7/24/2019 IHK1
1/6
1.1 Latar Belakang
Imunohistokimia merupakan suatu cara pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas atau
kadar antibodi atau antigen dalam sediaan jaringan. Pewarnaan sediaan jaringan
menimbulkan ikatan antibodi pada antigen di permukaan atau didalam sel yang selanjutnya
dapat dideteksi dengan cara dilabel dengan enzim, isotop, fluoropore,atau coloidal gel. ntukmempelajari morfologi sel, sel dalam jaringan difiksasi kemudian dilokalisasi diantara sel dan
di!isualisasikan dengan mikroskop elektron atau mikroskop cahaya.
"eknik imunohistokimia dapat digunakan untuk mempelajari distribusi enzim yang spesifik
pada struktur sel intak #normal$lengkap%, mendeteksi komponen sel, biomakro molekul
seperti protein, karbohidrat. Imunohistokimia merupakan teknik deteksi yang sangat baik dan
memiliki keuntungan yang luar biasa untuk dapat menunjukkan secara tepat di dalam
jaringan mana protein tertentu yang diperiksa. "eknik ini telah digunakan dalam ilmu saraf,
yang memungkinkan peneliti untuk memeriksa ekspresi protein dalam struktur otak tertentu.
&ekurangan dari teknik ini adalah kurang spesifik terhadap protein tertentu tidak seperti
teknik imunoblotting yang dapat mendeteksi berat molekul protein dan sangat spesifik
terhadap protein tertentu. "eknik ini banyak digunakan dalam diagnostik patologi bedah
terhadap kanker, tumor, dan sebagainya.
1.' (umusan )asalah
1. *pa yang dimaksud dengan metode imunohistokimia+
'. *pa saja metode yang dilakukan dalam melakukan proses imunohistokimia+
. Bagaimana mekanisme imunohistokimia+
-. Bagaimana aplikasi imunohistokimia+
1. "ujuan
1. ntuk mengetahui metode imunohistokimia
'. ntuk mengetahui metode yang dilakukan dalam melakukan imunohistokimia
. ntuk mengetahui mekanisme imunohistokimia
-. ntuk mengetahui aplikasi imunohistokimia
B*B II
P)B*/*0*
'.1 Pengertian ImunohistokimiaImunohistokimia adalah metode untuk mendeteksi keberadaan antigen spesifik di dalam sel
suatu jaringan dengan menggunakan prinsip pengikatan antara antibodi #*b% dan antigen
#*g% pada jaringan hidup. Pemeriksaan ini membutuhkan jaringan dengan jumlah dan
ketebalan yang ber!ariasi tergantung dari tujuan pemeriksaan.
"eknik imunohistokimia bermanfaat untuk identifikasi, lokalisasi, dan karakterisasi suatu
antigen tertentu, serta menentukan diagnosis, therapi, dan prognosis kanker. "eknik ini
diawali dengan pembuatan irisan jaringan #histologi% untuk diamati dibawah mikroskop.
Interaksi antara antigen2antibodi adalah reaksi yang tidak kasap mata. "empat pengikatan
antara antibodi dengan protein spesifik diidentifikasi dengan marker yang biasanyadilekatkan pada antibodi dan bisa di!isualisasi secara langsung atau dengan reaksi untuk
7/24/2019 IHK1
2/6
mengidentifikasi marker. )arker dapat berupa senyawa berwarna #Luminescence%, zat
berfluoresensi #fluorescein, umbelliferon, tetrametil rodhamin%, logam berat #colloidal,
microsphere, gold, sil!er% label radioaktif dan enzim # /orse (adish Pero3idase #/(P% dan
alkaline phosphatase%.
nzim #yang dipakai untuk melabel% selanjutnya direaksikan dengan substrat kromogen#yaitu substrat yang menghasilkan produk akhir berwarna dan tidak larut% yang dapat diamati
dengan mikroskop bright field #mikroskop bidang terang%. *kan tetapi seiring
berkembangnya ilmu pengetahuan khususnya dunia biologi, teknik imunohistokimia dapat
langsung diamati #tanpa direaksikan lagi dengan kromogen yang menghasilkan warna%
dibawah mikroskop fluorescense.
'.' )etode
4alam melakukan iminohistokimia, terdapat - metode yaitu5
'.'.1 )etode 4irect
Prinsip dari metode imunohistokimia direct adalah menggunakan antibodi primer yang sudah
terlabel dan berikatan langsung dengan antigen target secara langsung. )etode langsung
#direct method% merupakan metode pengecatan satu langkah karena hanya melibatkan 1 jenis
antibodi, yaitu antibodi yang terlabel, contohnya antiserum terkonjugasi fluorescein
isothiocyanate #6I"7% atau rodhamin
Pada metode direct, antibodi spesifik yang mengenali antigen jaringan akan dimodifikasi
dengan mengkonjugasikan molekul indikator pada antibodi tersebut. molekul indikator
tersebut dapat berupa molekul yang berpendar seperti biotin atau enzim peroksidase,
sehingga apabila diberikan substrat akan memberikan warna pada jaringan tersebut.
'.'.' )etode Indirect
Prinsip metode imunohistokimia indirect menggunakan antibodi primer yang tidak ada
labelnya, namun digunakan juga antibodi sekunder yang sudah memiliki label dan akan
bereaksi dengan Ig8 dari antibodi primer. )etode tidak langsung #indirect method%
menggunakan dua macam antibodi, yaitu antibodi primer #tidak berlabel% dan antibodi
sekunder #berlabel%. *ntibodi primer bertugas mengenali antigen yang diidentifikasi pada
jaringan #first layer%, sedangkan antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer
#second layer%. *ntibodi kedua merupakan anti2antibodi primer. Pelabelan antibodi sekunderdiikuti dengan penambahan substrat berupa kromogen. &romogen merupakan suatu gugus
fungsi senyawa kimiawi yang dapat membentuk senyawa berwarna bila bereaksi dengan
senyawa tertentu.
Penggunaan kromogen fluorescent dye seperti 6I"7, rodhamin, dan "e3as2red disebut
metode immunofluorescence, sedangkan penggunaan kromogen enzim seperti peroksidase,
alkali
fosfatase, atau glukosa oksidase disebut metode immunoenzyme. Pada metode ini antibodi
spesifik yang mengenali antigen jaringan disebut sebagai antibodi primer dan tidak dilakukan
modifikasi pada antibodi ini. amun diperlukan antibodi lain yang dapat berikatan denganantibodi primer yang disebut dengan antibodi sekunder. *ntibodi sekunder ini dimodifikasi
7/24/2019 IHK1
3/6
sehingga memiliki molekul indikator pada antibodi tersebut. 0etiap 1 antibodi primer dapat
dikenali oleh lebih dari 1 antibodi sekunder, oleh karena itu, setelah diberikan substrat akan
terbentuk warna yang lebih jelas pada jaringan tersebut.
"ahap 1
"ahap '
"ahap
"ahap -
'.'. )etode Pero3idase 9 anti 9 Pero3idase #P*P%
*dalah analisis imunohistokimia menggunakan tiga molekul peroksidase dan dua antibodi
yang membentuk seperti roti sandwich. "eknik ini memanfaatkan afinitas antibodi terhadapantigen #enzim% untuk membentuk kompleks imun stabil sebagai perlawanan terhadap proses
kimia terkonjugasi 6itur unik dari prosedur ini adalah larutan enzim 9 antibodi dan kompleks
imun P*P. nzim /orseradish Peroksidase, protein imunogenik, digunakan untuk menyuntik
spesies tertentu dan merespon imun poliklonal yang dihasilkan terhadap enzim. *ntiserum ini
dipanen dan ditempatkan dalam larutan pada enzim sehingga membentuk kompleks imun
yang larut.
'.'.- )etode *!idin2Biotin27omple3 #*B7%
*dalah metode analisis imunohistokimia menggunakan afinitas terhadap molekul a!idin2biotin oleh tiga enzim peroksidase. 0itus pengikatan beberapa biotin dalam molekul a!idin
tetra!alen bertujuan untuk amplifikasi dan merespon sinyal yang disampaikan oleh antigen
target.
'. )ekanisme Imunokimia
(angkaian pemeriksaan Imunohistokimia dimulai dengan pengambilan sampel lalu
pembuatan paraffin block. 0etelah itu dilakukan pewarnaan imunohistokimia. Berikut
perinciannya 5
*. Pembuatan paraffin block
1. :aringan dicuci dengan PB0
'. 4ifiksasi dengan formalin 1;,- selama = menit kali
@. "etesi dengan 0*2/&P #0trep *!idin horse radis pero3idase% #4ako,Inc% selama -; menit
#15=;;%
1;. 7uci dengan PB0 p/ >,- selama = menit kali
11. *plikasikan cromogen untuk /(P yaitu 4*B #4iamono Benzidine% #4aco,Inc%
1'. Bilas dengan /'
1. 7uci dengan PB0 p/ >,- selama = menit kali
1-. 7ounter straining dengan mayer /emato3ilen #lab Cision% selama 1; menit1=. 7uci dengan tap Dater
1A. &ering anginkan dan mounting menggunakan entelan serta co!er 8lass
4. Pembuatan media
Larutan PB0
1. a /' P- ' /' ',- gram
'. a'/P- 1,' gram
. &/'P- ;,> gram
-. &7I A,? gram
Pembuatan
1. 4ilarutkan ke - bahan tersebut dengan aEuadest sampai 1 L
'. 4iletakkan di atas magnetic stirrer agar homogen
. 4iukur pada p/ >,- dan disterilisasi
-. 0impan disuhu dingin
=. :ika ingin diencerkan, ambil 1;; cc, tambahkan @;; mL *Euades
7ara kerja Imunohistokimia
/ari pertama1. 4eparafinisasi
7/24/2019 IHK1
5/6
a. "eteskan Fylol 'G1; menit
b. "eteskan ethanol absolute 1G= menit
c. "eteskan ethanol @;< 1G= menit
d. "eteskan ethanol ?;< 1G= menit
e. "eteskan ethanol >;< 1G= menitf. "eteskan 0terile aEuades G= menit
'. 0lide siap untuk dilakukan Imunohistokimia 5
a. 4icuci PB0 steril G= menit
b. 4ikeringkan dengan tissue
c. 4itambah /'' < dalam methanol inkubasi 1= sampai dengan ';menit
d. 4icuci PB0 steril3= menit
. Blocking unspesifik protein 5
a. 4itambah ;,'== triton231;; dalam blocking buffer B0* selama 1 jam pada suhu ruang
b. 4icuci dengan PB0 steril G= menit
-. Inkubasi antibodi primer 5
a. 4itambah antibodi primer dalam blocking buffer B0*
b. Inkubasi semalam pada -H7
c. 4icuci PB0 steril G= menit
/ari kedua
1. Inkubasi antibodi sekunder 5
a. 4itambah antibodi sekunder kit, inkubasi A; menit pada suhu kamar #walapun
menggunakan kulkas harus menggunakan lap supaya terjaga kelembabannya%
b. 4icuci PB0 steril G= menit
'. Inkubasi 0*/(P 5
a. 4itambah 0*/(P kit, inkubasi -; menit pada suhu kamar
b. 4icuci PB0 steril G= menit
c. 4icuci akuades steril G= menit
. *plikasi kromagen 4*B #dipilih 4*B karena lebih awet% 5
a. 4itambah #4*B 5buffer 4*B 15=;%, inkubasi '; menit pada suhu kamarb. 4icuci PB0 steril G= menit diaminobenzidine
-. 7ounterstain dengan mayer hemato3ilen 5
a. 4itambah #mayer 5 tap water 151;%, inkubasi =21; menit pada suhu kamar
b. 4icuci tap water steril G= menit
c. 4ikeringkan anginkan
=. )ounting dengan entellan kemudian diangin2anginkan
A. *mati preparat yang telah dilakukan Imunohistokimia di bawah mikroskoP
7/24/2019 IHK1
6/6
'.- *plikasi Imunohistokimia
Imunohistokimia dapat digunakan untuk mendeteksi berbagai penyakit, seperti kanker, tumor
dan dapat digunakan untuk identifikasi sel atau jaringan. 7ontoh penyakitnya yang dapat
dideteksi dengan Imunohistokimia adalah adenocarcinoma, carcinoma, sarcoma, /odgkinJs
disease, tumor yolk sac, karsinoma hepatoselluler, gastrointestinal stromal tumors #8I0"%,renal cell carcinoma, acute lymphoblastic leukemia, Identifikasi sel B dan sel " limfa. I/7
juga dapat digunakan pada jaringan kuda laut untuk menentukan adanya protein baik dimana
dan kapan protein akan berfungsi.
)etode imunohistokimia yang diterapkan pada kuda laut adalah dengan membagi menjadi -
section. *walnya, dilakukan penguraian untuk melakukan labeling wholemount pada sel
embrio kuda laut, penguraian ini diprotocol secara umum. &emudian, section kedua menutupi
section !ariasinya untuk labeling wholemount pada lar!a untuk menanggulangi kesulitan
antibodi dalam melakukan penetrasi di jaringan. )etode ini, didasarkan pada protocol yang
membentuk lar!a medaka., dikembangkan untuk penggunaan khusus dengan anti2asetat
tubulin antibody pada ' sampai A lar!a tertua. 4an mungkin tidak diterapkan untuk antibodi
primer, jadi yang digunakan memang biasanya antibodi sekunder. labeling jaringan yang
dilakukan pada jaringan dewasa biasanya akan lebih menyulitkan metode labeling
wholemount ini, sehingga penetrasi antibodi yang tidak lengkap. ntuk mengatasi masalah
ini perlu dilakukan pembagian material sebelumnya yang akan dilakukan labeling. Ini disebut
sebagai section ketiga. 0ection terakhir menjadi akhir dari proses labeling pada jaringan yang
sama dengan dua antibodi yang berbeda, dan mengikat serta membagi label jaringan yang
akan diuraikan.
B*B IIIP"P
.1 &esimpulan
Imunohistokimia merupakan suatu cara pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas atau
kadar antibodi atau antigen dalam sediaan jaringan. Pewarnaan sediaan jaringan
menimbulkan ikatan antibodi pada antigen di permukaan atau didalam sel yang selanjutnya
dapat dideteksi dengan cara dilabel dengan enzim, isotop, fluoropore,atau coloidal gel.
)etode yang dilakukan dalam Imunohistokimia adalah metode direct, metode indirect,
)etode Pero3idase 9 anti 9 Pero3idase #P*P%, )etode *!idin2Biotin27omple3 #*B7%.
)ekanisme Imunohistokimia dimulai dengan pengambilan sampel lalu pembuatan paraffin
block. 0etelah itu dilakukan pewarnaan imunohistokimia. "eknik Imunohistokimia dapat
digunakan untuk deteksi berbagai jenis kanker, tumor, /odgkinJs disease, identifikasi sel B
dan sel " dan dapat digunakan pada jaringan kuda laut untuk mengetahui akti!itas
proteinnya.
Recommended