Biohemijske metode u zaštiti životne sredine

7/25/2019 Biohemijske metode u zatiti ivotne sredine

1/10

1. METODE IZOLACIJE DNK

Mnogo razliitih metoda je razvijeno za izolaciju genomske DNK. Metode i protokoli za

izolaciju DNK prilagoeni su biolokom materijalu, tj. polaznoj osnovi iz koje se ekstrahuje

DNK. svim metodama za izolaciju DNK postoje tri osnovne !aze"

# pucanje i liziranje elija u polaznom materijalu

! ot"lanjanje proteina i o#tali$ "ontaminanata iz lizata

! #e%imentacija i ra#t&aranje DNK.

$rvom !azom posti%e se razbijanje &elijskog zida u cilju oslobaanja &elijskih

konstituenata. 'atim se &elijske organele moraju razoriti kako bi se DNK oslobodila u

ekstrakcioni pu!er. (vaj deo procedure posti%e se kori&enjem deterd%enata, poput natrijum

dodecil#sul!ata )*D*+ ili cetiltrimetil#amonijum#bromida )-/+. 0tilendiamin#tetrasir&etna

kiselina )0D-+ je heliraju&i agens koji vezuje dvovalentne Mg12jone koji slu%e kao ko!aktor za

ve&inu nukleaza ime dolazi do njihove inhibicije. Konano potrebno je ekstrahovati DNK iz

ekstrakcionog pu!era, tkz. lizata, to se mo%e uraditi razliitim metodama" metod isoljavanja,

metod organske ekstrakcije, metod centri!ugiranja sa gradijentom gustine cezijum hlorida, metodizmene anjona, metod selektivne adsorpcije DNK putem silicijumske gel membrane . 0kstrakcija

visoko molekulske DNK je deo procedure, jer inicijalni DNK ekstrakt sadr%i velike koliine

3NK, proteina, polisaharida, tanina i pigmenata, koje je u nekim sluajevima teko odvojiti od

DNK. Najve&i deo proteina se mo%e ukloniti denaturacijom i precipitacijom iz ekstrakata

koriste&i !enol i 4 ili hloro!orm .

prolom veku dve osnovne metode su kori&ene za ekstrakciju biljne DNK i to" -/

metod )5ombergen and /achmann, 6778+ i metod po Dellaporta et al. )679:+. (ve metode

pokazale su se uspenim za irog opseg vrsta daju&i po%eljnu koliinu DNK odgovaraju&e

molekulske mase i zadovoljavaju&e isto&e. Danas se esto koriste standardizovani protokoli sa

gotovim pu!erima );kit


2/10

$ostoji nekoliko metoda za kvantitativnu i kvalitativnu analizu izolovane DNK"

0lektro!oreza na agaroznom gelu,

C spektro!otometrija,

3eal#time $3,

$icogreen reagens

uantiblot itd.

(d ovih nabrojanih metoda naje&e se koriste elektro!oreza na agaroznom gelu i C

spektro!otometrija.

1.1. ELEKT'O(O'EZA

0lektro!oreza oznaava kretanje estica u elektrinom polju, dok elektro!oreza DNK

predstavlja tehniku koja se primjenjuje za separaciju biolokih molekula, baziranu na !izikim

osobinama molekula, kao to su veliina, oblik ili izoelektrina taka molekula. Naje&e seprimenjuje u analitike svrhe, za separaciju i analizu DNK !ragmenata razliite veliine. *naga

elektrinog polja podstie migraciju !ragmenata DNK kroz gel.

Molekuli koje se elektro!oretski razdvajaju naje&e u svojoj strukturi sadr%e anjonske ili

katjonske grupe. Eragmenti DNK di!unduju ka pozitivnoj elektrodi, anodi, zbog negativnog

naboja koji nosi DNK molekul. Eragmenti ve&e molekulske mase migriraju sporije kroz gel, u

odnosu na !ragmente manje molekulske mase ija je migracija br%a. Celiina !ragmenata

razdvojenih na gelu se odreuje uporeivanjem uzorka sa DNK ladder#om, koji sadr%i !ragmente

DNK poznate veliine i slu%i kao re!erentni sistem.


3/10

Fzbor sistema pu!era je bitan, jer o njemu zavisi koliina elektrine energije koja se mo%e

primeniti na sistemu. ko je dovod struje previsok, dolazi do preteranog zagrevanja, to mo%e

uzrokovati denaturaciju uzorka, a ako je dovod struje prenizak, ne dolazi do znaajnijeg

zagrevanja, ali elektro!oreza traje dugo pa razdvojene zone nisu otre zbog di!uzije.

Kao standardna metoda za razdvajanje, identi!ikaciju i prei&avanje DNK !ragmenata

koristi se elektro!oreza na agaroznom ili poliakrilamidnom gelu. garozni gelovi su manje

toksini, jednostavniji i laki za upotrebu od poliakrilamidnih gelova, pa se iz tog razloga e&e

koriste za elektro!orezu DNK.

'a pripremu gela potrebne su slede&e komponente"

6. 6?-/0 pu!er,1. agaroza i

:. etidijum bromid )6G mg4mH+.

*astav 6?-/0 )-ris#borat#0D-+ pu!era"

#G,G97M -ris,

# G,G97M borna kiselina,

# G,GG1M 0D-.

$riprema gela"

# 6 I " odmeriti 6,8 g agaroze i preneti u staklenu au, agarozu preliti sa 68G mH 6?-/0 pu!era.

Jau prekriti sahatnim staklom i staviti u mikrotalasnu pe& oko minuta )do vrenja+, kako bi se

rastvorila agaroza. Nakon rastvaranja agaroze, rastvor hladiti do L G o pod mlazom hladne

vode. Kada se uspostavi %eljena temperatura dodati 6G H etidijum bromida )6G mg4mH+.

3astvor pa%ljivo izliti u kadicu za elektro!orezu i ostaviti 8 minuta da se polimerizuje.

# 1 I " odmeriti : g agaroze i preneti u staklenu au, agarozu preliti sa 68G mH 6?-/0 pu!era.

Jau prekriti sahatnim staklom i staviti u mikrotalasnu pe& oko minuta )do vrenja+, kako bi se

rastvorila agaroza. Nakon rastvaranja agaroze, rastvor hladiti do L G o pod mlazom hladne


4/10

vode. Kada se uspostavi %eljena temperatura dodati 6G H etidijum bromida )6G mg4mH+.

3astvor pa%ljivo izliti u kadicu za elektro!orezu i ostaviti 8 minuta da se polimerizuje.

Oel postaviti u kadicu za elektro!orezu u kojoj se nalazi 6?-/0 pu!er i podesiti da tee

pri konstantnom naponu od 61G C u trajanju od 6h.

1.). *+ ,-EKT'O(OTOMET'IJA

*pektro!otometrija je jedan od naina kvanti!ikacije biomolekula. (na predstavlja !otoelektrino

merenje zraenja koje neka supstanca apsorbuje na odreenoj talasnoj du%ini. $rema podrujima

talasnih du%ina izvora svetla, razlikuju se ultraljubiasta )1GG # GG nm+, vidljiva )GG # PG nm+

i in!racrvena )iznad PG nm+ spektro!otometrija.(va metoda slu%i za kvantitativno odreivanje malih koliina rastvorenih supstanci. Koliina

apsorbovanog svetla odreene talasne du%ine odgovara koncentraciji ispitivane supstance.

Maksimalna apsorpcija DNK i 3NK je na talasnoj du%ini od 1G nm, a minimalna na 1:G nm.

Fzmeu apsorpcije svetla i koncentracije nukleinskih kiselina postoji linearan odnos.

Hamber#/eerov zakon de!inie zavisnost energije apsorbovane na odreenoj talasnoj du%ini kao

!unkciju koncentracije apsorbovanog molekula"

FB FG#Qdc

Ode je" F#intenzitet proputenog svetla, FG# intenzitet upadnog svetla, Q # molarni ekstincijski

koe!icijent, d# du%ina puta zraka svetlosti kroz uzorak, c#koncentracija apsorbovanog molekula.

$rilikom odreivanja koncentracije nukleinskih kiselina, spektro!otometrom se meri

apsorbancija na"

1:G nm # apsopcijski minimum nukleinskih kiselina, a apsorpcijski maksimum peptidnih veza u

proteinima, apsorpcija !enola, ugljenih hidrata, 0D-R

1G nm # apsopcijski maksimum nukleinskih kiselinaR

19G nm # apsorpcija aromatinih aminokiselina, proteina i peptida, kao i jedinjenja sa

aromatinim prstenomR

:1G nm S proteini i nukleinske kiseline ovde ne apsorbuju.


5/10

3aunanjem odnosa ovih apsorbancija mo%e da se utvrdi isto&a DNK uzorka.

(dnos 1G419G je naje&i nain za odreivanje proteinske kontaminacije. koliko je vrednost

6,9 smatra se da rastvor sadr%i istu DNK. Crednosti manje od 6,9 ukazuju na kontaminaciju

proteinima, a vrednosti ve&e od 6,9 na kontaminaciju sa 3NK.

(dnos 1:G41Gje jo bolji indikator proteinske, poli!enolne ili ugljenohidratne kontaminacije.

Crednosti manje od G,8 ukazuju na ist uzorak.

'a odreivanje koncentracije DNK dobijene izolacijom, uzorak DNK jedinine apsorbancije na

1G nm ima koncentraciju 8G Tg4mH DNK, jer je proseni ekstincijski koe!icijent dvolanane

DNK je 8G )Tg4mH+#6cm#6.

Da bi se kvanti!ikovala DNK spektro!otometrijskom analizom potrebno je uzorak DNK

razbla%iti, izmeriti apsorbanciju na 1:G, 1G, 19G i :1G nm, i koncentraciju raunati prema

!ormuli"

cDNK )Tg4mH+ B 1G? 3 ? 8G Tg4mH, gde je 3 S !aktor razbla%enja


6/10

).-C' -ol/mera#e C$ain 'eaction0

Hanana reakcija polimeraze )-olUmerase Chain 'eaction # -C'+ je biohemijska i

molekularno bioloka tehnika tokom koje se %eljeni !ragment ili sekvenca DNK eksponencijalno

umno%ava putem jednostavne enzimske replikacije. $3 je in vitro tehnika koja se mo%e

sprovoditi bez ogranienja u pogledu porekla &elija iz kojih se izoluje DNK i mo%e se

ekstenzivno modi!ikovati, to omogu&uje njenu veoma iroku primenu. (snov koji ini $3

tehniku iroko primenjivom je to to genetski materijal svih %ivih bi&a, biljaka ili %ivotinja,

bakterija ili virusa, poseduje nukleotidne sekvence )DNK ili ponekad 3NK+, jedinstvene i

speci!ino prisutne samo u njihovim sopstvenim vrstama. -akoe, slo%eni organizmi kao to su

ljudska bi&a, poseduju DNK sekvence koje su jedinstveno i speci!ino prisutne samo kod

odreene individue. -e jedinstvene varijacije ine mogu&im svrstavanje genetskog materijala

prema njegovom poreklu, identi!ikuju&i sa velikom precizno&u kojoj vrsti pripada dati

organizam i esto o kojem pojedinanom lanu te vrste se radi.

$rvobitno $3 eksperimenti su izvoeni sa DNK polimerazom iz bakterijeEscherichia

coli i nakon svakog koraka denaturacije morala se dodavati nova koliina enzima, jer se ova

polimeraza inaktivira na visokim temperaturama denaturacije. Fz tog razloga otkri&e

termostabilnih DNK polimeraza omogu&ilo je e!ikasnu in vitro ampli!ikaciju, bez potrebe

naknadnog dodavanja novih koliina enizima. -a> polimeraza je prvi predstavnik termostabilnihDNK polimeraza . (tporna je na relativno brza i velika temperaturna kolebanja. Fzolovana je iz

bakterije Thermus aquaticus koja %ivi u toplim izvorima Veloustonskog nacionalnog parka u

*D u kojima temperatura dosti%e i preko 2PG o. (sim -a> polimeraze postoji jo niz

termostabilnih DNK polimeraza izolovanih iz drugih bakterija koje %ive u toplim izvorima, kao

to su" Thermus flavus, Thermus ruber, Thermus thermophilusi dr..

(snovni princip na kome je zasnovana $3 metoda je ampli!ikacija speci!inih regiona

DNK koja u nekim !azama odgovara procesu replikacije DNK, koji se normalno odvija u svim

%ivim organizmima. -i delovi DNK mogu biti pojedinani geni, delovi gena ili nekodiraju&e

sekvence. Kod ve&ine varijanti klasine $3 metode, obino se ampli!ikuju !ragmenti DNK ne

ve&i od nekoliko stotina baznih parova.


7/10

3eplikacija DNK je proces u kome se od jednog molekula DNK dobijaju dva nova,

identina molekula DNK )Slika 1.+. $oto svaki od lanaca dvolanane DNK sadr%i redosled

)sekvencu+ nukleotida koji je apsolutno komplementaran naspramnom lancu DNK, pri udvajanju

)replikaciji+ molekula DNK, svaki lanac slu%i kao matrica za sintezu novog, komplementarnog

lanca. 'ahvaljuju&i tome genetika in!ormacija u DNK se precizno kopira u novi

komplementarni lanac tokom replikacije. $omo&u $3 metode mogu&e je analizirati, opisati i

sintetisati bilo koji deo speci!ine DNK ili 3NK. Nju je mogu&e izolovati iz biolokog

materijala ije poreklo mo%e biti krv, kosa ili tkivni uzorci, mikrobi, %ivotinje ili biljke. $ri tome

uzorci iz kojih se izoluje DNK mogu biti sve%i, ali je $3 proceduru mogu&e izvesti i sa

uzorcima DNK meu kojima neki mogu biti stari i po nekoliko hiljada ili ak miliona godina.

Slika 1.3eplikacija DNK lanca

)http"44hr.=ikipedia.org4=iki4DeoksiribonukleinskaWkiselina+


8/10

'a proces replikacije DNK, u $3 proceduri neophodne su slede&e komponente"

# jednolanana tj. denaturisana dvolanana DNK koja se kopira i ini matricu,

# prajmer,

# DNK polimeraza sa temperaturnim opsegom delovanja oko PG G, tj. nativna ili

rekombinantna -a> )Bacillus thermoaquaticus+ polimeraza , enzim koji se dodaje radi sinteze

kopija DNK regiona koji se %eli ampli!ikovati,

# deoksinukleotidni tri!os!ati )dN-$s+ iz kojih DNK polimeraza sintetie novu DNK,

# pu!erski rastvor koji obezbeuje odgovaraju&u hemijsku sredinu za optimalnu aktivnost

i stabilnost DNK polimeraze,

# dvovalentni katjoni magnezijuma Mg12ili mangana Mn12, pri emu se naje&e koriste

magnezijumovi joni dok se joni mangana mogu upotrebiti za $3 # posredovanu DNK

mutagenezu, budu&i da vie koncentracije Mn12pove&avaju stepen greke tokom DNK sinteze)$avlov et al., 1GG+,

$rajmeri ili amplimeri su kratki jednolanani oligonukleotidi iji je raspored strogo

odreen., koji se pod odgovaraju&im uslovima vezuju za speci!inu komplementarnu sekvencu

nukleotida na DNK. 'a $3 reakciju, prajmeri moraju biti homologni nukleotidnim

sekvencama na svakoj strani dela DNK koji %elimo da ampli!ikujemo, to znai da mora biti

poznat taan raspored nukleotida u prajmeru. $3 reakciji uestvuju prajmeri koji su

dizajnirani tako da se sintetie tano odreeni deo DNK ogranien prajmerima. $3 reakcija se

izvodi u mikroepruveti, zapremine G,1 # 6,8 mH, gde dolazi do preciznih i ciklinih promena

temperature, to ima za posledicu ampli!ikaciju tano odreenog gena ili dela gena, milion do

milijardu puta. 3eakcioni volumen $3 smee je obino od 68#6GG H. Mikroepruvete se

postavljaju u termoblok, aparat koji zagreva i hladi reakcione epruvete u ciklusima.

$ostoje tri osnovna koraka u $3 proceduri"

6+ denaturacija DNK matrice )raskidanje vodoninih veza izmeu dva komplementarna

DNK lanca, pod uticajem temperature od 7G#7 G i traje od 1G#:GX+,

1+ hibridizacija prajmera )annealing+ u kojoj se uspostavljaju vodonine veze izmeu

prajmera i komplementarne sekvence, sada jednostruke DNK i traje 1G#GX+,

:+ DNK sinteza ili elongacija prajmera, katalizovana DNK polimerazom.


9/10

*tartovanjem od prajmera, -a> polimeraza mo%e itati in!ormaciju na lancu matrice

DNK i na osnovu toga vezuje komplemetarne nukleotide vrlo brzo. 3ezultat toga je stvaranje

dvolananog segmenta DNK koji se sastoji od jednog originalnog lanca DNK#matrice i njemu

komplementarnom novosintetisanom lancu.

Da bi moglo da doe do hibridizacije prajmera sa komplementarnim sekvencama na

matrici, potrebno je matricu DNK denaturisati odnosno raskinuti vodonine veze izmeu dva

komplementarna lanca DNK molekula. Denaturacija matrice se odvija inkubiranjem DNK

molekula na 78 G. 5ibridizacija prajmera sa odgovaraju&om sekvencom na matrici se odvija na

temperaturi od 1#8 G u zavisnosti od du%ine nukleotidne sekvence prajmera. 0longacija

prajmera tj., ugradnja nukleotida na :Y krajeve prajmera najcesce se odigrava na P1 G i

katalizovana je DNK polimerazom )Slika 2.+.

Slika 2. $ostupak $3 reakcije ) # zagrevanje do 78 o prilikom ega dolazi do

denaturacije DNK lanacaR / S 88 o hibridizacija prajmera sa odgovaraju&om sekvencom na

matriciR S P1 G -a> polimeraza sintetie nove lance DNK+

-ermostabilna -a> polimeraza omogu&ava nesmetan proces ponavljanja ciklusa bezneophodnog dodavanja enzima nakon svakog ciklusa denaturacije na visokoj temperaturi.

$3 proceduri se obino ciklusi ponavljaju 1G#8 puta to rezultuje eksponencijalnom

ampli!ikacijom %eljenog segmenta DNK. spenost ampli!ikacije se najlake proverava

elektro!orezom na agaroznom gelu, a ponekad je neophodno uraditi i neke dodatne analize"


10/10

digestija restrikcionim enzimima )tzv. restrikciona analiza+, DNK4DNK hibridizacija#*outhern

blot, sekvencioniranje itd..

Documents

Biohemijske metode u zaštiti životne sredine