Nuovi sviluppi della citogenetica medica in pediatria
Prof. Graziano Pescia
APSI Lugano, 5 dicembre 2002
5 dicembre 2002
.5 dicembre 2002
PrologoGenomaGenoma e e cromosomicromosomi
Le anomalie citogenetichecostituzionalitipi, origine
e meccanismi
24 molecole
6pg d ’ADN ⇒170 cm
3 Miliardi di pb
46 Mila geni 97%3% Junk DNA (robaccia)15% ripetitivo
L’ADN : 23 chromosomi, 31’400 geni loc, 3 ’000 Mb
8,07,8
6,56,2
5,95,6
5,24,7
4,4 4,4 4,4 4,4
3,5 3,3 3,23,0 2,8
2,6
2,0 2,2
1,5 1,7
5,0
1,8
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
3 ’000
1 ’500
No di geni/cromosoma% ADN/cromosoma (HHG)
5 dicembre 2002
Anomalie citogeneticheN = 9 ’060
Aneuploidie
TrisomieMonosomie
Mosaico
TraslocazioniInversioni
Duplicazioni (Micro)
Delezioni (Micro)
Telomeriche
Numeriche StrutturaliFunzionali
UPDImprinting
Del-Dup-UPD-Siti fragili N = 2 ’336
Origine delle Anomalie Citogenetiche (%)
Errori mitotici (Mosaico, UPD) 3
Totale 100
TotaleErrori 8 (Meiosi I>II) 89 97meiotici
5 dicembre 2002
MI Non-disgiunzione
Non-disgiunzione
∅
MII
∅
∅ ∅
LA MEIOSI (>95%)
Mosaico
1
↓
3
↓
5
↓
7
1/2
3/4
15/16
31/32
63/64
0.20.40.60.81
% di cellule trisomiche
Zigote Trisomico
Anaphase lag
2 3
↓3↓↓3
Disomia uniparentale = UPD
0.20.40.60.81
1
↓
3
↓
5
↓
7
% di cellule trisomiche
Trisomia
Rescue
Disomia uniparentale paterna
P M
P
M MP
P
P
P
P
P
P
P
L ’imprinting (meiosi)
Metilazione della citosina → inattivazione del gene
CH
3
CH
3
CH
3
La noda
!
S
M
G1G2
CDK
Cyclines
⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐⏐
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⊗⊗
⊗
MITOSI⊗ Check point 1
Ok dimensioni cellulaOk integrità ADN
⊗ Check point 2Ok replicazione ADNOk dimensioni cellula
Correttura errori
⊗ Check point 3Centromeri-Fuso
5 dicembre 2002
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5 dicembre 2002
!Errori
Replicazioneanomalie strutturali
Ripartizioneanomalie numeriche
MalformazioniTumori
⊗ Check point 3Centromeri-Fuso
⊗ Check point 2Correttura errori rep
.5 dicembre 2002
Atto primoDelittoDelitto e e castigocastigo
Conseguenzefeto-placenta-neonatoneonato
Dati epidemiologici :gameti, zigoti e via dicendo
Conseguenze pediatriche degli squilibri costituzionali
Malformazioni
Dismorfismo
RCIU
5 dicembre 2002
Handicapmentale
Mortalità
Morbidità
Malformazioni congenite
Deaths in full-term neonates 48%
Pediatric intensive care admissions 39%
Pediatric hospital admissions 21%
Am J Hum Gent, 63, 1153, 1998
5 dicembre 2002
Handicap mentale : 2-3% di cui∼ 15% con anomalia cromosomica >3-4 Mb
Delezionitelomeriche
Delezioniinterstiziali
+∼ 10% <3-4 Mb
5 dicembre 2002
Totale ∼ 25%
Frequenzadelle anomalie cromosomiche
Ovociti25%
Spermatozoi2%
Zigoti >30%Aborti spontanei >50%
Neonati <0.3%
handicappate25%
Coppie sterili5-10%
Persone
20000
60000
100000
140000124 ’000
CONCEPIMENTI
28 ’000
50 ’000ABORTI
27 ’600
74 ’000NASCITE
400 cromosomi
2001 L ’Odyssea della specieCH : 74 ’000 nascite
←− 40 ← ←− 20 ← ← 0 ←
5 dicembre 2002
AneuploidieTrisomie Monosomie
1a78910111213141516171819202122XY
89
13
18
21XY
XY
Rilevanza
pediatrica
Embrione
feto
.5 dicembre 2002
Atto secondo
Le Le novitnovitàà
FISH & Chipse pot pourri …
Metodologia
Génétique médicale
Cariotipo con bandeggio G(500 bande) : 47,XY, Trisomia 21 liberaRisoluzione ∼ 3-4 MbCorrispondente a ∼ 20 geni
Le novità in citogenetica umana
CGHFISH
SKY5 dicembre 2002
La legge di complementarità
5 dicembre 2002
C-GLegami idrogeno
Legami covalenti
A-T
A
G
C
T
T
G
C
T
A
A
A-TT-A
G-C
G-C
T-A
A-T
C-G
G-C
T-A
A-T
C-G
G-C
T-A
T-A
A-TT-A
G-C
G-C
T-A
A-T
C-G
G-C
T-A
A-T
C-G
G-C
T-A
T-A
Principio della FISH
1. Denaturazione termica In Situ
A T G T G A
T A C A C
TA
CA
CT
A T G T G A A
A T G T G* * * * *
A T G T G* * * * *
A T G T G* * * * *
A T G T G* * * * *
2. Ibridazione
3. Osservazione con FluorescenzaSonde
Trisomia 21 Mosaico
Cancro vescicaSperma
HER-2
Cancro al seno
FISH interfasica
Tipi di FISH metaphasica
Centromero Telomeri
Locus Painting
5 dicembre 2002
Varietà di FISH metafasica
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18
19 20 21 22 X Y
Telomerica
Painting
Locus
5 12 2002
Cariotipo spettrale24 colori
SKY
Comparative Genomic Hybridization
Ibridazione con ADN del paziente solo
Ibridazione con ADN normale solo
Miscugliopaziente + normale
MetafasiNormale
.5 dicembre 2002
Atto terzoSindromiSindromi dada
MicrodelezioniSRSSMSDGS
« Nuove » anomalie cromosomiche
Strutturaliµdel interstiziali µdel telomeriche
Funzionali : UPD5 dicembre 2002
Sindrome di Williams (1962), OMIM #194050
»Facies d'elfo »Cardiopatia congenita (SASV)Ritardo mentale/psicomotorio (QI 55-60)Sensibilità rumori, musicaGrande sociabilità
> 99% des casi : delezione 7q11Frequenza : 1/15 ’000Rischio : 50% (figli, Am J Med Genet 1993 47,468-70),
1% (fratelli-sorelle)5 dicembre 2002
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18
19 20 21 22 X Y
FISH metafasica (delezione 7q11)
5 dicembre 2002
Sindrome di Smith-Magenis (1962), OMIM # 182290
Dismorfia non specificaMani corte/brachidattiliaRitardo mentale/psicomotorio (QI 55-60)Fenotipo comportamentale (polyembolokoïamanie)Disturbi del sonno
> 99% des casi : delezione 17p11.2
Frequenza : 1/25 ’0005 dicembre 2002
Sindrome di Smith Magenis
Génétique médicale
delezione 17p11.2
5 dicembre 2002
Sindrome di DiGeorge (1968), OMIM #188400Shprintzen, Velo-Cardio-Facciale, CATCH 22
Cardiopatia congenita (80%)Disturbi del linguaggioImmunodeficienza (80%)Ipocalcemia (16-60)Dismorfia (eterogeneità +++)Psicosi
> 99% des casi : delezione 22q11.2Frequenza : 1/3 ’000
FISH locus-specifica (delezione 22q11)Génétique médicale
22q11 deleta
22q11 normale
MicrodelezioniInterstiziali Subtelomeriche
7 Williams8 Trico Rino Falangeale
11 Beckwith
13 Retinoblastoma
15 PWA S16 Rubinstein Taybi17 Miller Dicker
20 Alagille
22 DiGeorge
124679111213141516202122
124679111213141516202122
1 1p36
14 q32.3
.5 dicembre 2002
Atto quarto
Tradimento a Mendel
DisomiaDisomia uniparentaleuniparentaleImprintingImprinting
SRS, PWAS
Anomalie cromosomiche funzionaliUPD : Fenotipo
Mosaico Imprinting
Eccezioni alle leggi di Mendel
Placenta± Feto
MaternoPaterno
5 dicembre 2002
Sindrome di Russel-Silver (1954), OMIM # 180860
DismorfiaFaccia triangolareBassa statura/nanismoAsimmetria corporea/emitrofiaRitardo della crescita intrauterinaEtà ossea ritardataClinodattilia del quinto dito
< 10% des casi : UPD7matFrequenza : > 150 casi pubblicati
5 dicembre 2002
"La Monstrua" vestida "La Monstrua" desnuda
CARREÑO DE MIRANDA, Juan (1614-1685) Eugenia Martínez Vallejo
Sindrome di Prader Willi (1956), OMIM #176270
Ipotonia ++/DismorfiaRitardo psicomotorio /mentaleObesità generalizzataMani e piedi piccoliPubertà ritardata/IpogonadismoFrequenza : 1/10 000
Delezione PAT 15q11-q13 pat >70%UPDmat 25%Anomalie dell ’imprinting 5%
Sindrome di Angelman (1965), OMIM #105830
IpotoniaMicrocefaliaEEG anomalo - Convulsioni epilessiaRitardo mentale graveAssenza del linguaggio
Delezione MAT 15q11-q13 mat > 70% UPDpat 5% Anomalie imprinting 10% UBE3A
Frequenza : 1/12 000
t
t
A
t PW24 PW
5 dicembre 2002
Lancet, II/1991, 638
PWS
AS
PWS
AS
PWS
AS
PWS
AS
L ’imprinting
La noda La noda
Delezione paternaPWS
AS
PWS
AS
PWS
AS
PWS
AS
PW
PWS
AS
PWS
AS
PWS
AS
Delezione maternaPWS
AS
SA
Trisomia 15 d ’origine materna
UPDmat Prader Willi Normale
Rescue
Trisomia 15 d ’origine paterna
Rescue
UPDpat Angelmann Normal
UPDPaterna Materna
Fenotipo
6 Transient Neonatal DM
11 BWS
14 RCIU non spec.
15 PWS
124679111213141516202122
124679111213141516202122
Silvr Russel S 7
RCIU non spec 14
AS 15
RCIU Non-spec 16
.
Oltre al quadro clinico e alle analisi genetiche la diagnosi delle Sindromi da UPD può richiedere la dimostrazione formale del contributo genetico di unosolo genitore.
Epilogo
Novità: Zusammenfassung
Tecniche Cliniche
Ibridazioni molecolari
FISH, SKY, CGH
« Nuove » sindromi
µDel, UPD, Impronta
ELSI
Il trionfo dei geni
Cariotipo ?
5 dicembre 2002
Dismorfia sola
Dismorfia+RM
SI
NO
.
J ’espère que vous me saurez gré non tant pour les choses que je vous ai dites, mais plutôt pour celles que j ’ai volontairement omises afin de vous laisser le plaisir de les découvrir ou, mieux, de les inventer vous-mêmes.
René Descartes
Fine
galacidalacidesoxyribonucleicacid
GrazieMerci
Anomalie Citogenetiche Costituzionali
TOTALE ANOMALIE 9060
DELEZIONI DUPLICAZIONI 2077
UPD SITI FRAGILI 259
5 dicembre 2002
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
DS Borgaonkar, 8th Ed, 1997
Normale Traslocazione Pachitene
PWS
5 dicembre 2002
« Le dernier cri » : la CGH
ADN normaleADN paziente
MetafasiNormale
Rosso vincenteTrisomia
Verde vincenteMonosomia
Anomalie Citogenetiche Costituzionali
UPD SITI FRAGILI 259
DELEZIONI DUPLICAZIONI 2077
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
TOTALE ANOMALIE 9060
INVERSIONI TRASLOCAZIONI 5403
5 dicembre 2002DS Borgaonkar, 8th Ed, 1997
FŒTUS →Mitosi NASCITA PUBERTA → →
Mitosi
Inizio Meiosi
Stop Meiosi
Ripresa Meiosi
Inizio Meiosi
Folliculi
GP2
Fine Meiosi
Stop Mitosi
T(9;11)
Sindrome di Beckwith-Wiedemann (1954),OMIM # 130650
OnfaloceleMacroglossiaGigantismoOrganomegaliaTumori embrionaliIpoglicemeia neonatale< 20% des casi : patUPD11
Frequenza : > 1/10 ’0005 dicembre 2002
DiagnosiSindrome di Beckwith-Wiedemann
Génétique médicale
patUPD11
5 dicembre 2002
Pachitene
PWS DelPWS
5 dicembre 2002
Zygote Trisomique
Non-disjonction
Zygote Disomique
Anaphase lag
2 3
Mosaïcisme : 2 mécanismes3%
3
↓3↓3↓3
↓2↓2↓2 1
LA MITOSE
L’ADN frammentato : % genoma aploide/cromosoma
30 Mb et 31’400 geniNo di geni per cromosoma
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
24 molecole
6pg d ’ADN ⇒170 cm
3 Miliardi di pb
46 Mila geni 97%3% Junk DNA (robaccia)15% ripetitivo
Anomalie citogeneticheN = 9 ’060
Aneuploidie
TrisomieMonosomie
Mosaico
TraslocazioniInversioni
Duplicazioni (Micro)
Delezioni (Micro)
Telomeriche
Numeriche StrutturaliFunzionali
UPDImprinting
Del-Dup-UPD-Siti fragili N = 2 ’336
Origine delle Anomalie Citogenetiche (%)
Errori mitotici (Mosaico, UPD) 3
Totale 100
TotaleErrori 8 (Meiosi I>II) 89 97meiotici
5 dicembre 2002
L ’imprinting (meiosi)
Metilazione della citosina → inattivazione del gene
CH
3
CH
3
CH
3
La noda
!
S
M
G1G2
CDK
Cyclines
⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐⏐
⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐ ⏐⏐
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MITOSI⊗ Check point 1
Ok dimensioni cellulaOk integrità ADN
⊗ Check point 2Ok replicazione ADNOk dimensioni cellula
Correttura errori
⊗ Check point 3Centromeri-Fuso
5 dicembre 2002
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5 dicembre 2002
!Errori
Replicazioneanomalie strutturali
Ripartizioneanomalie numeriche
MalformazioniTumori
⊗ Check point 3Centromeri-Fuso
⊗ Check point 2Correttura errori rep
Conseguenze pediatriche degli squilibri costituzionali
Malformazioni
Dismorfismo
RCIU
5 dicembre 2002
Handicapmentale
Mortalità
Morbidità
Malformazioni congenite
Deaths in full-term neonates 48%
Pediatric intensive care admissions 39%
Pediatric hospital admissions 21%
Am J Hum Gent, 63, 1153, 1998
5 dicembre 2002
Handicap mentale : 2-3% di cui∼ 15% con anomalia cromosomica >3-4 Mb
Delezionitelomeriche
Delezioniinterstiziali
+∼ 10% <3-4 Mb
5 dicembre 2002
Totale ∼ 25%
Frequenzadelle anomalie cromosomiche
Ovociti25%
Spermatozoi2%
Zigoti >30%Aborti spontanei >50%
Neonati <0.3%
handicappate25%
Coppie sterili5-10%
Persone
20000
60000
100000
140000124 ’000
CONCEPIMENTI
28 ’000
50 ’000ABORTI
27 ’600
74 ’000NASCITE
400 cromosomi
2001 L ’Odyssea della specieCH : 74 ’000 nascite
←− 40 ← ←− 20 ← ← 0 ←
5 dicembre 2002
AneuploidieTrisomie Monosomie
1a78910111213141516171819202122XY
89
13
18
21XY
XY
Rilevanza
pediatrica
Embrione
feto
Le novità in citogenetica umana
CGHFISH
SKY5 dicembre 2002
La legge di complementarità
5 dicembre 2002
C-GLegami idrogeno
Legami covalenti
A-T
A
G
C
T
T
G
C
T
A
A
A-TT-A
G-C
G-C
T-A
A-T
C-G
G-C
T-A
A-T
C-G
G-C
T-A
T-A
A-TT-A
G-C
G-C
T-A
A-T
C-G
G-C
T-A
A-T
C-G
G-C
T-A
T-A
Trisomia 21 Mosaico
Cancro vescicaSperma
HER-2
Cancro al seno
FISH interfasica
Cariotipo spettrale24 colori
SKY
Comparative Genomic Hybridization
Ibridazione con ADN del paziente solo
Ibridazione con ADN normale solo
Miscugliopaziente + normale
MetafasiNormale
.5 dicembre 2002
Atto terzoSindromiSindromi dada
MicrodelezioniSRSSMSDGS
« Nuove » anomalie cromosomiche
Strutturaliµdel interstiziali µdel telomeriche
Funzionali : UPD5 dicembre 2002
MicrodelezioniInterstiziali Subtelomeriche
7 Williams8 Trico Rino Falangeale
11 Beckwith
13 Retinoblastoma
15 PWA S16 Rubinstein Taybi17 Miller Dicker
20 Alagille
22 DiGeorge
124679111213141516202122
124679111213141516202122
1 1p36
14 q32.3
.5 dicembre 2002
Atto quarto
Tradimento a Mendel
DisomiaDisomia uniparentaleuniparentaleImprintingImprinting
SRS, PWAS
UPDPaterna Materna
Fenotipo
6 Transient Neonatal DM
11 BWS
14 RCIU non spec.
15 PWS
124679111213141516202122
124679111213141516202122
Silvr Russel S 7
RCIU non spec 14
AS 15
RCIU Non-spec 16
Novità: Zusammenfassung
Tecniche Cliniche
Ibridazioni molecolari
FISH, SKY, CGH
« Nuove » sindromi
µDel, UPD, Impronta
ELSI
.
J ’espère que vous me saurez gré non tant pour les choses que je vous ai dites, mais plutôt pour celles que j ’ai volontairement omises afin de vous laisser le plaisir de les découvrir ou, mieux, de les inventer vous-mêmes.
René Descartes
Fine
galacidalacidesoxyribonucleicacid
GrazieMerci