7/24/2019 IHK1

1/6

1.1 Latar Belakang

Imunohistokimia merupakan suatu cara pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas atau

kadar antibodi atau antigen dalam sediaan jaringan. Pewarnaan sediaan jaringan

menimbulkan ikatan antibodi pada antigen di permukaan atau didalam sel yang selanjutnya

dapat dideteksi dengan cara dilabel dengan enzim, isotop, fluoropore,atau coloidal gel. ntukmempelajari morfologi sel, sel dalam jaringan difiksasi kemudian dilokalisasi diantara sel dan

di!isualisasikan dengan mikroskop elektron atau mikroskop cahaya.

"eknik imunohistokimia dapat digunakan untuk mempelajari distribusi enzim yang spesifik

pada struktur sel intak #normal$lengkap%, mendeteksi komponen sel, biomakro molekul

seperti protein, karbohidrat. Imunohistokimia merupakan teknik deteksi yang sangat baik dan

memiliki keuntungan yang luar biasa untuk dapat menunjukkan secara tepat di dalam

jaringan mana protein tertentu yang diperiksa. "eknik ini telah digunakan dalam ilmu saraf,

yang memungkinkan peneliti untuk memeriksa ekspresi protein dalam struktur otak tertentu.

&ekurangan dari teknik ini adalah kurang spesifik terhadap protein tertentu tidak seperti

teknik imunoblotting yang dapat mendeteksi berat molekul protein dan sangat spesifik

terhadap protein tertentu. "eknik ini banyak digunakan dalam diagnostik patologi bedah

terhadap kanker, tumor, dan sebagainya.

1.' (umusan )asalah

1. *pa yang dimaksud dengan metode imunohistokimia+

'. *pa saja metode yang dilakukan dalam melakukan proses imunohistokimia+

. Bagaimana mekanisme imunohistokimia+

-. Bagaimana aplikasi imunohistokimia+

1. "ujuan

1. ntuk mengetahui metode imunohistokimia

'. ntuk mengetahui metode yang dilakukan dalam melakukan imunohistokimia

. ntuk mengetahui mekanisme imunohistokimia

-. ntuk mengetahui aplikasi imunohistokimia

B*B II

P)B*/*0*

'.1 Pengertian ImunohistokimiaImunohistokimia adalah metode untuk mendeteksi keberadaan antigen spesifik di dalam sel

suatu jaringan dengan menggunakan prinsip pengikatan antara antibodi #*b% dan antigen

#*g% pada jaringan hidup. Pemeriksaan ini membutuhkan jaringan dengan jumlah dan

ketebalan yang ber!ariasi tergantung dari tujuan pemeriksaan.

"eknik imunohistokimia bermanfaat untuk identifikasi, lokalisasi, dan karakterisasi suatu

antigen tertentu, serta menentukan diagnosis, therapi, dan prognosis kanker. "eknik ini

diawali dengan pembuatan irisan jaringan #histologi% untuk diamati dibawah mikroskop.

Interaksi antara antigen2antibodi adalah reaksi yang tidak kasap mata. "empat pengikatan

antara antibodi dengan protein spesifik diidentifikasi dengan marker yang biasanyadilekatkan pada antibodi dan bisa di!isualisasi secara langsung atau dengan reaksi untuk

7/24/2019 IHK1

2/6

mengidentifikasi marker. )arker dapat berupa senyawa berwarna #Luminescence%, zat

berfluoresensi #fluorescein, umbelliferon, tetrametil rodhamin%, logam berat #colloidal,

microsphere, gold, sil!er% label radioaktif dan enzim # /orse (adish Pero3idase #/(P% dan

alkaline phosphatase%.

nzim #yang dipakai untuk melabel% selanjutnya direaksikan dengan substrat kromogen#yaitu substrat yang menghasilkan produk akhir berwarna dan tidak larut% yang dapat diamati

dengan mikroskop bright field #mikroskop bidang terang%. *kan tetapi seiring

berkembangnya ilmu pengetahuan khususnya dunia biologi, teknik imunohistokimia dapat

langsung diamati #tanpa direaksikan lagi dengan kromogen yang menghasilkan warna%

dibawah mikroskop fluorescense.

'.' )etode

4alam melakukan iminohistokimia, terdapat - metode yaitu5

'.'.1 )etode 4irect

Prinsip dari metode imunohistokimia direct adalah menggunakan antibodi primer yang sudah

terlabel dan berikatan langsung dengan antigen target secara langsung. )etode langsung

#direct method% merupakan metode pengecatan satu langkah karena hanya melibatkan 1 jenis

antibodi, yaitu antibodi yang terlabel, contohnya antiserum terkonjugasi fluorescein

isothiocyanate #6I"7% atau rodhamin

Pada metode direct, antibodi spesifik yang mengenali antigen jaringan akan dimodifikasi

dengan mengkonjugasikan molekul indikator pada antibodi tersebut. molekul indikator

tersebut dapat berupa molekul yang berpendar seperti biotin atau enzim peroksidase,

sehingga apabila diberikan substrat akan memberikan warna pada jaringan tersebut.

'.'.' )etode Indirect

Prinsip metode imunohistokimia indirect menggunakan antibodi primer yang tidak ada

labelnya, namun digunakan juga antibodi sekunder yang sudah memiliki label dan akan

bereaksi dengan Ig8 dari antibodi primer. )etode tidak langsung #indirect method%

menggunakan dua macam antibodi, yaitu antibodi primer #tidak berlabel% dan antibodi

sekunder #berlabel%. *ntibodi primer bertugas mengenali antigen yang diidentifikasi pada

jaringan #first layer%, sedangkan antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer

#second layer%. *ntibodi kedua merupakan anti2antibodi primer. Pelabelan antibodi sekunderdiikuti dengan penambahan substrat berupa kromogen. &romogen merupakan suatu gugus

fungsi senyawa kimiawi yang dapat membentuk senyawa berwarna bila bereaksi dengan

senyawa tertentu.

Penggunaan kromogen fluorescent dye seperti 6I"7, rodhamin, dan "e3as2red disebut

metode immunofluorescence, sedangkan penggunaan kromogen enzim seperti peroksidase,

alkali

fosfatase, atau glukosa oksidase disebut metode immunoenzyme. Pada metode ini antibodi

spesifik yang mengenali antigen jaringan disebut sebagai antibodi primer dan tidak dilakukan

modifikasi pada antibodi ini. amun diperlukan antibodi lain yang dapat berikatan denganantibodi primer yang disebut dengan antibodi sekunder. *ntibodi sekunder ini dimodifikasi

7/24/2019 IHK1

3/6

sehingga memiliki molekul indikator pada antibodi tersebut. 0etiap 1 antibodi primer dapat

dikenali oleh lebih dari 1 antibodi sekunder, oleh karena itu, setelah diberikan substrat akan

terbentuk warna yang lebih jelas pada jaringan tersebut.

"ahap 1

"ahap '

"ahap

"ahap -

'.'. )etode Pero3idase 9 anti 9 Pero3idase #P*P%

*dalah analisis imunohistokimia menggunakan tiga molekul peroksidase dan dua antibodi

yang membentuk seperti roti sandwich. "eknik ini memanfaatkan afinitas antibodi terhadapantigen #enzim% untuk membentuk kompleks imun stabil sebagai perlawanan terhadap proses

kimia terkonjugasi 6itur unik dari prosedur ini adalah larutan enzim 9 antibodi dan kompleks

imun P*P. nzim /orseradish Peroksidase, protein imunogenik, digunakan untuk menyuntik

spesies tertentu dan merespon imun poliklonal yang dihasilkan terhadap enzim. *ntiserum ini

dipanen dan ditempatkan dalam larutan pada enzim sehingga membentuk kompleks imun

yang larut.

'.'.- )etode *!idin2Biotin27omple3 #*B7%

*dalah metode analisis imunohistokimia menggunakan afinitas terhadap molekul a!idin2biotin oleh tiga enzim peroksidase. 0itus pengikatan beberapa biotin dalam molekul a!idin

tetra!alen bertujuan untuk amplifikasi dan merespon sinyal yang disampaikan oleh antigen

target.

'. )ekanisme Imunokimia

(angkaian pemeriksaan Imunohistokimia dimulai dengan pengambilan sampel lalu

pembuatan paraffin block. 0etelah itu dilakukan pewarnaan imunohistokimia. Berikut

perinciannya 5

*. Pembuatan paraffin block

1. :aringan dicuci dengan PB0

'. 4ifiksasi dengan formalin 1;,- selama = menit kali

@. "etesi dengan 0*2/&P #0trep *!idin horse radis pero3idase% #4ako,Inc% selama -; menit

#15=;;%

1;. 7uci dengan PB0 p/ >,- selama = menit kali

11. *plikasikan cromogen untuk /(P yaitu 4*B #4iamono Benzidine% #4aco,Inc%

1'. Bilas dengan /'

1. 7uci dengan PB0 p/ >,- selama = menit kali

1-. 7ounter straining dengan mayer /emato3ilen #lab Cision% selama 1; menit1=. 7uci dengan tap Dater

1A. &ering anginkan dan mounting menggunakan entelan serta co!er 8lass

4. Pembuatan media

Larutan PB0

1. a /' P- ' /' ',- gram

'. a'/P- 1,' gram

. &/'P- ;,> gram

-. &7I A,? gram

Pembuatan

1. 4ilarutkan ke - bahan tersebut dengan aEuadest sampai 1 L

'. 4iletakkan di atas magnetic stirrer agar homogen

. 4iukur pada p/ >,- dan disterilisasi

-. 0impan disuhu dingin

=. :ika ingin diencerkan, ambil 1;; cc, tambahkan @;; mL *Euades

7ara kerja Imunohistokimia

/ari pertama1. 4eparafinisasi

7/24/2019 IHK1

5/6

a. "eteskan Fylol 'G1; menit

b. "eteskan ethanol absolute 1G= menit

c. "eteskan ethanol @;< 1G= menit

d. "eteskan ethanol ?;< 1G= menit

e. "eteskan ethanol >;< 1G= menitf. "eteskan 0terile aEuades G= menit

'. 0lide siap untuk dilakukan Imunohistokimia 5

a. 4icuci PB0 steril G= menit

b. 4ikeringkan dengan tissue

c. 4itambah /'' < dalam methanol inkubasi 1= sampai dengan ';menit

d. 4icuci PB0 steril3= menit

. Blocking unspesifik protein 5

a. 4itambah ;,'== triton231;; dalam blocking buffer B0* selama 1 jam pada suhu ruang

b. 4icuci dengan PB0 steril G= menit

-. Inkubasi antibodi primer 5

a. 4itambah antibodi primer dalam blocking buffer B0*

b. Inkubasi semalam pada -H7

c. 4icuci PB0 steril G= menit

/ari kedua

1. Inkubasi antibodi sekunder 5

a. 4itambah antibodi sekunder kit, inkubasi A; menit pada suhu kamar #walapun

menggunakan kulkas harus menggunakan lap supaya terjaga kelembabannya%

b. 4icuci PB0 steril G= menit

'. Inkubasi 0*/(P 5

a. 4itambah 0*/(P kit, inkubasi -; menit pada suhu kamar

b. 4icuci PB0 steril G= menit

c. 4icuci akuades steril G= menit

. *plikasi kromagen 4*B #dipilih 4*B karena lebih awet% 5

a. 4itambah #4*B 5buffer 4*B 15=;%, inkubasi '; menit pada suhu kamarb. 4icuci PB0 steril G= menit diaminobenzidine

-. 7ounterstain dengan mayer hemato3ilen 5

a. 4itambah #mayer 5 tap water 151;%, inkubasi =21; menit pada suhu kamar

b. 4icuci tap water steril G= menit

c. 4ikeringkan anginkan

=. )ounting dengan entellan kemudian diangin2anginkan

A. *mati preparat yang telah dilakukan Imunohistokimia di bawah mikroskoP

7/24/2019 IHK1

6/6

'.- *plikasi Imunohistokimia

Imunohistokimia dapat digunakan untuk mendeteksi berbagai penyakit, seperti kanker, tumor

dan dapat digunakan untuk identifikasi sel atau jaringan. 7ontoh penyakitnya yang dapat

dideteksi dengan Imunohistokimia adalah adenocarcinoma, carcinoma, sarcoma, /odgkinJs

disease, tumor yolk sac, karsinoma hepatoselluler, gastrointestinal stromal tumors #8I0"%,renal cell carcinoma, acute lymphoblastic leukemia, Identifikasi sel B dan sel " limfa. I/7

juga dapat digunakan pada jaringan kuda laut untuk menentukan adanya protein baik dimana

dan kapan protein akan berfungsi.

)etode imunohistokimia yang diterapkan pada kuda laut adalah dengan membagi menjadi -

section. *walnya, dilakukan penguraian untuk melakukan labeling wholemount pada sel

embrio kuda laut, penguraian ini diprotocol secara umum. &emudian, section kedua menutupi

section !ariasinya untuk labeling wholemount pada lar!a untuk menanggulangi kesulitan

antibodi dalam melakukan penetrasi di jaringan. )etode ini, didasarkan pada protocol yang

membentuk lar!a medaka., dikembangkan untuk penggunaan khusus dengan anti2asetat

tubulin antibody pada ' sampai A lar!a tertua. 4an mungkin tidak diterapkan untuk antibodi

primer, jadi yang digunakan memang biasanya antibodi sekunder. labeling jaringan yang

dilakukan pada jaringan dewasa biasanya akan lebih menyulitkan metode labeling

wholemount ini, sehingga penetrasi antibodi yang tidak lengkap. ntuk mengatasi masalah

ini perlu dilakukan pembagian material sebelumnya yang akan dilakukan labeling. Ini disebut

sebagai section ketiga. 0ection terakhir menjadi akhir dari proses labeling pada jaringan yang

sama dengan dua antibodi yang berbeda, dan mengikat serta membagi label jaringan yang

akan diuraikan.

B*B IIIP"P

.1 &esimpulan

Imunohistokimia merupakan suatu cara pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas atau

kadar antibodi atau antigen dalam sediaan jaringan. Pewarnaan sediaan jaringan

menimbulkan ikatan antibodi pada antigen di permukaan atau didalam sel yang selanjutnya

dapat dideteksi dengan cara dilabel dengan enzim, isotop, fluoropore,atau coloidal gel.

)etode yang dilakukan dalam Imunohistokimia adalah metode direct, metode indirect,

)etode Pero3idase 9 anti 9 Pero3idase #P*P%, )etode *!idin2Biotin27omple3 #*B7%.

)ekanisme Imunohistokimia dimulai dengan pengambilan sampel lalu pembuatan paraffin

block. 0etelah itu dilakukan pewarnaan imunohistokimia. "eknik Imunohistokimia dapat

digunakan untuk deteksi berbagai jenis kanker, tumor, /odgkinJs disease, identifikasi sel B

dan sel " dan dapat digunakan pada jaringan kuda laut untuk mengetahui akti!itas

proteinnya.