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MANIPULATIONETMETHODED’ANALYSEDESCELLULES

OBTENTIONDESCELLULES

Lepremierobjectifestdeséparerlesdifférentescellulesdelamembraneextra-cellulairedutissucible

Deuxcasdefigure:

1- Lacelluleestunecellulesanguine,danscecaselleestdéjàensuspension(enmilieuliquide),

2- Lacelluleappartientàuntissu(casleplusfréquent):ilvafalloirl’extraireetladissocierdesamatriceextra-cellulaire(ouMEC)afindel’exploiter.

Ilexiste3techniquespourséparerlescellulesdeleurMEC:

è Technique«biochimique»utilisantdesenzymes,commelatrypsine

è Techniquemécaniqueconsistantenuneagitationlégèredelapréparationcellulaire

è Techniquechimiquenécessitantl’EDTA(acideEthylèneDiamineTétraacétique)quiéliminelecalciumintra-cellulairequipermetl’adhésionàlamatriceextra-cellulaire

NB:unecelluledissociéedesaMECn’estplusfonctionnellecarellen’estplusdanssonenvironnementtissulaire,plusencommunicationaveccelui-ci,onadoncuneperted’informationsconcernantsafonctionetcertainsmécanismesenrapportaveclebio-environnementdelacelluled’intérêt.SEPARATIONDESCELLULESOnsouhaitemaintenantséparerlesdifférentstypescellulairesobtenuspourconserveruniquementlescellulesciblesOnmaitriseplusieurstechniquesdeséparation,desplussimplesauxpluscomplexesnousavons:

è Centrifugationàbassevitesse:baséesurlamorphologiedescellules(tailledunoyau,formeducytosquelette),

è AdhérenceauxboitesdePétri:certainescellulesadhèrentplusoumoinsauxboitesdeculture,celaestfonctiondeleurcapacitéàconsidérerleplastiquedelaboitedePétricommeleurmatriceextra-cellulaire.LescellulessanguinesreposantsuruneMECliquide(Cfcoursd’histologiesurletissusanguin)cettestratégieestpeuefficacesurcescellules

è Chromatographied’affinitéouPurificationsursupport:Techniqueimmunologiques’appuyantsurlareconnaissancedesantigènesdesurface.Onintroduitunsupportneutre(lamatriced’affinité)comportantdesanticorpsspécifiquesdesantigènesdescellulesd’intérêt,quisefixerontensuitesurcelles-ci.



Ondistinguedeuxsélections:

Ø Sélectionpositive:lesanticorpsdelamatricecorrespondentauxantigènesdescellulesd’intérêt.Onrécupèreralescellulesaccrochéesàlamatriced’affinité,

Ø Sélectionnégative:lesanticorpsdelamatricecorrespondentauxantigènesdel’ensembledescellulesprésentesSAUFcellesquinousintéressent.Onrécupèredonclescellulesquinesesontpasaccrochéesàlamatriced’affinité.

MContrairementàcequ’onpourraitpenser,c’estlasélectionnégativequiestprivilégiée,caronnesouhaitepasstresserlescellulesaveclesenzymesnécessairesàlaséparationdesanticorps,lorsdelarécupérationdescellulessurlamatriced’affinitélorsdelasélectionpositive.Decettemanièrenouspourronsmieuxobserverl’ensembledespotentialitéscellulairesMLaCytométriedeflux(Cytos:lacellule,etmétros:lamesure)

Principe:Descellulesensuspension(renduesfluorescentesoupas)circulentàgrandevitessedansunappareilquisechargeradelesanalyserindividuellement.



Ilexistedeuxcatégoriesdecytométriedeflux:

è Cytométrieanalytique:quianalyse(décrit)simplementlescellulesenutilisantdesprocédésoptiques(commeladiffractionoulafluorescence)pourcaractériserlamorphologieetlesdifférentstypescellulairesavecunecapacitédetraitementde10000à1000000decellules/minute.

è Cytométriedeséparation(ouFACS):quianalyseETséparelescellulesenfonctiond’unequantitédefluorescence.

PrincipeduFACS:lescellulesensuspension,qu’onaurapréalablementrenduesfluorescentesetexcitéesavecunlaserprévuaceteffet(Cfcourssurlamicroscopie)arriventdansl’appareilàgrandevitesseetsontemprisonnéesdansunegouttelettechargéeélectriquementdontlachargeestproportionnelleàlaquantitédefluorescenceémise.Lesgouttelettesainsicrééesserontdéviéesdansunchampélectriquepuisséparéesenfonctiondeleuranglededéviationpourêtretriées.Lacapacitédetraitementdel’appareilestde500cellulesparseconde.NB:cesontlesgouttesquisontélectriquementchargées,paslescellules.

Applicationsdelacytométriedeflux:

Ø Numérationdescellulesensuspension(formulesanguine),Ø Déterminationdelaproportiondecellulesmorteset

vivantesd’unéchantillon,Ø Trierlescellulesd’unebiopsietissulaire,Ø Analyseducyclecellulaire(vialaquantitéd’ADN).



CULTURECELLULAIREUnefoisquelescellulessonttriées,nouscherchonsàobtenirungrandnombredecellulesd’intérêt,afindemenerd’éventuellesexpériencesetdelimiterlesprélèvements.Tableaurécapitulatifdesavantagesetdesinconvénientsdelaculturecellulaire

Ilexistedesméthodespourdiminuerlesinconvénientsdesculturescellulaires,commelesculturesorganotypiques,qui,commeleurnoml’indique,reproduisentl’environnementtissulairedel’organed’oùsontextraiteslescellules.Parexemple,pourdescellulesdutissuconjonctifdel’épiderme,onvaajouterdesfibroblastesetdescellulesépithélialespourmimerlapeau.

Culturedemicro-organismes:Cettesectionconcernelesêtresunicellulaires,commeleslevures(quisontdesorganismeseucaryotes)oulesbactéries(quisontdesorganismesprocaryotes)

Poursedévelopper,lesmicro-organismesnécessitentunmilieusemi-solide(généralementdelagélose)etdesnutrimentsessentielsàleursurvie.Leurtempsdedivisioncellulaireestcourt(2heurespourunelevureet30minpourunebactérie)cequileurconfèrel’avantaged’êtreunmodèledecomportementcellulairesimpleetrapideàobtenir.Cescellulespoussantsousformede«colonies»lesvariantsrapidementobtenussontaisémentisolables.

Culturedecellulesanimales:Lescellulesanimalesétantissuesd’individuspluricellulaireseucaryotes,leursconditionsdeculturesontpluscomplexesetexigeantes.

Lescellulesanimalessemultiplientsurunmilieusolide,mimantlamatriceextra-cellulaire(SAUFlescellulescancéreuses)àl’aided’élémentsessentiels,commelesprotéines,leslipidesetlesglucides.Al’inversedesmicro-organismes,cescellulesnécessitentunsignalpoursediviser,cesignalseradélivréviadesfacteursdecroissance(contenusparexemple,danslesérumdeveaufœtal)ajoutésàlapréparation,oudesoncogènes(voirplusloin).

AVANTAGES INCONVÉNIENTS-Contenucellulairehomogène,contrairementautissud’origine,-Contrôledesconditionsexpérimentales,-Possibilitéd’isolerunecelluleuniquepourobtenirdesclonesidentiques…

-Perted’informationsurlecomportementetlespotentialitésdelacellule(ex:éventuellemétaplasiecellulaire)carpasdanssonmilieunaturel,-Ilexisteunrisquedesélectionnerunvariantcellulaire(mutationponctuelleplusoumoinssignificative)etdel’amplifierparinadvertance.



Lesdifférentesculturescellulaires:4Lesculturesprimaires:Cellulesnormalesenculture.Chaquecelluleaun«potentieldedivision»donné(unecinquantainepourlefibroblaste).Unefoiscepotentielatteint,lacelluleentreensénescence,ellenepeutplussedivisermaisrestemétaboliquementactive(Cfcourssurlasénescence),ceprocessusétantirréversible,ilmetdéfinitivementfinàl’expérimentation.4Lesculturesimmortelles:Onoctroielacapacitédesediviserinfinimentauxcellulesviaunvirusoncogène(typepapillomavirus)ouonprélèvedirectementdescellulestumoralessurunpatientouunanimal.Cescelluleséchappantauphénomènedesénescence,onpeutmenerungrandnombredemanipulationsàpartirdesmêmescellules(maisattentionauxmutationsinopinées).

Petitecoloniedecellules

Tableaurécapitulatifdesdifférentsmodesdeculturecellulaire

Micro-organismes Cellulesanimales

-Milieusemi-solide-Nutrimentsessentiels-Tempspourdivisioncellulairecourt(environ2h)-Variantsfacilementisolables

-Milieusolide-Nutrimentsessentiels+facteursdecroissance-Tempspourdivisioncellulaireplusélevé(environ24h)-Lignéesnormales:50divisionspuissénescence-Lignéesimmortelles:spontanées(cancer)ouartificielles(virusoncogène)nombreinfinidedivision

ANALYSEDUCONTENUCELLULAIREÀprésent,onsouhaiteconnaitrelescomposantsprécisdescellulesdecultures(quisont,enthéorie,toutesidentiques).Pourcela,nousvoulonsobtenirunesuspensioncellulairequiserviradebasepourlesanalyses.

Différentesméthodesdelysecellulaire:4Sonication:applicationd’ultra-sonspourbriserlescompartimentsmembranaires(noyau,membraneplasmiqueetc…).4Chocosmotique:onajouteunesolutionditehypotoniquequialaqualitédepénétreràtraverslescellulesetdelesfairegonflerpuiséclater.



4Détergentschimiques:quidétruisentleslipidesmembranaires,l’avantagedecettetechniqueestlacapacitéàdétruireélectivementcertainesmembranes(uniquementlamembranenucléaireparexemple)enfonctiondesdétergents.4Frottementsetrupturedesmembranesavecunpiston:techniquepurementmécanique.Maintenantquel’onaobtenuunesuspensioncellulaire,composéed’unmélangedemoléculesetd’organitesdescellules,nousallonstriercesdifférentscomposantsafindelesétudier,grâceà:

è Desméthodesdefiltration:pourlesplusgrosélémentsè Lacentrifugation:pourlesdifférentsorganites

Deuxtypesdecentrifugation:

Ø Centrifugationdifférentielle:quiconsisteenune

séparationenfonctiondelatailleetdelamassedesorganitesàl’aidedel’augmentationcroissantedelaforcecentrifugeetdutempsdecentrifugation.

CONDITIONSEXPERIMENTALES

ELEMENTSOBTENUS

Suspensioncellulairesansaucuneintervention

Cytosol(surnageant)

10minutes/600G Noyau5minutes/15000G Fractionmicrobodies

(mitochondries,peroxysomes,lysosomes)

60minutes/100000G Fractionmicrosomale(réticulumendoplasmique,

ribosomesreliéspardesARNmoupolyribosomes,membrane

plasmique)120minutes/300000G Virus,polyribosomes,

ribosomes



NB:onparled’ultra-centrifugationquandleseuildes100000Gestatteint.

Ø Centrifugationisopycniqueouàl’équilibreengradientdedensité:

Onprépareuntubeàessaiavecdes«coussinsdesucrose»dedensitésconnuesetcroissantes,puisoncentrifugel’extraitcellulaire.Lesorganitesserontséparésenfonctiondeleurdensitécarilssédimenterontauniveauducoussindesucrosecorrespondantàleurpropredensité.Onprélèverafinalementlagalettedesucrosecomportantl’organited’intérêt.

COMPOSITIONMOLECULAIREFinalement,unefoislesorganitesséparés,onanalyseprécisémentleurcontenu.

Etudedunoyauetducytosol:

Ø PucesàADN(étudedugénomeetdutranscriptome)Onfixedessuitesdenucléotidescorrespondantàdesséquencesprécisesdegènessurlescases(ouspot)d’unelamedeverre,quicontiendral’ensembledugénomedelacelluleétudiée.Intérêt:étudierlatranscriptiond’ungènedansdifférentesconditionsexpérimentales(parexemple:enconditionsaérobiesouanaérobies)Principeetmarcheàsuivre:-Onplacenoscellules(ouextraitscellulaires)dansdeuxouplusieurssituationsexpérimentales(doncdansdeséprouvettesdifférentes),-RécupérationséparéedesARNsmessagers(indicateursdel’expressiongénique),-Utilisationd’unetranscriptaseinverse,uneenzymequitransformel’ARNenADN(Cfcoursdebiologiemoléculaire),-OnéquipelesADNcobtenusdefluorochromesdecouleursdifférentes(commeunesonded’hybridation),-AjoutdesADNcissusdesdifférentesconditionsexpérimentalessurlapuceàADN:s’ilss’hybrident,onobserveunefluorescence,ilyadoncexpressiondugène.



SIuneseulecouleurdefluorescenceestobservée,legènen’estactifquedansl’unedessituationsSIonremarqueunedoublefluorescence(ex:Rouge+Vert=Jaune)legèneestactifdanslesdeuxsituations.Cettetechniqueestanciennemaistoujoursutiliséeenlaboratoire,elletendàêtreremplacéeparlesméthodesnouvellesgénérations,quisedémocratisent.

Ø NGS(next-generationsequencing)ouséquençagehautdébit:

Cettemachinepermetelleaussil’étudedugénomeetdutranscriptome,maisàunevitessebienplusélevée,surdeplusgroséchantillonsetdemanièreautomatisée.

Principe:OndéposeunéchantillonADN(oulenoyaucellulaireentier)danslamachinequiva«l’éclater»enmilliersdefragments,dontelledétermineralaséquencenucléotidique(onparledeséquençage)afindedéterminersilegèneestmuté,présentedesdélétionsoudesinsertions,enlecomparantàunebasededonnées.(VousapprendrezenUE11Slefonctionnementexactdel’outilinformatique,cetexposéestprésentpourillustrerlarévolutionmédicaleetbiologiquequ’estleNGS,paspourposerdesquestionssurlefonctionnementprécisdelamachine)NB:l’intégralitédugénome(109pairesdebases)peutêtreséquencéeenquelquesheuresaveccettemachine.



Applications:-Séquençagedugénome-Diagnosticpré-natalnoninvasif(détectiond’unetrisomie13ou18vial’ADNfœtalcirculantdanslesangmaternel)-Caractérisationdescellulescancéreusespourunethérapiepersonnalisée-Étudeetdécouvertedesmutations,pourlesmaladiesraresnotamment

Étudedeprotéinescytosoliquesoumitochondriales:

Ø Spectrométriedemasse:déterminerlacompositionetlamassed’uneprotéineinconnue

Principe:-Onprocèdeaudécoupaged’uneprotéineinconnueàl’aidedediversesprotéases,-Onplacelespeptidesobtenusàl’entréedelachambred’ionisation,onleurappliqueunechargeélectriquearbitraireetonmesureleurdéviationquiserafonctiondeleurmasse,commelorsqu’onenvoiedesparticuleschargéesdansuncondensateur(CfUE3a),-Lamassedespeptidesétantcorréléeàleurcompositionenacidesaminés,l’ordinateurdéterminelacompositionprécisedelaprotéineinconnueàl’aidedesfragmentsdepeptidesetdesabasededonnées.

Félicitations pour avoir terminé (une énième fois sans doute) cette fiche ! Elle est plutôt longue mais accessible, et très utile pour comprendre les expériences, car elle illustre les principales techniques de base en laboratoire. Bon courage !