MMP-2, MMP-8, MMP-9 og TIMP- koncentrationer i den Cervikale Slimprop i forhold til succes ved igangsætning af fødsel.
IndledningDenne Forsknings metodologiske opgaver er lavet ud fra et forskningsår på Gyn/Obst. afd. Y på skejby sygehus: Matrix metalloproteinaser - Er gravide kvinder responderer/non-respondere ved igangsætning af fødslen med fødekapsel. Det er et projekt udgået fra et PhD udført af Cand. Med. PhD. Naja Becher, der har været en stor hjælp i hele processen. Formålet med opgaven var
• At undersøge, om man ved at teste gravide kvinders slimprop forud for igangsætning af fødslen kan udtale sig om, hvorvidt kvinden vil responderer på igangsætningsmetoden eller ej.
• At udforske slimproppens antibakterielle egenskaber, herunder sammenhængen mellem infektion og for tidlig fødsel.
Naja Becher har udviklet metoden til indsamling og ekstraktionen så den endelige fortynding var brugbart på ELISA-kittene. De intakte slimpropper (Cervical Mucus Plug, CMP) er indsamlet af hjælpsomme og opmærksomme jordmødre på fødegangene og de distale prøver er indsamlet af mig under kyndig oplæring af Professor Niels Uldbjerg. Derudover Var Lektor Carl Christian Danielsen, Bindevævsbiologisk afd., Anatomisk Institut min hovedvejleder og fulgte mig gennem analyser og forsøg i forbindelse med Toll-Like receptors (TLR). Bioanalytiker Eva Mikkelsen har udført en kæmpe indsats i forbindelse med Western Blot i forsøget på at at visualisere TLR i CMP. På Y-forskningslab. har jeg udført laboratoriearbejdet, i forbindelse med ekstraktions- og ELISA-processerne, hvor Bioanalytiker Kirsten Zeeberg med entusiasme og godt humør har assisteret og kommenteret. I forbindelse med forskningsåret, har jeg deltaget i Kursus for Stata og PhD-kursus i Biostatistik og det har stillet mig stærkt i forbindelse med at skulle udregne statistiske analyser og opstille grafer.
En STOR og dybfølt TAK til alle der har hjulpet mig eller holdt mig ved godt selskab.
_________________________________________________
Marie Normark Holmgaard
1
Baggrund Igangsætning af fødslen
På skejby sygehus er der 11% af de gravide kvinder der går over termin. Disse kvinder undergår
mekanisk eller medicinsk igangsætning af fødslen, da det er bevist at have maternelle og føtale
konsekvenser. Igangsætningen initierer den inflammatoriske proces der leder op til fødslen. [1]
På skejby sygehus bruges præparatet Cytotec®, tabletter a 50 μg Misoprostol, der er et syntetisk
prostaglandin E1-analog.
Fysiologiske og immunologiske processer ved normal fødsel
Normal fødsel indebærer 3 fysiologiske processer: cervix remodellering, fosterhindesvækkelse og
ruptur og rytmiske kontraktioner.
Cervix
Forandringerne i cervix er afhængig af og underlagt hormonel og immunologisk kontrol.
Immunologisk er det påvist at pro-inflammatoriske cytokin koncentrationer af IL-8, IL-1β, IL-6 og
TNF-α forøges, hvorved bl.a. produktionen af de zink-afhængige proteinaser Matrix
Metalloproteinaser (MMP) forøges og ekspressionen af Tissue Inhibitor of Metalloproteinase
(TIMP) nedreguleres. [2] Kollagenaserne (MMP-8) nedbryder fibrillær og non-fibrillær kollagen.
Gelatinase-A (MMP-2) og Gelatinase-B (MMP-9) nedbryder kollagen type IV, elastin,
proteoglykaner og fibronectin. [3] MMP-8 og -9 secerneres af IL-8 aktiverede neutrofile
granulocytter, der under graviditet og fødsel diffunderer ind i cervix. IL-8 stimuleres af COX2 og
PGE2, der i sig selv enten stimulerer proteinaseprod. direkte eller indirekte via leukocyt influx pga.
øget kar permeabilitet. [2] TIMP er påvist i endothelceller og glatte muskelceller. [4]
Fosterhinder
I fosterhinderne sker der en lignende pro-inflammatorisk proces, hvor cytokin koncentrationen og
dermed MMP-9 forøges. MMP-2 der nævnes som værende et ikke inducerbart enzym forbliver
uændret og TIMP reduceres. [2][5] MMP2 produceres af amnion epitheliale og chorionoidale celler
[6], cervikale fibroblaster og glatte muskelceller. [7]
2
Myometriet
I myometriet resulterer cytokin opreguleringen i COX2 og PGE2 produktion og efterfølgende uterin
kontraktion, samt forøget MMP-9 prod. [2]
MMP MMP transkriptionen påvirkes af bl.a. progesteron, østrogen, glucokortikoider, IL-1,-8, TNF-α og
NO. De opererer ved neutral pH og frigives som latente zymogen former, der aktiveres
ekstracellulært. Ved ikke gravide findes MMP i tre former, som frie molekyler eller i kompleks med
TIMP eller α2-makroglobulin, hvorved den normale balance opretholdes. Ved fødsel ændres disse,
så ECM remodellering og modning af cervix kan foregå. Samlet kollagenkoncentration i cervix er
ved fødslen reduceret til 30% af ikke-gravides. [8]
CMPDisse strukturer og processer er alle i tæt relation
til Slimproppen, en unik viskoelastisk,
fysiologisk og immunologisk struktur, der
secerneres fra de endocervikale krypter. Sekretet
udtamponerer cervix kanalen under graviditet.
Den er en effektiv sterisk og immunologisk
barriere for det intrauterine miljø og er distinkt
forskellig fra ikke-gravid cervix sekret. Den består af en
uterin, acellulær og en vaginal, cellulær del, hvor cellerne hovedsageligt består af neutrofile
granulocytter. De førnævnte inflammatoriske cytokiner er også påvist, men afviger i koncentration
og menes at bliver produceret af fibroblaster og andre immunceller underlagt kontrol af vaginal
mikroflora. MMP-2, -8 og -9 samt TIMP-1 er også påvist og korrelerer stærkt med IL-8 konc. [9,
10]
HypoteseCytotecVi ønsker at undersøge hvorvidt Cytotec behandlingen påvirker CMP i form af MMP-2, -8 -9 og
TIMP-1 og derved afspejler cervix funktionen med øget inflammation hos kvinder der får fødslen
igangsat med Cytotec i forhold til kvinder der går spontant i fødsel.
3
Fig. 1: Biokemisk kaskade involveret i fødselforløbet. [2]
intakt cmp med og uden miso
og herunder også at vurdere om der er forskel på de leukocyt deriverede komponenter (MMP-8 og
-9) og de cervix deriverede komponenter (MMP-2 og TIMP-1)[10]
CMPEn kuriositet er at kun 50% af kvinderne der møder til igangsætning reagerer på medicinsk
igangsætning med Cytotec! Derfor har vi ønsket at undersøge om det var muligt at inddele kvinder
med der kommer til igangsætning ved grav. prolong. i respondere (resp) eller non-respondere (non-
resp) .
Materialer og MetoderDistale CMP lave tabel oversigt over alder, gest.alder, cmpvægt, igangsætningsårsag. )
28 distale CMP er indsamlet i forbindelse med grav. prolong. procedure. Kvinderne havde en
gennemsnitsalder på 31 år (min-max: 26-39) 16 kvinder fik foretaget hindesprængning (HSP) og 12
fik lagt Cytotec i fornix post. Disse 28 kvinder fik inden disse tiltag foretaget GU med amnioskop,
hvorved det var muligt med anatomisk pincet at tage en prøve (mean: 0.15g (min-max 0,007g-1,8g)
fra den distale del af CMP. Prøven blev overført til Cryorør og inden for 30 minutter frosset til
-20oC.
Intakte CMP35 intakte CMP (gennemsnitsvægt: 4,8g (min-max: 0,5-14)) er indsamlet på fødeafdelingerne,
skejby sygehus. Af disse er 15 (graviditetsuge 385-413), indsamlet ved spontan vaginal fødsel, hvor
CMP er udskilt automatisk eller ved manuel eksploration. Kvinderne var raske med
gennemsnitsalder på 30 år (min-max 23-34)
20 er ligeledes indsamlet under vaginal fødsel (graviditetsuge 370-420), men hvor kvinderne har
modtaget Cytotec inducering. Kvinderne havde forskellige indikationer for igangsætning, herunder
grav. prolong, IUGR, føtus mortuus, Stort foster, GD. Der blev givet i gennemsnit 2 x 50 mg
Cytotec (min-max: 1-6) over gennemsnitlig 2 dage (min-max: 1-4) De havde en gennemsnitsalder
på 33 år (min-max 20-44). CMP blev nedfrosset til -20o C inden for 30 minutter og efterfølgende
luftforseglet og frosset til -80oC til senere ekstraktion.
Den centrale videnskabsetiske KomitéForsøget er godkendt ved Den Centrale Videnskabsetiske Komité og der blev på forhånd indsamlet
informeret samtykke fra alle deltagere.
Enzyme linked immunosorbent assay kit Kommercielle Elisa kit blev forhandlet via GE Healthcare.
4
distal cmp hsp, 1. udvælgelse udføres af jordmødrene, derfor er misogruppen den der skal undersøges på
intakt cmp med og uden miso
Ekstraktion
CMP blev for alles vedkommende pulveriseret i flydende kvælstof i en manuel morter. En
slutfortynding på 1:100 med ekstrahering over 3 døgn under fuld rotation forudgået af manuel eller
maskinel homogenisering med ekstraktionsbuffer (50 mmol/L Tris HCL, 10 mmol/L CaCl, 0,05%
Brij35 og 25 µmol/L phenylmethylsulfonyl flouride (PMSF)) . Supernatant afpipetteres og pooles.
Elisa
MMP-2,-8,-9 og TIMP-1 koncentrationmålingerne blev udført med dobbeltbestemmelser på
kommercielt forhandlede
ELISA-kits, baseret på en
“2-site sandwich format”.
Efter afpipettering i
brøndene, blev pladen
aflæst på APP navn!
Statistik
Statistik programmet Stata
11 er blevet brugt til at udføre
parametriske og non-parametriske tests og visualiserer tallene i grafer og box-plot. For at opnå
normalfordeling, blev tallene log-transformerede og efterfølgende udregnet P-værdier vha. uparret
t-test og Fischers exact test. Lineær regression blev udført i forbindelse med vurdering af Cytotec’s
effekt på MMP og TIMP koncentrationerne.
P-værdier under 0,05 anses for at være statistisk signifikante.
Værdier under detektionsgrænsen (ND) regnes med i grupperne som nedre detektionsgrænse.
ResultaterVi har undersøgt effekten af Cytotec administration ved at analyserer intakte CMP indsamlet under
fødsel med eller uden Cytotec påvirkningen. Vi undersøger om tidsintervallet der gives Cytotec,
eller mængden af Cytotec har størst betydning. Samtidig undersøger vi om der er forskel på de
leukocyt deriverede og de cervix deriverede komponenter.
Desuden har vi undersøgt om det var muligt at forudsige udfaldet af Cytotec behandlingen ved at
analysere distale CMP opsamlet inden igangsætning i form af HSP eller Cytotec adm.
5
Komponent Genkendelsesstrukturer Interval (ng/mL) Detektionsgrænse (ng/ml)(ng/mg CMP)
MMP-2
MMP-8
MMP-9
TIMP-1
Pro-MMP-2, pro-MMP-2/TIMP-2 1,5-24,0 0,37 (0,037)
pro-MMP-8, aktiv MMP-8 (både frit og inhibitorkompleksbundet)
0,25-4,0 0,032 (0,0032)
pro.MMP-9, pro-MMP-9/TIMP-1 kompleks
1,0-32 0,6 (0,006)
total TIMP-1 (frit og MMP kompleksbundet)
3,13-50,0 1,3 (0,13)
Fig. 2: Informationsoversigt over elisa-kit, der oplyser genkendelsesstrukturer,
detektionsgrænse (ng/mL)(ng/mg CMP)og måleinterval (ng/mL)
Det vil have en stor værdi for kvinder der kommer til igangsætning, at de fra starten kan få klarhed
over hvilken behandling der er bedst i deres tilfælde, i stedet for at prøve sig frem, så vi ønsker at
undersøge om disse faktorer kan være af prognostisk værdi for at vurdere om gravide kvinder over
termin vil have effekt at medicinsk igangsætning vurderet ud fra MMP-2, -8, -9 eller TIMP-1.
Det vil i klinikken være en nem undersøgelse, da CMP er en lettilgængelig struktur og en nem og
smertefri prøvetagning.
Intakte CMPDet er for intakte CMP, indsamlet under spontan eller Cytotec-induceret fødsel, muligt at påvise
stat. sign. højere koncentration af MMP-8
(p=0,027) hos de kvinder der fik sat
fødslen igang. De andre parametre var
ikke stat. sign. forskellige. (fig. 3)
Tidsinterval
I intakte CMP kan der detekteres stadigt
ændrede parametre over dage. De der har
fået Cytotec 1-2 dage har stat. sign
forøget koncentration af TIMP-1 i
forhold til de der ikke er blevet
6
Fig 3: Box plot af MMP-2, -8, -9 og TIMP-1 koncentrationerne fra intakte CMP indsamlet før og efter Cytotec behandling
Fig. 4: MMP-2 konc. målt i intakt CMP efter hhv. 0, 1-2, og ≥3 dage med gentagne Cytotecdoser.
Fig. 5: Box plot af MMP-8 konc. målt i intakt CMP efter hhv. 0, 1-2, og ≥3 dage med gentagne Cytotecdoser.
inducerede. For de der har fået
prostaglandin kan der ses stat.
sign. forøget MMP-8 (p=0,03) og
stat. sign. nedsat MMP-2 (p=0,02)
og TIMP-1 (p=0,004) efter 48
timer. MMP-8 forøgelsen ses
tydeligt mellem de der føder
spontant og de der har fået
prostaglandin i ≥ 3 dage. (p=0,007). (fig. 4-8)
Cytotec-koncentration
Ændres opmærksomheden til antallet af
kapsler lagt op ses der for MMP-2 en stat.
sign. reduktion på 0,44 ng/mg CMP pr
given kapsel (p= 0,046). For MMP-9 ses
der en stat. sign. stigning på 1,38 ng/mg
CMP pr given kapsel (p=0,037). For
MMP-8 og TIMP-1 ses der hhv. en stærk
stigende og en faldende tendens uden den
dog er stat. sign. (fig 9-13)
7
Fig. 7: Box plot af TIMP-1 konc. målt i intakt CMP efter hhv. 0, 1-2, og ≥3 dage med gentagne Cytotecdoser.
Fig. 6: Box plot af MMP-9 konc. målt i intakt CMP efter hhv. 0, 1-2, og ≥3 dage med gentagne Cytotecdoser.
Fig.8: P-værdier fra t-test udført på MMP-2, -8, -9 og TIMP-1 i forhold til effekten af cytotec administreret over dage.
T-test spontan fødsel vs. 48 timer m Cytotec.
48 timer m. Cytotec vs. 52 timer m Cytotec
spontan fødsel vs 52 timer m cytotec.
MMP-2 0,14 0,02 0,23
MMP-8 0,2 0,03 0,007
MMP-9 0,82 0,27 0,2
TIMP-1 0,07 0,004 0,2
Fig. 9: MMP-2 konc. udvikling afhængig af hvor mange kapsler der er givet før prøvetagning med bedste fitted line
Distale Nappeprøver
For de distale CMP var der for Timp-1’s vedkommende en udetekterbar mængde hos gruppen der
var klar til at få foretaget HSP.
Alle i HSP-gruppen gik i fødsel
inden for 24 timer. (Fig. 14)
I forsøget på at opdele disse
patienter i respondere (resp)/non-
respondere (non-resp),
8
Fig. 10: MMP-8 konc. udvikling afhængig af hvor mange kapsler der er givet før prøvetagning. med bedste fitted line
Fig. 11: MMP-9 konc. udvikling afhængig af hvor mange kapsler der er givet før prøvetagning med bedste fitted line
Fig. 12: TIMP-1 konc. udvikling afhængig af hvor mange kapsler der er givet før prøvetagning med bedste fitted line
Fig. 13: Lineær regression på antal kapslers indflydelse på MMP og TIMP konc.
Lineær regress.
t-værdi P-værdi β1, (slope) β 0 (intercept)
MMP-2 -2,14 0,0463 -0,4374841 2,723459
MMP-8 2,01 0,0593 1,361994 2,180967
MMP-9 2,25 0,0372 1,3759 1,294
TIMP-1 -1,51 0,1476 -0,486 4,336
Distale Nappeprøver
MMP-2 MMP-8 MMP-9 TIMP-1
HSP (n=16) 0,98 (-0,2-2,2) 25 (12-39) 19 (8,5-30) 1,9 (0,7-3,0)
Misoprostol (n=12) 0,81 (0,44-1,6) 35 (14-56) 28 (5,4-52) ND
t-test 0,73 0,71 0,82 -
Fig. 14: HSP vs. Misoprostol behandling ved grav prolong. Prøve fra distal CMP før igangsætning af fødslen.
visualiseredes Misoprostol-gruppens koncentrationer af MMP-8 og MMP-9.
Denne inddeling gjorde det synligt
at med en koncentrationsgrænse
på 23 ng/mg CMP for både
MMP-8 og -9 var det muligt at se
at de der havde koncentrationer
over 23 ng/mg CMP gik i fødsel
efter max 1 døgn og de der har
MMP koncentrationer under tog
mere end 1 dag om at gå i fødsel.
MMP-8 har to outliers, ,mens
MMP-9 følger cut-off grænsen.
(Fig. 15)
Grupperingen er testet for baggrundsvariablen Paritet: alle 6 resp var fleregangsfødende. 2 af 4 non-
resp var fleregangsfødende. Forskellen er ikke stat. sign. (p= 0,083)
Testes gestationsalder er der stat. sign. forskel på de to grupper (p=0,0013), hvor resp-gruppen har
højere gest. alder.
Resp, non-resp
grupperne er som
udgangspunkt ikke
stat. sign forskellige.
(fig. 5+7), men
ekskluderes en
prøve, der har 0 i
alle parametre ændres det til stat. sign.
forskel på MMP-2 (p=0,01), -8 (p=0,04)
og -9 (p=0,005), hvor resp har højere
konc. end non-resp. (fig 6+8)
9
Fig. 15: Inddeles MMP-8 og -9 koncentrationerne i misoprostolgruppen, distale prøver efter hvor mange dage der går før de går i fødsel, kan en
Fig. 7: MMP-2, -8, .9 og TIMP-1 koncentrationer analyseret med t-test for Cytotec-gruppen, distale CMP.
MMP-2 MMP-8 MMP-9 TIMP-1 Parity = 0 Parity ≥ 1
Responders n = 6 1,6 (0,19-3) 52 (13-91) 52 (11-93) ND 23 % 77 %
Non-responders n = 4
ND 23 (-7,2-53) 7 (-8,1-22) ND 34 % 66 %
t-test 0,04 0,8 0,32 - 0,083
MMP-2 MMP-8 MMP-9 TIMP-1
Responders n = 5
1,9 (0,38-3,4) 62 (25-99) 62 (21-103) ND
Non-responders n = 4
ND 23 (-7,2-53) 7 (-8,1-22) ND
t-test 0,010 0,036 0,0051 -
Fig 8 : MMP-2, -8, -9 og TIMP-1 koncentrationer analyseret for stat. sign. forskel mellem resp og non-resp for misoprostolgruppen, distal nappeprøve. ex pr 13.
DiskussionCMP der er blevet primet af prostaglandin har højere konc. af MMP-8 og -9 og mindre MMP-2 (kit
måler ikke aktiv MMP-2. dvs en evt omdannelse til aktiv MMP-2 vil give et lavere resultat. )
CMP er kan altså påvirkes af, ikke mindst antallet af kapsler, men også over hvor lang tid de bliver
givet over. De der kommer til igangsætning og har brug for prostaglandin E priming har alle
udetekterbar TIMP-1.
Alle der fik foretaget HSP gik i fødsel inden for 24 timer.
Ved at kigge på MMP-8 og -9 konc. i distale CMP kunne det visualiseres at det var muligt at
inddele kvinder der kommer til igangsætning i resp og non-resp. Tal der dog først blev stat. sign.
efter ekskludering af Prøve med 0 værdier i alle parametre. Der er forskel i Gestationsalderen, men
set i lyset af, at kvinderne udvælges helt korrekt af jordmødrene og der kan vises en stat. sign
forskel på kvinders MMP-2, -8 og -9 konc. afhængig af om de reagerer på prostaglandin E
behandlingen har det ikke betydning for denne problemstilling.
-
a. hovedfund: max 5 sætninger
b. styrker og svagheder
for få prøver.
c. tolkning
d. litteratur (Gunvor, evt. flere. Ikke gentagelse af baggrund)
e. klinisk implikation
2. diskussion
- Der er fysiologisk forskel på hsp og miso gruppen, men det kan ikke måles på MMP ved distale cmp.
- selvom der er forskel mht gestationsalder, så er der ingen forskel på hsp og misogruppen v t=0, så det
er ikke noget der spiller nogen rolle for min hypotese?. Der er forskel i Gestationsalderen, men set i
lyset at kvinderne udvælges helt korrekt af jordmødrene og der kan vises en stat. sign forskel
på kvinders MMP-2, -8 og -9 konc. afhængig af om de reagerer på prostaglandin E
behandlingen har det ikke betydning for denne problemstilling.-
10
- siden MMP-2 ikke stiger i hinderne, men i cervix, kan de formentlig være forhindret adgang! Ingen
stimulation? US nærmere. (mine tal viser faldende mmp-2) (Morgan R Peltier) (sterisk?????) (måler ikke
aktiv MMP-2!!!!!)
-MMP-9 stiger efter uge 37, men siger ikke noget prædiktivt om fødselsudfald. Dvs. ligesom mine prøver
er det MMP-8 der er stærkest. (Suk-Joo Choi)
- et studie viser at MMP-2 produceres hovedsagligt i stromale, cervikale fibroblaster. (dvs diffunderer,
mens MMP-9 produceres af leukocytter, der jo under IL-8 aktivering diffunderer ud i CMP [11]
- Najas 3. artikel viste ikke forøget MMP-8 og -9 men nedsat TIMP.
- Der er sandsynligvis ikke nogen proteolytisk effekt af MMP’er i CMP, men kan resulterer i præterm
fødsel. Desuden er det et udemærket billede af hvad der sker i det omkringliggende væv. [12] (gode
billeder) MMP-2,-8 og -9 og Timp1 er påvist i CMP [13]
- Der er påvist nedsat leukocytinflux i cervix hos Non-respondere. og dermed også nedsat IL-8 og
MMP-9.
- prostaglandin forøger vasopermeailitet og øger inflam celle influc som neutrofil og makrogager i cervix
under 1 trimester. Neutrofiler afgiver mmp der nedbryder vaskulær basalmembraner der øger leukocyt
akkumulation, specielt neutrofiler, monocytter og mastceller . nedbrudt vasalmembran frigiver IL-8 der
yderligerer forstærker kaskaden. [14]
- Selvom der er MMP, er det pga MMP/TIMP ratio ikke sikkert der er katalytisk aktivitet , men tallene
viser ikke desto mindre at der sandsynligvis er en prediktiv værdi af at måle MMP-8 i distal cmp.
- Dehydrering under prøvetagning og processering mulig fejlkilde. [9]
- PGE påvirker MMP direkte eller øger neut influx, derfor ses der kun MMP-8 og -9 reaktion...
Bibliografi1.! Mackenzie, I.Z., Induction of labour at the start of the new millennium.
Reproduction, 2006. 131(6): p. 989-98.2.! Peltier, M.R., Immunology of term and preterm labor. Reprod Biol Endocrinol, 2003.
1: p. 122.3.! Hulboy, D.L., L.A. Rudolph, and L.M. Matrisian, Matrix metalloproteinases as
mediators of reproductive function. Mol Hum Reprod, 1997. 3(1): p. 27-45.4.! Sennstrom, M.B., et al., Matrix metalloproteinase-8 correlates with the cervical
ripening process in humans. Acta Obstet Gynecol Scand, 2003. 82(10): p. 904-11.
11
5.! Xu, P., N. Alfaidy, and J.R. Challis, Expression of matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 in human placenta and fetal membranes in relation to preterm and term labor. J Clin Endocrinol Metab, 2002. 87(3): p. 1353-61.
6.! Fortunato, S.J., R. Menon, and S.J. Lombardi, Collagenolytic enzymes (gelatinases) and their inhibitors in human amniochorionic membrane. Am J Obstet Gynecol, 1997. 177(4): p. 731-41.
7.! Sahlin, L., et al., Impaired leukocyte influx in cervix of postterm women not responding to prostaglandin priming. Reprod Biol Endocrinol, 2008. 6: p. 36.
8.! Uldbjerg, N., U. Ulmsten, and G. Ekman, The ripening of the human uterine cervix in terms of connective tissue biochemistry. Clin Obstet Gynecol, 1983. 26(1): p. 14-26.
9.! Becher, N., et al., The cervical mucus plug: structured review of the literature. Acta Obstet Gynecol Scand, 2009. 88(5): p. 502-13.
10.! Becher, N., et al., Matrix metalloproteinases in the cervical mucus plug in relation to gestational age, plug compartment, and preterm labor. Reprod Biol Endocrinol, 2010. 8: p. 113.
11.! Stygar, D., et al., Increased level of matrix metalloproteinases 2 and 9 in the ripening process of the human cervix. Biol Reprod, 2002. 67(3): p. 889-94.
12.! Becher, N., et al., Balance between matrix metalloproteinases (MMP) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP) in the cervical mucus plug estimated by determination of free non-complexed TIMP. Reprod Biol Endocrinol, 2008. 6: p. 45.
13.! Becher, N., et al., Matrix metalloproteinases and their inhibitors in the cervical mucus plug at term of pregnancy. Am J Obstet Gynecol, 2004. 191(4): p. 1232-9.
14.! Aronsson, A., et al., The effect of orally and vaginally administered misoprostol on inflammatory mediators and cervical ripening during early pregnancy. Contraception, 2005. 72(1): p. 33-9.
12