François MeurensAspirant FNRS
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Vétérinaires
2003/2004
Influence du délai de surinfection et de la Influence du délai de surinfection et de la parenté génétique sur la recombinaison de parenté génétique sur la recombinaison de
l’herpèsvirus bovin 1l’herpèsvirus bovin 1
Influence of superinfection delay and genetic relatedness on bovine herpesvirus 1 recombination
UNIVERSITE DE LIEGEFACULTE DE MEDECINE VETERINAIRE
Département des Maladies Infectieuses et ParasitairesVirologie, Pathologie des maladies virales et Epidémiologie
PLAN
IntroductionIntroductionAnn. Méd. Vét., 2001, 145, 108-119Virologie, 2003, 7, 319-328
Etude 1 :Etude 1 : « Superinfection prevents recombination of the
alphaherpesvirus bovine herpesvirus 1 »J. Virol. 2004, 78, 3872-3879
Etude 2 :Etude 2 : « Interspecific recombination between two
ruminant alphaherpesviruses, bovine herpesviruses 1 and 5 » J. Virol., 2004, 78, 9828-9836
Etude 3 :Etude 3 : « Mixed DNA concatemers reveal recombination
between alphaherpesviruses originating from different animal species »
Manuscrit en préparationConclusions générales et perspectivesConclusions générales et perspectives
ObjectifObjectif
INTRODUCTIONINTRODUCTION
10)10) Recombinaison Recombinaison
11)11) Recombinaison et alphaherpèsvirusRecombinaison et alphaherpèsvirus
12)12) Facteurs influençant la recombinaisonFacteurs influençant la recombinaison
1)1) La rhinotrachéite infectieuse bovineLa rhinotrachéite infectieuse bovine
2)2) EnjeuxEnjeux
3)3) L’herpèsvirus bovin 1L’herpèsvirus bovin 1
4)4) Classification sur la base des propriétés biologiquesClassification sur la base des propriétés biologiques
5)5) Classification sur la base de l’organisation génomiqueClassification sur la base de l’organisation génomique
6)6) Les glycoprotéines d’enveloppeLes glycoprotéines d’enveloppe
7)7) Cycle viralCycle viral
8)8) Les sous-types de BoHV-1Les sous-types de BoHV-1
9)9) Alphaherpèsvirus apparentés au BoHV-1Alphaherpèsvirus apparentés au BoHV-1
13)13) Interférence Interférence
14)14) Vaccination Vaccination
INTRODUCTIONINTRODUCTION
Première description remonte au début des années 50 aux USA
(Schroeder et Moys, 1954 ; Mc Kercher et al., 1954)
Première description en 1841 par Büchner
1) La rhinotrachéite infectieuse bovine1) La rhinotrachéite infectieuse bovine
Rhinotrachéite infectieuse bovine (IBR)(IBR)
Vulvovaginite infectieuse pustuleuse (IPV)(IPV)
« Bläschenausschlag » (Tromsdorf, 1894)
INTRODUCTIONINTRODUCTION
Limbourg et al., 2002, Boelaert et al., 2000
2) Enjeux2) Enjeux
Séroprévalence de troupeau en Belgique
Conséquences cliniques et restrictions dans le commerce du bétail, des embryons et de la semence
Ils peuvent en conséquence interdire l’importation d’animaux ou de certains produits d’origine animale en provenance des autres pays
européens
IndemnesIndemnes
66,7 %66,7 %
FINFIN
SWESWE
CHECHE
AUTAUT
DNKDNK
BolzanoBolzano
3) L’herpèsvirus bovin 1 3) L’herpèsvirus bovin 1
(BoHV-1)(BoHV-1)
Morphologie des herpèsvirusMorphologie des herpèsvirus
Capside + ADN Tégument
Glycoprotéines
Enveloppe
INTRODUCTIONINTRODUCTION
INTRODUCTIONINTRODUCTION
3 sous-familles
AlphaherpesvirinaeAlphaherpesvirinae
Betaherpesvirinae
Gammaherpesvirinae
4 genres
Simplexvirus
Varicellovirus Varicellovirus :: herpèsvirus bovin 1herpèsvirus bovin 1
Mardivirus
Iltovirus
4) Classification sur la base des propriétés 4) Classification sur la base des propriétés biologiquesbiologiques
MMuHV-1uHV-1
Groupe Ex.
LTRLTR RTRRTR
R4R4 R3R3 R2R2 R1R1
UULLIIRR TTRRUUSS
Isomères
11
11
11
22
aann bb b’b’a’a’nncc’’ cc aaUULL44
11
DD
EE
FF
HHV-6HHV-6
BBooHV-4HV-4
HHV-4HHV-4
BBooHV‑1HV‑1
HHHV-1HV-1
AA
BB
CC
UUss
INTRODUCTIONINTRODUCTION
5) Classification sur la base de l’organisation 5) Classification sur la base de l’organisation génomiquegénomique
αα
6) Les glycoprotéines d’enveloppe6) Les glycoprotéines d’enveloppe
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 kb
gK gC gB gH gM gL
UL US
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
gG gD gI gE
IR TR
AttachementLiaison à C3b
Attachement/PénétrationPassage de cellule à cellule
InterférenceApoptose
Passage de cellule à celluleNeuroinvasion
MaturationImmunoévasion
INTRODUCTIONINTRODUCTION
1) Attachement1) Attachement
11
2) Pénétration2) Pénétration
22
3) Réplication3) Réplication
33
4) Clivage4) Clivage
5) Encapsidation5) Encapsidation
44
55
6) Maturation6) Maturation
7) Sortie7) Sortie66
77 HSV-1
OH 3'
P 5'
Clivage d'un des brins d'ADN
ADN viral circularisé
3'
5'
Point de croissance
Brin déplacé
3'
Synthèse du brin complémentaire
3'
5'
Cercles roulants
Concatémères
7) Cycle viral7) Cycle viral
α
β
γ
66
INTRODUCTIONINTRODUCTION
BoHV-1BoHV-1
BoHV-1.2BoHV-1.2BoHV-1.1BoHV-1.1
Profil de restrictionProfil de restriction
Acs monoclonauxAcs monoclonaux
8) Les sous-types de BoHV-18) Les sous-types de BoHV-1
9) Alphaherpèsvirus apparentés au BoHV-19) Alphaherpèsvirus apparentés au BoHV-1
L’herpèsvirus bovin 5 (BoHV-5L’herpèsvirus bovin 5 (BoHV-5, ex BoHV-1.3) méningo-encéphalite chez le bovin
L’herpèsvirus des cervidés 1L’herpèsvirus des cervidés 1 (CvHV-1(CvHV-1, ex CerHV-1) kérato-conjonctivite chez le cerf
L’herpèsvirus des cervidés 2L’herpèsvirus des cervidés 2 (CvHV-2(CvHV-2, ex RanHV-1) asymptomatique chez le renne
L’herpèsvirus caprin 1 (CpHV-1L’herpèsvirus caprin 1 (CpHV-1, ex CapHV-1) troubles génitaux chez la chèvre
INTRODUCTIONINTRODUCTION
INTRODUCTIONINTRODUCTION
Arbres phylogéniques (gB, gD). Arbres phylogéniques (gB, gD). L’arbre A a été généré selon la L’arbre A a été généré selon la méthode « neighbour joining », méthode « neighbour joining », l’arbre B selon la méthode de l’arbre B selon la méthode de
parcimonie (Ros et Belàk, 1999)parcimonie (Ros et Belàk, 1999)
9) Alphaherpèsvirus apparentés au BoHV-19) Alphaherpèsvirus apparentés au BoHV-1
CvHV-2 CvHV-1
BoHV-5
BoHV-1.2
BoHV-1.1
CpHV-1
PrV
BoHV-1.1
BoHV-1.2
BoHV-5
CvHV-1
CvHV-2
CpHV-1
PrV
INTRODUCTIONINTRODUCTION
Conséquences de l’infection du veau par des herpèsvirus apparentés au BoHV-1
Infection primaire
Réponse sérologique
Latence Réactivation et
réexcrétion
BoHV-5 OUI OUI OUI OUI
CpHV-1 OUI OUI OUI NON
CvHV-1 NON NON NON NON
CvHV-2 OUI OUI NON NON
Conséquences de l’infection de ruminants par le BoHV-1
Infection primaire
Réponse sérologique
Latence Réactivation et
réexcrétion
Chèvre OUI OUI OUI OUI
Cerf OUI NON NON NON
Renne OUI NON NON NON
Mouton OUI OUI OUI OUI
Thiry et al., 2002
9) Alphaherpèsvirus apparentés au BoHV-19) Alphaherpèsvirus apparentés au BoHV-1
INTRODUCTIONINTRODUCTION
10) La recombinaison
4 types
La recombinaison homologue
La recombinaison spécifique de site
La transposition
La recombinaison illégitime
La recombinaison, au sens génétique du terme consiste en la génération de nouvelles combinaisons de matériel génétique (Dressler et Potter, 1982 ; Bujarski, 1999 ; Umene, 1999)
Umene, 1999
INTRODUCTIONINTRODUCTION
4 types
La recombinaison homologueLa recombinaison homologue
La recombinaison spécifique de site
La transposition
La recombinaison illégitimeLa recombinaison illégitime
La recombinaison, au sens génétique du terme, consiste en la génération de nouvelles combinaisons de matériel génétique (Dressler et Potter, 1982 ; Bujarski, 1999 ; Umene, 1999)
Umene, 1999
HERPESVIRUSHERPESVIRUS
10) La recombinaison
INTRODUCTIONINTRODUCTION
XZ
ZX
1
2
3
4
5
6
7 8
9 10
X ZY
X ZY
X Z
X Z
X Z
Z X
X Z
X Z
*
*
*
*
MECANISME
1) Alignement
2) Clivage d’un brin de chaque duplex
3) Invasion
4) Scellement
5) Migration de jonction
6) Migration de jonction bis
7) Clivage
8) Clivage alternatif
9) Recombinant
10) Recombinant alternatif
10) La recombinaison
INTRODUCTIONINTRODUCTION
11) Recombinaison et alphaherpèsvirus
-Le virus de la maladie d’Aujeszky (PrV)(Dangler et al., 1994 ; Glazenburg et al., 1994 ; Henderson et al., 1990)
-Les herpèsvirus simplex 1 et 2 (HSV-1 et 2)(Brown et al., 1973 ; Halliburton et al., 1980 ; Umene, 1985 ; Javier et al., 1986 ; Preston et al., 1978)
-Le virus de la varicelle et le zona (VZV)(Dohner et al. 1988 ; Muir et al., 2002)
Identification de recombinants in vitro et in vivo
-L’herpèsvirus félin 1 (FeHV-1)(Fujita et al. 1998)
-Le BoHV-1-Le BoHV-1(Schynts et al., 2001, 2003)(Schynts et al., 2001, 2003)
Fréquence Fréquence
+/- 30 %+/- 30 %
BoHV-1BoHV-1
INTRODUCTIONINTRODUCTION
12) Facteurs influençant la fréquence 12) Facteurs influençant la fréquence de recombinaisonde recombinaison
Parenté génétique (Halliburton et al., 1977)
Dose de virus inoculé
Distance entre les sites d’inoculation
Séparation temporelle des infections (2 h)
Localisation des marqueurs de détectionIn vivo
(Glazenburg et al., 1994)
L’interférenceL’interférence
L’ensemble des mécanismes qui, suite à une infection virale, limitent et empêchent la multiplication d’un autre
virus au sein des cellules saines ou infectées
INTRODUCTIONINTRODUCTION
13) Interférence13) Interférence
Interférons
Incompatibilité entre virus hétérologues
Prévention de la surinfection
Particules défectives interférentes
Dominance des mutants
Interférence liée aux ARN
INTRODUCTIONINTRODUCTION
Récepteur primaire
Récepteur secondaire
gD sauvage gD mutante
HSV-1 sauvage
HSV-1 mutant
Cellule sauvage Cellule sauvageCellule exprimant gD Cellule exprimant gD et le récepteur secondaire
Présentation de la prévention de la surinfection due à la Présentation de la prévention de la surinfection due à la glycoprotéine D chez le virus herpès simplex 1 (adapté d’après glycoprotéine D chez le virus herpès simplex 1 (adapté d’après
Campadelli-Fiume et al., 2000Campadelli-Fiume et al., 2000))
PREVENTION DE LA SURINFECTION
INTRODUCTIONINTRODUCTION
14) Vaccination14) Vaccination
Plan de lutte en vigueur depuis le 1er septembre 1997 (arrêté royal du 30 août 1997)
vaccins marqués gE- permettant la différenciation des animaux infectés des animaux vaccinés
Vaccins « vivants »
1. vaccins atténués
- par délétion de gènes (gène gE)
2. vaccins vectorisés
- réplicatifs
- non réplicatifs
Vaccins inertes
1. vaccins inactivés délétés
2. vaccins sous unitaires
- glycoprotéines
3. ADN plasmidique
INTRODUCTIONINTRODUCTION
Cette étude intervient dans Cette étude intervient dans l’évaluation du risque de l’évaluation du risque de
recombinaison lié à l’utilisation de recombinaison lié à l’utilisation de vaccins « vivants »vaccins « vivants »
OBJECTIFOBJECTIF
Préciser l’influence de deux paramètres sur la génération
de virus recombinants
1) Le délai de surinfection1) Le délai de surinfection
2) La parenté génétique2) La parenté génétique
ObjectifsObjectifs
ObjectifsObjectifsEtude 1
Evaluer l’effet du délai entre infections sur la génération de virus recombinants
Etudes 2 et 3Evaluer les possibilités de recombinaison entre alphaherpèsvirus de ruminants
A l’issue du A l’issue du cycle viralcycle viral
22
Au niveau des Au niveau des intermédiaires de intermédiaires de
réplicationréplication
33
Avant et à l’issue Avant et à l’issue du cycle viraldu cycle viral
11
ETUDE 1ETUDE 1
La surinfection constitue un frein à la recombinaison de l’herpèsvirus bovin 1
Superinfection prevents recombination of the Superinfection prevents recombination of the alphaherpesvirus bovine herpesvirus 1 alphaherpesvirus bovine herpesvirus 1
F. Meurens, F. Schynts, G.M. Keil, B. Muylkens, A. Vanderplasschen, F. Meurens, F. Schynts, G.M. Keil, B. Muylkens, A. Vanderplasschen, P. Gallego, and E. ThiryP. Gallego, and E. Thiry
J. Virol. (2004) 78, 3872-3879J. Virol. (2004) 78, 3872-3879
TROIS APPROCHESTROIS APPROCHES
ELECTROPHORESE A CHAMP PULSEELECTROPHORESE A CHAMP PULSE
Etude 1Etude 1
IMMUNOFLUORESCENCEIMMUNOFLUORESCENCE
CYTOMETRIE EN FLUXCYTOMETRIE EN FLUX
1) Influence du délai de surinfection : 1) Influence du délai de surinfection : immunofluorescenceimmunofluorescence
Isolement et caractérisation des virus générésIsolement et caractérisation des virus générés
Suspension virale résultant des infections
Isolement des virus par repiquage
Réplication des isolats
Caractérisation des isolats par immunofluorescence
Etude 1Etude 1
MDBK
Lam gC-gE+ Lam gC+gE-
CoinfectionCoinfection&&
SurinfectionsSurinfections
Etude 1Etude 1
4 populations virales générées4 populations virales généréesgC-gE+, gC+gE-, gC-gE- (R), gC+gE+ (R) gC-gE+, gC+gE-, gC-gE- (R), gC+gE+ (R)
0 h 2 h 4 h 6 h 8 hI Lam gC-/Lam gE-II Lam gC- Lam gE-III Lam gC- Lam gE-IV Lam gC- Lam gE-V Lam gC- Lam gE-
0 h 2 h 4 h 6 h 8 hI Lam gE-/Lam gC-II Lam gE- Lam gC-III Lam gE- Lam gC-IV Lam gE- Lam gC-V Lam gE- Lam gC-
1) Influence du délai de surinfection : 1) Influence du délai de surinfection : immunofluorescenceimmunofluorescence
Etude 1Etude 1
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8
gC+gE+
gC-gE-Recombinants
gC-gE+
gC+gE-Parentaux
A B
Temps entre les infections BoHV-1 gC-gE+ et gC+gE- (h) Temps entre les infections BoHV-1 gC+gE- et gC-gE+ (h)
Po
urc
enta
ges
rel
atif
s d
es p
op
ula
tio
ns
vira
les
gén
érée
s
1) Influence du délai de surinfection : 1) Influence du délai de surinfection : immunofluorescenceimmunofluorescence
2) Influence du délai de surinfection : 2) Influence du délai de surinfection : cytométrie en fluxcytométrie en flux
Analyse des cellules par cytométrie en flux afin de déterminerAnalyse des cellules par cytométrie en flux afin de déterminer le niveau d’expression de la le niveau d’expression de la -gal-gal
Etude 1Etude 1
MDBK
IncubationIncubation
CoinfectionCoinfection&&
SurinfectionsSurinfections
ST STBG
gE-
-gal+
gE+
FL2 : fluorescence liée à gE
FL1 : fluorescence liée à -gal
ST 0/ STBG 0 hST 0/ STBG 0 h ST 0/ STBG 2 hST 0/ STBG 2 h
ST 0/ STBG 4 hST 0/ STBG 4 h
ST 0/ STBG 8 hST 0/ STBG 8 h
ST 0/ STBG 6 hST 0/ STBG 6 h
Etude 1Etude 12) Influence du délai de surinfection : 2) Influence du délai de surinfection :
cytométrie en fluxcytométrie en flux
Etude 1Etude 1
3) Influence du délai de surinfection : 3) Influence du délai de surinfection : électrophorèse à champ pulséélectrophorèse à champ pulsé
Analyse par électrophorèse à champ pulsé pour détecter la présence de Analyse par électrophorèse à champ pulsé pour détecter la présence de concatémères mixtes signalant des événements de recombinaisonconcatémères mixtes signalant des événements de recombinaison
CoinfectionCoinfection&&
SurinfectionsSurinfections
ST STBG
gE-
-gal+
MDBK
IncubationIncubation
Etude 1Etude 1
ST (135 301 pb)
BoHV-1 STBG est digéré par XbaI
BoHV-1 ST n’est pas digéré par XbaI 114 212 124 006
- 1714 pb (gE) = 122 292 pb
STBG (138 118 pb)
7488
611
102 918 114 212 126 842 138 118
XbaXbaII122 325 126 207122 325 126 207
2 Virus2 VirusLa coinfection produit des La coinfection produit des
concatémères mixtesconcatémères mixtes
gC
gD
gE
3) Influence du délai de surinfection : 3) Influence du délai de surinfection : électrophorèse à champ pulséélectrophorèse à champ pulsé
ß-gal
Etude 1Etude 1
IR TR
UL US
STST STBGSTBG
XbaIXbaI
XbaIXbaI XbaIXbaI XbaIXbaI
134 kpb409 kpb
XbaIXbaI
409 kpb
134 kpb
3) Influence du délai de surinfection : 3) Influence du délai de surinfection : électrophorèse à champ pulséélectrophorèse à champ pulsé
Concatémères mixtes
Etude 1Etude 1
XbaI XbaI XbaI XbaI
134 kbp271 kbp 409 kbp
ST STBG
XbaI
1 2 3 4 5 6 7 8 9
MW
10
MIX
kbp
50
100
150
200
271
409
134
ST/STBG
MIX 2 4 6 8
XbaI
kbp
271
134
A
B
C
271
409
134
19
ST STBG MIX 1X
MIXST STBG
ST STBG MIX
3) Influence du délai de surinfection : 3) Influence du délai de surinfection : électrophorèse à champ pulséélectrophorèse à champ pulsé
ConcatémèresConcatémères
MixtesMixtes
Etude 1Etude 1
CONCLUSIONS
Un intervalle de plus de 2 h entre les infections réduit Un intervalle de plus de 2 h entre les infections réduit drastiquement la génération de virus recombinantsdrastiquement la génération de virus recombinants
La recombinaison entre alphaherpèsvirus n’est possible La recombinaison entre alphaherpèsvirus n’est possible que dans un laps de temps restreintque dans un laps de temps restreint
Le choix des virus peut influencer l’établissement plus ou Le choix des virus peut influencer l’établissement plus ou moins rapide de la barrière à la surinfectionmoins rapide de la barrière à la surinfection
ETUDE 2ETUDE 2
Recombinaison interspécifique entre deux alphaherpèsvirus de ruminants,
les herpèsvirus bovins 1 & 5
Interspecific recombination between two ruminant Interspecific recombination between two ruminant alphaherpesviruses, bovine herpesviruses 1 & 5 alphaherpesviruses, bovine herpesviruses 1 & 5
F. Meurens, G.M. Keil, B. Muylkens, S. Gogev, F. Schynts, S. Negro, F. Meurens, G.M. Keil, B. Muylkens, S. Gogev, F. Schynts, S. Negro,
L. Wiggers, and E. ThiryL. Wiggers, and E. Thiry
J. Virol. (2004), 78, 9828-9836J. Virol. (2004), 78, 9828-9836
Etude 2Etude 2
Evaluation de la recombinaison entre le BoHV-1.2 mutant
&
Le BoHV-1.2Le BoHV-1.2
Le BoHV-1.1Le BoHV-1.1
Le BoHV-5Le BoHV-5
Le CvHV-2Le CvHV-2
Le CpHV-1Le CpHV-1
Tous ces virus peuvent potentiellement se rencontrer en conditions naturelles
ProtocoleProtocoleEtude 2Etude 2
a
b
c GFP cassetteGFP cassette
gC
10kbp
UL46
UL US
gE--gD gI 1kbp
RFP cassetteRFP cassette
-----
IR TR
BoHV-1.2/BoHV-1.2/gC-GFP-gC-GFP-gI-RFPgI-RFP
BoHV-1.2 mutantBoHV-1.2 mutant
Etude 2Etude 2
X
GFPGFP RFPRFP
BoHV-1.2
BoHV-1.1
BoHV-5
CvHV-2
CpHV-1
BoHV-1.2/DgC-GFP-DgI-RFP
ProtocoleProtocole
CoinfectionsCoinfections
GFP-/RFP-
GFP+GFP+/RFP+RFP+
Parentaux
GFP+/GFP+/RFP-
GFP-/RFP+/RFP+
RecombinantsRecombinants
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
BoHV-1.2/BoHV-1.1/BoHV-5/CvHV-2/CpHV-1/
BoHV-1.2 gC-GFP-gI-RFP
Pourcentages relatifs des populations virales générées
Situations de coinfection
GFP-/RFP+RFP+
GFP+GFP+/RFP-Recombinants
GFP-/RFP-
GFP+GFP+/RFP+RFP+Parentaux
Etude 2Etude 2Caractérisation des virus issus
des coinfections
2
Pas de recombinants avec :CvHV-2
CpHV-1
Etude 2Etude 2
Pourrait être dû à une trop grande Pourrait être dû à une trop grande désynchronisation des cycles viraux de ces virus désynchronisation des cycles viraux de ces virus
par rapport au BoHV-1par rapport au BoHV-1
1)1) Etablissement des cinétiques de pénétration et de multiplication virale des virus utilisés
2)2) Coinfections différées sur base des résultats obtenus de manière à favoriser l’émergence de recombinants avec le CvHV-2 et le CpHV-1
0
1020
3040
5060
70
8090
100110
120
0 30 60 90 120 150 180 210 240
% protectedtime (min)
CpHV-1
CvHV-2
BoHV-5
BoHV-1.1
BoHV-1.2
BoHV-1.2/gC-GFP-gI-RFP
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 3 6 9 12 15 18 21 24
time p.i. (h)titer (log10 pfu/ml)
Cinétique de pénétrationCinétique de pénétration Cinétique de multiplicationCinétique de multiplication
Etude 2Etude 2
CpHV-1
CvHV-2
BoHV-5
BoHV-1.1
BoHV-1.2
BoHV-1.2/gC-GFP-gI-RFP
BoHV-1.2 gC-GFP-gI-RFP < < CvHV-2CvHV-2
CpHV-1
BoHV-1.1
BoHV-5
BoHV-1.2
<CvHV-2
CpHV-1 <BoHV-5 BoHV-5 BoHV-1.1BoHV-1.1BoHV-1.2BoHV-1.2
BoHV-1.2 gC-GFP-gI-RFP
Etude 2Etude 2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Pourcentage relatif des populations virales générées
Situation de coinfection
CvHV-2/BoHV-1.2 gC-GFP-gI-RFP
GFP-/RFP-
GFP+GFP+/RFP+RFP+Parentaux
CvHV-2 >> BoHV-1.2 gC-GFP-gI-RFP
Introduction de délai entre l’infection par le BoHV-1.2 mutant et le CvHV-2
T0 T0 : BoHV-1.2 mutant: BoHV-1.2 mutant
T+2 hT+2 h : CvHV-2: CvHV-2
RecombinantsRecombinants
Avec le CpHV-1
Idem
Etude 2Etude 2
Caractérisation des recombinants BoHV-1/BoHV-5Caractérisation des recombinants BoHV-1/BoHV-5MarquageMarquage
Acs/Virus BoHV-1 BoHV-5 R1 R2BH35 + - - +1507 + - - -2F12 + - - -2915 - + - +1624 - + + -
Réactivité des différents anticorps monoclonaux contre le BoHV-1, le BoHV-5, et les 2 recombinants obtenus des coinfections
BoHV-1/BoHV-5
Ac BH35 gE du BoHV-1Ac 1507 gC du BoHV-1Ac 2F12 gI/gE du BoHV-1Ac 2915 gC du BoHV-5Ac 1624 BoHV-5
Etude 2Etude 2
Caractérisation des recombinants BoHV-1/BoHV-5Caractérisation des recombinants BoHV-1/BoHV-5Profil de restrictionProfil de restriction
Profil de restriction HindIII des virus parentaux et
recombinants
1 : BoHV-1.2 gC-GFP-gI-RFP, 2 : BoHV-5, R1 : Recombinant 1, R2 : Recombinant 2, 3 : BoHV-1.2 gC-
GFP, 4 : BoHV-1.2 gI-RFP
MWMW
5
4
86
10
23.150
100
kpb
33 44R1R1 R2R211 2211 22 33
Localisation du crossover simple potentiel chez R1 & R2
R1R1
R2R2
Dominante BoHV-5
Dominante BoHV-1
CO
UL US
GFP RFP
IR TR
gC BoHV-5
gE BoHV-1.2
R1R1
R2R2
Etude 2Etude 2
CONCLUSIONS
Deux recombinants BoHV-1/BoHV-5 ont été isolésDeux recombinants BoHV-1/BoHV-5 ont été isolés
La recombinaison entre alphaherpèsvirus n’est détectable La recombinaison entre alphaherpèsvirus n’est détectable que lorsqu’ils sont phylogéniquement très prochesque lorsqu’ils sont phylogéniquement très proches
R1 est proche du BoHV-5 et R2 du BoHV-1 R1 est proche du BoHV-5 et R2 du BoHV-1
La méthode sélectionnée permet d’évaluer rapidement et La méthode sélectionnée permet d’évaluer rapidement et facilement la recombinaison entre alphaherpèsvirus facilement la recombinaison entre alphaherpèsvirus
ETUDE 3ETUDE 3
Les concatémères mixtes révèlent la recombinaison entre alphaherpèsvirus
provenant d’espèces différentes
Mixed DNA concatemers reveal recombination Mixed DNA concatemers reveal recombination between alphaherpesviruses originating from between alphaherpesviruses originating from
different animal species different animal species F. Meurens, B. Muylkens, G.M. Keil, F. Schynts, A. Vanderplasschen, F. Meurens, B. Muylkens, G.M. Keil, F. Schynts, A. Vanderplasschen,
D. Ziant, and E. ThiryD. Ziant, and E. Thiry
Manuscrit en préparationManuscrit en préparation
Etude 3Etude 3
Deux aspectsDeux aspects
Recombinaison Recombinaison entre entre
alphaherpèsvirus alphaherpèsvirus de ruminants au de ruminants au
niveau niveau concatémériqueconcatémérique
Inhibition de la Inhibition de la surinfection entre surinfection entre alphaherpèsvirus alphaherpèsvirus
de ruminantsde ruminants
Au niveau Au niveau concatémériqueconcatémérique
Au niveau de Au niveau de l’expression de la l’expression de la
GFP du virus GFP du virus surinfectantsurinfectant
Etude 3Etude 3
Analyse de la recombinaison entre Analyse de la recombinaison entre alphaherpèsvirus de ruminants au niveau alphaherpèsvirus de ruminants au niveau
concatémériqueconcatémérique
IR TR
UL US
VIRUS 1VIRUS 1 VIRUS 2VIRUS 2
Enz
Enz Enz Enz
X kpb3X kpb
Couples d’alphaherpèsvirus testés :BoHV-1.1BoHV-1.1 BoHV-1.2 STBoHV-1.2 ST
BoHV-5BoHV-5 BoHV-1.1BoHV-1.1
BoHV-5BoHV-5 BoHV-1.2 STBGBoHV-1.2 STBG
CvHV-1CvHV-1 BoHV-1.2 STBoHV-1.2 ST
CvHV-2CvHV-2 BoHV-1.1BoHV-1.1
CpHV-1CpHV-1 BoHV-1.2 STBoHV-1.2 ST
CvHV-1CvHV-1 CvHV-2CvHV-2
PrVPrV BoHV-1.2 STBoHV-1.2 ST
Etude 3Etude 3
Analyse de la recombinaison entre Analyse de la recombinaison entre alphaherpèsvirus de ruminants au niveau alphaherpèsvirus de ruminants au niveau
concatémériqueconcatémérique
MW
CvH
V-1
BoH
V-1
.1
CvH
V-2
/BoH
V-1
.1
BoH
V-1
.1/B
oHV
-1.2
ST
BoH
V-5
/BoH
V-1
.1
CvH
V-2
/CvH
V-1
XbaI
200
kbp
150100
50
250300
1 2
A B
XbaI XbaI XbaI XbaI
Virus 1 Virus 2
X kbp2X kbp 3X kbp
Virus 1IR TRC UL US
CvH
V-2
/BoH
V-1
.1
BoH
V-1
.1/B
oHV
-1.2
ST
BoH
V-5
/BoH
V-1
.1
CvH
V-2
/CvH
V-1
Virus 2XbaI
MW
CvH
V-1
BoH
V-1
.1
CvH
V-2
/BoH
V-1
.1
BoH
V-1
.1/B
oHV
-1.2
ST
BoH
V-5
/BoH
V-1
.1
CvH
V-2
/CvH
V-1
XbaI
200200
kbp
150100
50
250
kbp
150150100100
5050
250250300300
1 2
A B
XbaI XbaI XbaI XbaI
Virus 1 Virus 2
X kbp2X kbp 3X kbp
Virus 1IR TR
Virus 1IR TRC UL US
CvH
V-2
/BoH
V-1
.1
BoH
V-1
.1/B
oHV
-1.2
ST
BoH
V-5
/BoH
V-1
.1
CvH
V-2
/CvH
V-1
Virus 2XbaI
Fragments de grande taille
CvHV-2/BoHV-1.1
BoHV-1.1/BoHV-1.2 ST
BoHV-5/BoHV-1.1
CvHV-2/CvHV-1
Concatémères mixtesConcatémères mixtes
Recombinaison entre Recombinaison entre concatémèresconcatémères
Etude 3Etude 3
Inhibition de la surinfection entre Inhibition de la surinfection entre alphaherpèsvirus de ruminantsalphaherpèsvirus de ruminants
Au niveau Au niveau concatémériqueconcatémérique
TT00 TTxx
MW BoH
V-1
.1
BoH
V-1
.2 S
T
BoH
V-1
.2 S
T
BoH
V-1
.1
BoH
V-1
.2 S
T
BoH
V-1
.1
2 4 6 8 2 4 6 8
BoHV-1.1/BoHV-1.2ST
BoHV-1.2 ST/BoHV-1.1
Xba I1X
50
100150200kbp
MW CvH
V-2
BoH
V-1
.2 S
TB
G
BoH
V-1
.2 S
TB
G
CvH
V-2
BoH
V-1
.2 S
TB
G
CvH
V-2
2 4 6 8 2 4 6 8
CvHV-2/BoHV-1.2 STBG
BoHV-1.2 STBG/CvHV-2
Xba I1X
150
50
100
200kbp
MW CpH
V-1
BoH
V-1
.2 S
T
BoH
V-1
.2 S
T
CpH
V-1
BoH
V-1
.2 S
T
CpH
V-1
2 4 6 8 2 4 6 8
CpHV-1/BoHV-1.2 ST
BoHV-1.2 ST/CpHV-1
Xba I1X
50
100150200kbp
MW BoH
V-5
BoH
V-1
.2 S
TB
G
BoH
V-1
.2 S
TB
G
BoH
V-5
BoH
V-1
.2 S
TB
G
BoH
V-5
2 4 6 8 2 4 6 8
BoHV-5/BoHV-1.2 STBG
BoHV-1.2 STBG/BoHV-5
Xba I1X
50
100150200kbp
A
C
B
D
MW BoH
V-1
.1
BoH
V-1
.2 S
T
BoH
V-1
.2 S
T
BoH
V-1
.1
BoH
V-1
.2 S
T
BoH
V-1
.1
2 4 6 8 2 4 6 8
BoHV-1.1/BoHV-1.2ST
BoHV-1.2 ST/BoHV-1.1
Xba I1X
50
100150200kbp
MW CvH
V-2
BoH
V-1
.2 S
TB
G
BoH
V-1
.2 S
TB
G
CvH
V-2
BoH
V-1
.2 S
TB
G
CvH
V-2
2 4 6 8 2 4 6 8
CvHV-2/BoHV-1.2 STBG
BoHV-1.2 STBG/CvHV-2
Xba I1X
150
50
100
200kbp
50
100
200kbp
MW CpH
V-1
BoH
V-1
.2 S
T
BoH
V-1
.2 S
T
CpH
V-1
BoH
V-1
.2 S
T
CpH
V-1
2 4 6 8 2 4 6 8
CpHV-1/BoHV-1.2 ST
BoHV-1.2 ST/CpHV-1
Xba I1X
50
100150200kbp
50
100150200kbp
MW BoH
V-5
BoH
V-1
.2 S
TB
G
BoH
V-1
.2 S
TB
G
BoH
V-5
BoH
V-1
.2 S
TB
G
BoH
V-5
2 4 6 8 2 4 6 8
BoHV-5/BoHV-1.2 STBG
BoHV-1.2 STBG/BoHV-5
Xba I1X
50
100150200kbp
50
100150200kbp
A
C
B
D
A BoHV-1.2 ST/BoHV-1.1
2 h
BoHV-5/BoHV-1.2 STBGB
2 h
BoHV-1.2 STBG/CvHV-2C
2 h
BoHV-1.2 ST/CpHV-1D
4 h
Etude 3Etude 3
Inhibition de la surinfection entre Inhibition de la surinfection entre alphaherpèsvirus de ruminantsalphaherpèsvirus de ruminants
Quadrant Statistics
File: 280602.038
Acquisition Date: 28-Jun-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 20 0.20
UR 7 0.07
LL 8785 87.85
LR 1188 11.88
BoHV-1.1Quadrant Statistics
File: 280602.039
Acquisition Date: 28-Jun-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 33 0.33
UR 108 1.08
LL 7497 74.97
LR 2362 23.62
BoHV-5
Quadrant Statistics
File: 280602.037
Acquisition Date: 28-Jun-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 2 0.02
UR 25 0.25
LL 9086 90.86
LR 887 8.87
CvHV-2Quadrant Statistics
File: 280602.043
Acquisition Date: 28-Jun-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 46 0.46
UR 20 0.20
LL 9587 95.87
LR 347 3.47
CvHV-1Quadrant Statistics
File: 280602.044
Acquisition Date: 28-Jun-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 2 0.02
UR 5 0.05
LL 8580 85.80
LR 1413 14.13
CpHV-1
Quadrant Statistics
File: 280602.040
Acquisition Date: 28-Jun-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 284 2.84
UR 19 0.19
LL 9288 92.88
LR 409 4.09
PrVQuadrant Statistics
File: 050702.001
Acquisition Date: 5-Jul-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 8753 87.53
UR 446 4.46
LL 195 1.95
LR 606 6.06
BoHV-1.2 gC-GFP
Quadrant Statistics
File: 280602.042
Acquisition Date: 28-Jun-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 5 0.05
UR 8 0.08
LL 8053 80.53
LR 1934 19.34
BoHV-1.2 Aus12
Quadrant Statistics
File: 050702.012
Acquisition Date: 5-Jul-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 10 0.10
UR 6 0.06
LL 9872 98.72
LR 112 1.12
(1)
Quadrant Statistics
File: 280602.038
Acquisition Date: 28-Jun-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 20 0.20
UR 7 0.07
LL 8785 87.85
LR 1188 11.88
BoHV-1.1Quadrant Statistics
File: 280602.039
Acquisition Date: 28-Jun-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 33 0.33
UR 108 1.08
LL 7497 74.97
LR 2362 23.62
BoHV-5
Quadrant Statistics
File: 280602.037
Acquisition Date: 28-Jun-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 2 0.02
UR 25 0.25
LL 9086 90.86
LR 887 8.87
CvHV-2Quadrant Statistics
File: 280602.043
Acquisition Date: 28-Jun-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 46 0.46
UR 20 0.20
LL 9587 95.87
LR 347 3.47
CvHV-1Quadrant Statistics
File: 280602.044
Acquisition Date: 28-Jun-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 2 0.02
UR 5 0.05
LL 8580 85.80
LR 1413 14.13
CpHV-1
Quadrant Statistics
File: 280602.040
Acquisition Date: 28-Jun-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 284 2.84
UR 19 0.19
LL 9288 92.88
LR 409 4.09
PrVQuadrant Statistics
File: 050702.001
Acquisition Date: 5-Jul-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 8753 87.53
UR 446 4.46
LL 195 1.95
LR 606 6.06
BoHV-1.2 gC-GFP
Quadrant Statistics
File: 280602.042
Acquisition Date: 28-Jun-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 5 0.05
UR 8 0.08
LL 8053 80.53
LR 1934 19.34
BoHV-1.2 Aus12
Quadrant Statistics
File: 050702.012
Acquisition Date: 5-Jul-2
Total Events: 10000
Quad Events % Gated
UL 10 0.10
UR 6 0.06
LL 9872 98.72
LR 112 1.12
(1)
T0 T0 : alphaherpèsvirus: alphaherpèsvirus
T+4 hT+4 h : BoHV-1.2 GFP: BoHV-1.2 GFP
Au niveau de Au niveau de l’expression de la l’expression de la
GFP du virus GFP du virus surinfectantsurinfectant
BoHV-1.2 GFP
Un intervalle de 4 h ne permet plus l’expression de la GFP du BoHV-1.2
surinfectant
Etude 3Etude 3
CONCLUSIONS
L’inhibition de la surinfection est conservée parmi les L’inhibition de la surinfection est conservée parmi les alphaherpèsvirus de ruminantsalphaherpèsvirus de ruminants
La recombinaison est détectée au niveau concatémérique La recombinaison est détectée au niveau concatémérique entreentre
BoHV-1.1BoHV-1.1 BoHV-1.2BoHV-1.2
BoHV-5BoHV-5 BoHV-1.1BoHV-1.1
CvHV-2CvHV-2 BoHV-1.1BoHV-1.1
CvHV-1CvHV-1 CvHV-2 CvHV-2
Conclusions générales Conclusions générales
et perspectiveset perspectives
ConclusionsConclusions
Etapes Contraintes
-Prévalence des infections -Spécificité d’hôte-MOI-Interférence virale-Virulence et invasivité
-Clairance immune rapide -Clairance immune rapide -Prévention de l’infection secondaire -Prévention de l’infection secondaire --ManagementManagement-Biologie de l’hôte-Biologie de l’hôte-Site d’entrée, d’inoculation-Site d’entrée, d’inoculation
VIRUS
HOTEHOTE
-Inhition de la surinfection -Spécificité -Virulence et invasivitéVIRUS
-Réponse immune (INF) -Réponse immune (INF) -Sensibilité et permissivité cellulaire-Sensibilité et permissivité cellulaire-Accessibilité cellulaire-Accessibilité cellulaire-Cycle cellulaire-Cycle cellulaire
CELLULECELLULE
-Homologie génétique -Virulence et invasivité
VIRUS
-Réponse immune -Réponse immune
HOTEHOTE
Virus recombinants
+
-
-
-
+
+
Viabilité Dominance Compétition
1)1) COINFECTION DE l’HOTE
2)2) COINFECTION CELLULAIRE
3)3) REPLICATION & RECOMBINAISON
4)4) SELECTION
Paramètres influençant la recombinaisonParamètres influençant la recombinaison
Conséquences : 1) VaccinationConséquences : 1) Vaccination
Risque de recombinaison entre les virus sauvages et Risque de recombinaison entre les virus sauvages et vaccinaux suite à l’utilisation de vaccins vivants (IN) lors vaccinaux suite à l’utilisation de vaccins vivants (IN) lors
d’épidémies d’IBRd’épidémies d’IBR
La recombinaison survient en situation de La recombinaison survient en situation de coinfectioncoinfection
La recombinaison survient en situation de La recombinaison survient en situation de surinfectionsurinfection lorsque le délai est court lorsque le délai est court
Conséquences : 2) EvolutionConséquences : 2) Evolution
La recombinaison dépasse la barrière d’espèce, des La recombinaison dépasse la barrière d’espèce, des recombinants interspécifiques peuvent être générés recombinants interspécifiques peuvent être générés
Evolution
Epidémiologique
ConclusionsConclusions
PerspectivesPerspectives
Etude 1 : étude in vivo, mécanisme(s) d’inhibition de la surinfection (gD, attachement, pénétration)
Etude 2 : étude in vivo des recombinants BoHV-1/BoHV-5, génération de recombinants in vivo, carte précise des recombinants (localisation des crossovers), étude de la recombinaison avec le BuHV-1 et l’ElkHV-1
Etude 3 : identification de recombinants BoHV-1/CvHV-2, tester de nouvelles combinaisons d’alphaherpèsvirus
Merci pour votre attentionMerci pour votre attention