Chemia koloru cz.6
Luminescencja c.d.Prof. Daniel T. Gryko
Plan wykładu
• Chemoluminescencja
• Bioluminescencja
• Sondy fluorescencyjne – obrazowanie optyczne
• Białka fluorescencyjne (Green fluorescent proteins)
Podstawy zjawiska
LuminescencjaEmisja fotonów (w zakresie ultrafioletu, widzialnym
i podczerwonym) z elektronowych stanów wzbudzonych.
FotoluminescencjaPod wpływem światła
ElektroluminescencjaPod wpływem prądu elektrycznego
ChemiluminescencjaPod wpływem reakcji chem.
Podstawy zjawiska
ChemiluminescencjaEmisja fotonów z elektronowych stanów wzbudzonych
na które cząsteczka dostała się wskutek reakcji chemicznej
1838-1914
Co i jak?
NHNH
O
ONH2
OH-, H2O2
-N2 COO-
NH2
COO-
+hv (425 nm)
NN
O
NH2 O-OOHON
O
NH2 O
NH
O- COO-
NH2
COO- *
‘Lofina’
B. Radziszewski, Chem. Ber. 1885, 18, 355-358.
NH
N OH-, O2
+hv (530 nm)
*
O
O
CHO
+HOAc, NH4OAc
Ar
N
N
ArR
OHO
Ar
N
N
ArR
OO
Ar
N
N
ArR
OO N
NR
O
O
R
R
N
NR
O
O
R
R
Zastosowania chemiluminescencji
• Rozrywka (latawce, ‘świecące patyki’)
• Analiza gazów (np. NO 1ppb)
• Analiza związków organicznych
• Sekwencjonowanie DNA
• Detekcja biomolekuł
‘Sticks’
• American Cyanamide Company 1960
hv
O O
OO
ArAr+ H2O2 O O
O O
+ 2ArOH
OH
COONat-BuOH+
H2O2
Cl
2CO2+
Emiter
Emiter*
Wzmocniona chemiluminescencja
• Peroksydaza chrzanowa jest przyłączana do interesującej nas biocząsteczki
• Ten kompleks katalizuje przekształcenie chemiluminoforu w wzbudzony emiter, który dalej utleniany H2O2 przechodzi w stan trypletowy (C=O)
• Ten ostatni przechodząc w stan podstawowy emituje światło
Bioluminescencja
BioluminescencjaProdukcja i emisja światła przez żywy organizm.
Świetlik (Photinus pyralis) Common glowworm (Lampyris Noctiluca)
Co i dlaczego?
S
N
S
N
HO
COOH
S
N
S
N
HO
OO2 + ATP, lucyferaza + CO2
AMP
PP
hv (562 nm)
Grzyb (Panellus stipticus)
S
N
S
N
N
COOH
Me
J. Am. Chem. Soc. 2010,
Sondy fluorescencyjne
• Jedna z najważniejszych metod badania komórek
• Znakowanie (labelling)
• Możliwość wielokrotnego znakowania
Sondy fluorescencyjne - wymagania
• Selektywne wiązanie z pewnych typem komórek, organelli lub cząsteczek
• Brak toksyczności
• Wysoka
• Fotostabilność
• Pozostawanie w komórce…
• Kompatybilność ze źródłłem wzbudzenia
Sondy fluorescencyjne – potrójne znakowanie
• Niebieskie (Oregon green), zielone/żółte (Alexa 588), Cy5 (czerwone)
Przykładowe sondy fluorescencyjne
Białka fluorescencyjne
• Odkrycie w 1962 (Aequorea victoria)
• Nagroda Nobla w 2008
Roger TsienMartin ChalfieOsamu Shimomura
Białka fluorescencyjne
"Roger Y. Tsien - Nobel Lecture". Nobelprize.org. 30 Oct 2010 http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/tsien-lecture.html"Osamu Shimomura - Nobel Lecture". Nobelprize.org. 30 Oct 2010 http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/shimomura-lecture.html
GFP- jak to działa?
• Właściwości spektroskopowe to rezultat interakcji chromoforu z resztami aminokwasowymi ‘dookoła’
Dlaczego GFP
• Właściwości spektroskopowe mogą być zmieniane za pomocą technik biologii molekularnych
• Łatwo przyłączalne do innych białek
• Tylko tlen niezbędny
• Nieinwazyjne
• Wzbudzenie 450-650 nm
Modyfikacje genetyczne
GFP – modyfikacje genetyczne
GFP dziś
GFP – zachód słońca
GFP - zastosowania
• Sensory
• Wizualizacja związków biologicznie czynnych w komórkach
• Mikroskopia fluorescencyjna
• Polarność rozpuszczalnika
• Pomiary gęstości cieczy