplim izvorima, kao
to su" Thermus flavus, Thermus ruber, Thermus thermophilusi dr..
(snovni princip na kome je zasnovana $3 metoda je ampli!ikacija speci!inih regiona
DNK koja u nekim !azama odgovara procesu replikacije DNK, koji se normalno odvija u svim
%ivim organizmima. -i delovi DNK mogu biti pojedinani geni, delovi gena ili nekodiraju&e
sekvence. Kod ve&ine varijanti klasine $3 metode, obino se ampli!ikuju !ragmenti DNK ne
ve&i od nekoliko stotina baznih parova.
7/25/2019 Biohemijske metode u zatiti ivotne sredine
7/10
3eplikacija DNK je proces u kome se od jednog molekula DNK dobijaju dva nova,
identina molekula DNK )Slika 1.+. $oto svaki od lanaca dvolanane DNK sadr%i redosled
)sekvencu+ nukleotida koji je apsolutno komplementaran naspramnom lancu DNK, pri udvajanju
)replikaciji+ molekula DNK, svaki lanac slu%i kao matrica za sintezu novog, komplementarnog
lanca. 'ahvaljuju&i tome genetika in!ormacija u DNK se precizno kopira u novi
komplementarni lanac tokom replikacije. $omo&u $3 metode mogu&e je analizirati, opisati i
sintetisati bilo koji deo speci!ine DNK ili 3NK. Nju je mogu&e izolovati iz biolokog
materijala ije poreklo mo%e biti krv, kosa ili tkivni uzorci, mikrobi, %ivotinje ili biljke. $ri tome
uzorci iz kojih se izoluje DNK mogu biti sve%i, ali je $3 proceduru mogu&e izvesti i sa
uzorcima DNK meu kojima neki mogu biti stari i po nekoliko hiljada ili ak miliona godina.
Slika 1.3eplikacija DNK lanca
)http"44hr.=ikipedia.org4=iki4DeoksiribonukleinskaWkiselina+
7/25/2019 Biohemijske metode u zatiti ivotne sredine
8/10
'a proces replikacije DNK, u $3 proceduri neophodne su slede&e komponente"
# jednolanana tj. denaturisana dvolanana DNK koja se kopira i ini matricu,
# prajmer,
# DNK polimeraza sa temperaturnim opsegom delovanja oko PG G, tj. nativna ili
rekombinantna -a> )Bacillus thermoaquaticus+ polimeraza , enzim koji se dodaje radi sinteze
kopija DNK regiona koji se %eli ampli!ikovati,
# deoksinukleotidni tri!os!ati )dN-$s+ iz kojih DNK polimeraza sintetie novu DNK,
# pu!erski rastvor koji obezbeuje odgovaraju&u hemijsku sredinu za optimalnu aktivnost
i stabilnost DNK polimeraze,
# dvovalentni katjoni magnezijuma Mg12ili mangana Mn12, pri emu se naje&e koriste
magnezijumovi joni dok se joni mangana mogu upotrebiti za $3 # posredovanu DNK
mutagenezu, budu&i da vie koncentracije Mn12pove&avaju stepen greke tokom DNK sinteze)$avlov et al., 1GG+,
$rajmeri ili amplimeri su kratki jednolanani oligonukleotidi iji je raspored strogo
odreen., koji se pod odgovaraju&im uslovima vezuju za speci!inu komplementarnu sekvencu
nukleotida na DNK. 'a $3 reakciju, prajmeri moraju biti homologni nukleotidnim
sekvencama na svakoj strani dela DNK koji %elimo da ampli!ikujemo, to znai da mora biti
poznat taan raspored nukleotida u prajmeru. $3 reakciji uestvuju prajmeri koji su
dizajnirani tako da se sintetie tano odreeni deo DNK ogranien prajmerima. $3 reakcija se
izvodi u mikroepruveti, zapremine G,1 # 6,8 mH, gde dolazi do preciznih i ciklinih promena
temperature, to ima za posledicu ampli!ikaciju tano odreenog gena ili dela gena, milion do
milijardu puta. 3eakcioni volumen $3 smee je obino od 68#6GG H. Mikroepruvete se
postavljaju u termoblok, aparat koji zagreva i hladi reakcione epruvete u ciklusima.
$ostoje tri osnovna koraka u $3 proceduri"
6+ denaturacija DNK matrice )raskidanje vodoninih veza izmeu dva komplementarna
DNK lanca, pod uticajem temperature od 7G#7 G i traje od 1G#:GX+,
1+ hibridizacija prajmera )annealing+ u kojoj se uspostavljaju vodonine veze izmeu
prajmera i komplementarne sekvence, sada jednostruke DNK i traje 1G#GX+,
:+ DNK sinteza ili elongacija prajmera, katalizovana DNK polimerazom.
7/25/2019 Biohemijske metode u zatiti ivotne sredine
9/10
*tartovanjem od prajmera, -a> polimeraza mo%e itati in!ormaciju na lancu matrice
DNK i na osnovu toga vezuje komplemetarne nukleotide vrlo brzo. 3ezultat toga je stvaranje
dvolananog segmenta DNK koji se sastoji od jednog originalnog lanca DNK#matrice i njemu
komplementarnom novosintetisanom lancu.
Da bi moglo da doe do hibridizacije prajmera sa komplementarnim sekvencama na
matrici, potrebno je matricu DNK denaturisati odnosno raskinuti vodonine veze izmeu dva
komplementarna lanca DNK molekula. Denaturacija matrice se odvija inkubiranjem DNK
molekula na 78 G. 5ibridizacija prajmera sa odgovaraju&om sekvencom na matrici se odvija na
temperaturi od 1#8 G u zavisnosti od du%ine nukleotidne sekvence prajmera. 0longacija
prajmera tj., ugradnja nukleotida na :Y krajeve prajmera najcesce se odigrava na P1 G i
katalizovana je DNK polimerazom )Slika 2.+.
Slika 2. $ostupak $3 reakcije ) # zagrevanje do 78 o prilikom ega dolazi do
denaturacije DNK lanacaR / S 88 o hibridizacija prajmera sa odgovaraju&om sekvencom na
matriciR S P1 G -a> polimeraza sintetie nove lance DNK+
-ermostabilna -a> polimeraza omogu&ava nesmetan proces ponavljanja ciklusa bezneophodnog dodavanja enzima nakon svakog ciklusa denaturacije na visokoj temperaturi.
$3 proceduri se obino ciklusi ponavljaju 1G#8 puta to rezultuje eksponencijalnom
ampli!ikacijom %eljenog segmenta DNK. spenost ampli!ikacije se najlake proverava
elektro!orezom na agaroznom gelu, a ponekad je neophodno uraditi i neke dodatne analize"
7/25/2019 Biohemijske metode u zatiti ivotne sredine
10/10
digestija restrikcionim enzimima )tzv. restrikciona analiza+, DNK4DNK hibridizacija#*outhern
blot, sekvencioniranje itd..