Ph D Public Lesson

François MeurensAspirant FNRS

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Vétérinaires

2003/2004

Influence du délai de surinfection et de la Influence du délai de surinfection et de la parenté génétique sur la recombinaison de parenté génétique sur la recombinaison de

l’herpèsvirus bovin 1l’herpèsvirus bovin 1

Influence of superinfection delay and genetic relatedness on bovine herpesvirus 1 recombination

UNIVERSITE DE LIEGEFACULTE DE MEDECINE VETERINAIRE

Département des Maladies Infectieuses et ParasitairesVirologie, Pathologie des maladies virales et Epidémiologie

PLAN

IntroductionIntroductionAnn. Méd. Vét., 2001, 145, 108-119Virologie, 2003, 7, 319-328

Etude 1 :Etude 1 : « Superinfection prevents recombination of the

alphaherpesvirus bovine herpesvirus 1 »J. Virol. 2004, 78, 3872-3879

Etude 2 :Etude 2 : « Interspecific recombination between two

ruminant alphaherpesviruses, bovine herpesviruses 1 and 5 » J. Virol., 2004, 78, 9828-9836

Etude 3 :Etude 3 : « Mixed DNA concatemers reveal recombination

between alphaherpesviruses originating from different animal species »

Manuscrit en préparationConclusions générales et perspectivesConclusions générales et perspectives

ObjectifObjectif

INTRODUCTIONINTRODUCTION

10)10) Recombinaison Recombinaison

11)11) Recombinaison et alphaherpèsvirusRecombinaison et alphaherpèsvirus

12)12) Facteurs influençant la recombinaisonFacteurs influençant la recombinaison

1)1) La rhinotrachéite infectieuse bovineLa rhinotrachéite infectieuse bovine

2)2) EnjeuxEnjeux

3)3) L’herpèsvirus bovin 1L’herpèsvirus bovin 1

4)4) Classification sur la base des propriétés biologiquesClassification sur la base des propriétés biologiques

5)5) Classification sur la base de l’organisation génomiqueClassification sur la base de l’organisation génomique

6)6) Les glycoprotéines d’enveloppeLes glycoprotéines d’enveloppe

7)7) Cycle viralCycle viral

8)8) Les sous-types de BoHV-1Les sous-types de BoHV-1

9)9) Alphaherpèsvirus apparentés au BoHV-1Alphaherpèsvirus apparentés au BoHV-1

13)13) Interférence Interférence

14)14) Vaccination Vaccination


Première description remonte au début des années 50 aux USA

(Schroeder et Moys, 1954 ; Mc Kercher et al., 1954)

Première description en 1841 par Büchner

1) La rhinotrachéite infectieuse bovine1) La rhinotrachéite infectieuse bovine

Rhinotrachéite infectieuse bovine (IBR)(IBR)

Vulvovaginite infectieuse pustuleuse (IPV)(IPV)

« Bläschenausschlag » (Tromsdorf, 1894)


Limbourg et al., 2002, Boelaert et al., 2000

2) Enjeux2) Enjeux

Séroprévalence de troupeau en Belgique

Conséquences cliniques et restrictions dans le commerce du bétail, des embryons et de la semence

Ils peuvent en conséquence interdire l’importation d’animaux ou de certains produits d’origine animale en provenance des autres pays

européens

IndemnesIndemnes

66,7 %66,7 %

FINFIN

SWESWE

CHECHE

AUTAUT

DNKDNK

BolzanoBolzano

3) L’herpèsvirus bovin 1 3) L’herpèsvirus bovin 1

(BoHV-1)(BoHV-1)

Morphologie des herpèsvirusMorphologie des herpèsvirus

Capside + ADN Tégument

Glycoprotéines

Enveloppe



3 sous-familles

AlphaherpesvirinaeAlphaherpesvirinae

Betaherpesvirinae

Gammaherpesvirinae

4 genres

Simplexvirus

Varicellovirus Varicellovirus :: herpèsvirus bovin 1herpèsvirus bovin 1

Mardivirus

Iltovirus

4) Classification sur la base des propriétés 4) Classification sur la base des propriétés biologiquesbiologiques

MMuHV-1uHV-1

Groupe Ex.

LTRLTR RTRRTR

R4R4 R3R3 R2R2 R1R1

UULLIIRR TTRRUUSS

Isomères

11

11

11

22

aann bb b’b’a’a’nncc’’ cc aaUULL44

11

DD

EE

FF

HHV-6HHV-6

BBooHV-4HV-4

HHV-4HHV-4

BBooHV‑1HV‑1

HHHV-1HV-1

AA

BB

CC

UUss


5) Classification sur la base de l’organisation 5) Classification sur la base de l’organisation génomiquegénomique

αα

6) Les glycoprotéines d’enveloppe6) Les glycoprotéines d’enveloppe

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 kb

gK gC gB gH gM gL

UL US

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

gG gD gI gE

IR TR

AttachementLiaison à C3b

Attachement/PénétrationPassage de cellule à cellule

InterférenceApoptose

Passage de cellule à celluleNeuroinvasion

MaturationImmunoévasion


1) Attachement1) Attachement

11

2) Pénétration2) Pénétration

22

3) Réplication3) Réplication

33

4) Clivage4) Clivage

5) Encapsidation5) Encapsidation

44

55

6) Maturation6) Maturation

7) Sortie7) Sortie66

77 HSV-1

OH 3'

P 5'

Clivage d'un des brins d'ADN

ADN viral circularisé

3'

5'

Point de croissance

Brin déplacé

3'

Synthèse du brin complémentaire

3'

5'

Cercles roulants

Concatémères

7) Cycle viral7) Cycle viral

α

β

γ

66


BoHV-1BoHV-1

BoHV-1.2BoHV-1.2BoHV-1.1BoHV-1.1

Profil de restrictionProfil de restriction

Acs monoclonauxAcs monoclonaux

8) Les sous-types de BoHV-18) Les sous-types de BoHV-1

9) Alphaherpèsvirus apparentés au BoHV-19) Alphaherpèsvirus apparentés au BoHV-1

L’herpèsvirus bovin 5 (BoHV-5L’herpèsvirus bovin 5 (BoHV-5, ex BoHV-1.3) méningo-encéphalite chez le bovin

L’herpèsvirus des cervidés 1L’herpèsvirus des cervidés 1 (CvHV-1(CvHV-1, ex CerHV-1) kérato-conjonctivite chez le cerf

L’herpèsvirus des cervidés 2L’herpèsvirus des cervidés 2 (CvHV-2(CvHV-2, ex RanHV-1) asymptomatique chez le renne

L’herpèsvirus caprin 1 (CpHV-1L’herpèsvirus caprin 1 (CpHV-1, ex CapHV-1) troubles génitaux chez la chèvre



Arbres phylogéniques (gB, gD). Arbres phylogéniques (gB, gD). L’arbre A a été généré selon la L’arbre A a été généré selon la méthode « neighbour joining », méthode « neighbour joining », l’arbre B selon la méthode de l’arbre B selon la méthode de

parcimonie (Ros et Belàk, 1999)parcimonie (Ros et Belàk, 1999)


CvHV-2 CvHV-1

BoHV-5

BoHV-1.2

BoHV-1.1

CpHV-1

PrV

BoHV-1.1

BoHV-1.2

BoHV-5

CvHV-1

CvHV-2

CpHV-1

PrV

http://jcm.asm.org/content/vol37/issue5/images/large/jm0591132003.jpeg


Conséquences de l’infection du veau par des herpèsvirus apparentés au BoHV-1

Infection primaire

Réponse sérologique

Latence Réactivation et

réexcrétion

BoHV-5 OUI OUI OUI OUI

CpHV-1 OUI OUI OUI NON

CvHV-1 NON NON NON NON

CvHV-2 OUI OUI NON NON

Conséquences de l’infection de ruminants par le BoHV-1

Infection primaire

Réponse sérologique

Latence Réactivation et

réexcrétion

Chèvre OUI OUI OUI OUI

Cerf OUI NON NON NON

Renne OUI NON NON NON

Mouton OUI OUI OUI OUI

Thiry et al., 2002



10) La recombinaison

4 types

La recombinaison homologue

La recombinaison spécifique de site

La transposition

La recombinaison illégitime

La recombinaison, au sens génétique du terme consiste en la génération de nouvelles combinaisons de matériel génétique (Dressler et Potter, 1982 ; Bujarski, 1999 ; Umene, 1999)

Umene, 1999


4 types

La recombinaison homologueLa recombinaison homologue

La recombinaison spécifique de site

La transposition

La recombinaison illégitimeLa recombinaison illégitime

La recombinaison, au sens génétique du terme, consiste en la génération de nouvelles combinaisons de matériel génétique (Dressler et Potter, 1982 ; Bujarski, 1999 ; Umene, 1999)

Umene, 1999

HERPESVIRUSHERPESVIRUS



XZ

ZX

1

2

3

4

5

6

7 8

9 10

X ZY

X ZY

X Z

X Z

X Z

Z X

X Z

X Z

*

*

*

*

MECANISME

1) Alignement

2) Clivage d’un brin de chaque duplex

3) Invasion

4) Scellement

5) Migration de jonction

6) Migration de jonction bis

7) Clivage

8) Clivage alternatif

9) Recombinant

10) Recombinant alternatif



11) Recombinaison et alphaherpèsvirus

-Le virus de la maladie d’Aujeszky (PrV)(Dangler et al., 1994 ; Glazenburg et al., 1994 ; Henderson et al., 1990)

-Les herpèsvirus simplex 1 et 2 (HSV-1 et 2)(Brown et al., 1973 ; Halliburton et al., 1980 ; Umene, 1985 ; Javier et al., 1986 ; Preston et al., 1978)

-Le virus de la varicelle et le zona (VZV)(Dohner et al. 1988 ; Muir et al., 2002)

Identification de recombinants in vitro et in vivo

-L’herpèsvirus félin 1 (FeHV-1)(Fujita et al. 1998)

-Le BoHV-1-Le BoHV-1(Schynts et al., 2001, 2003)(Schynts et al., 2001, 2003)

Fréquence Fréquence

+/- 30 %+/- 30 %

BoHV-1BoHV-1


12) Facteurs influençant la fréquence 12) Facteurs influençant la fréquence de recombinaisonde recombinaison

Parenté génétique (Halliburton et al., 1977)

Dose de virus inoculé

Distance entre les sites d’inoculation

Séparation temporelle des infections (2 h)

Localisation des marqueurs de détectionIn vivo

(Glazenburg et al., 1994)

L’interférenceL’interférence

L’ensemble des mécanismes qui, suite à une infection virale, limitent et empêchent la multiplication d’un autre

virus au sein des cellules saines ou infectées


13) Interférence13) Interférence

Interférons

Incompatibilité entre virus hétérologues

Prévention de la surinfection

Particules défectives interférentes

Dominance des mutants

Interférence liée aux ARN


Récepteur primaire

Récepteur secondaire

gD sauvage gD mutante

HSV-1 sauvage

HSV-1 mutant

Cellule sauvage Cellule sauvageCellule exprimant gD Cellule exprimant gD et le récepteur secondaire

Présentation de la prévention de la surinfection due à la Présentation de la prévention de la surinfection due à la glycoprotéine D chez le virus herpès simplex 1 (adapté d’après glycoprotéine D chez le virus herpès simplex 1 (adapté d’après

Campadelli-Fiume et al., 2000Campadelli-Fiume et al., 2000))

PREVENTION DE LA SURINFECTION


14) Vaccination14) Vaccination

Plan de lutte en vigueur depuis le 1er septembre 1997 (arrêté royal du 30 août 1997)

vaccins marqués gE- permettant la différenciation des animaux infectés des animaux vaccinés

Vaccins « vivants »

1. vaccins atténués

- par délétion de gènes (gène gE)

2. vaccins vectorisés

- réplicatifs

- non réplicatifs

Vaccins inertes

1. vaccins inactivés délétés

2. vaccins sous unitaires

- glycoprotéines

3. ADN plasmidique


Cette étude intervient dans Cette étude intervient dans l’évaluation du risque de l’évaluation du risque de

recombinaison lié à l’utilisation de recombinaison lié à l’utilisation de vaccins « vivants »vaccins « vivants »

OBJECTIFOBJECTIF

Préciser l’influence de deux paramètres sur la génération

de virus recombinants

1) Le délai de surinfection1) Le délai de surinfection

2) La parenté génétique2) La parenté génétique

ObjectifsObjectifs

ObjectifsObjectifsEtude 1

Evaluer l’effet du délai entre infections sur la génération de virus recombinants

Etudes 2 et 3Evaluer les possibilités de recombinaison entre alphaherpèsvirus de ruminants

A l’issue du A l’issue du cycle viralcycle viral

22

Au niveau des Au niveau des intermédiaires de intermédiaires de

réplicationréplication

33

Avant et à l’issue Avant et à l’issue du cycle viraldu cycle viral

11

ETUDE 1ETUDE 1

La surinfection constitue un frein à la recombinaison de l’herpèsvirus bovin 1

Superinfection prevents recombination of the Superinfection prevents recombination of the alphaherpesvirus bovine herpesvirus 1 alphaherpesvirus bovine herpesvirus 1

F. Meurens, F. Schynts, G.M. Keil, B. Muylkens, A. Vanderplasschen, F. Meurens, F. Schynts, G.M. Keil, B. Muylkens, A. Vanderplasschen, P. Gallego, and E. ThiryP. Gallego, and E. Thiry

J. Virol. (2004) 78, 3872-3879J. Virol. (2004) 78, 3872-3879

TROIS APPROCHESTROIS APPROCHES

ELECTROPHORESE A CHAMP PULSEELECTROPHORESE A CHAMP PULSE

Etude 1Etude 1

IMMUNOFLUORESCENCEIMMUNOFLUORESCENCE

CYTOMETRIE EN FLUXCYTOMETRIE EN FLUX

1) Influence du délai de surinfection : 1) Influence du délai de surinfection : immunofluorescenceimmunofluorescence

Isolement et caractérisation des virus générésIsolement et caractérisation des virus générés

Suspension virale résultant des infections

Isolement des virus par repiquage

Réplication des isolats

Caractérisation des isolats par immunofluorescence

Etude 1Etude 1

MDBK

Lam gC-gE+ Lam gC+gE-

CoinfectionCoinfection&&

SurinfectionsSurinfections

Etude 1Etude 1

4 populations virales générées4 populations virales généréesgC-gE+, gC+gE-, gC-gE- (R), gC+gE+ (R) gC-gE+, gC+gE-, gC-gE- (R), gC+gE+ (R)

0 h 2 h 4 h 6 h 8 hI Lam gC-/Lam gE-II Lam gC- Lam gE-III Lam gC- Lam gE-IV Lam gC- Lam gE-V Lam gC- Lam gE-

0 h 2 h 4 h 6 h 8 hI Lam gE-/Lam gC-II Lam gE- Lam gC-III Lam gE- Lam gC-IV Lam gE- Lam gC-V Lam gE- Lam gC-


Etude 1Etude 1

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8

gC+gE+

gC-gE-Recombinants

gC-gE+

gC+gE-Parentaux

A B

Temps entre les infections BoHV-1 gC-gE+ et gC+gE- (h) Temps entre les infections BoHV-1 gC+gE- et gC-gE+ (h)

Po

urc

enta

ges

rel

atif

s d

es p

op

ula

tio

ns

vira

les

gén

érée

s


2) Influence du délai de surinfection : 2) Influence du délai de surinfection : cytométrie en fluxcytométrie en flux

Analyse des cellules par cytométrie en flux afin de déterminerAnalyse des cellules par cytométrie en flux afin de déterminer le niveau d’expression de la le niveau d’expression de la -gal-gal

Etude 1Etude 1

MDBK

IncubationIncubation



ST STBG

gE-

-gal+

gE+

FL2 : fluorescence liée à gE

FL1 : fluorescence liée à -gal

ST 0/ STBG 0 hST 0/ STBG 0 h ST 0/ STBG 2 hST 0/ STBG 2 h

ST 0/ STBG 4 hST 0/ STBG 4 h



Etude 1Etude 12) Influence du délai de surinfection : 2) Influence du délai de surinfection :

cytométrie en fluxcytométrie en flux

Etude 1Etude 1

3) Influence du délai de surinfection : 3) Influence du délai de surinfection : électrophorèse à champ pulséélectrophorèse à champ pulsé

Analyse par électrophorèse à champ pulsé pour détecter la présence de Analyse par électrophorèse à champ pulsé pour détecter la présence de concatémères mixtes signalant des événements de recombinaisonconcatémères mixtes signalant des événements de recombinaison



ST STBG

gE-

-gal+

MDBK

IncubationIncubation

Etude 1Etude 1

ST (135 301 pb)

BoHV-1 STBG est digéré par XbaI

BoHV-1 ST n’est pas digéré par XbaI 114 212 124 006

- 1714 pb (gE) = 122 292 pb

STBG (138 118 pb)

7488

611

102 918 114 212 126 842 138 118

XbaXbaII122 325 126 207122 325 126 207

2 Virus2 VirusLa coinfection produit des La coinfection produit des

concatémères mixtesconcatémères mixtes

gC

gD

gE


ß-gal

Etude 1Etude 1

IR TR

UL US

STST STBGSTBG

XbaIXbaI

XbaIXbaI XbaIXbaI XbaIXbaI

134 kpb409 kpb

XbaIXbaI

409 kpb

134 kpb


Concatémères mixtes

Etude 1Etude 1

XbaI XbaI XbaI XbaI

134 kbp271 kbp 409 kbp

ST STBG

XbaI

1 2 3 4 5 6 7 8 9

MW

10

MIX

kbp

50

100

150

200

271

409

134

ST/STBG

MIX 2 4 6 8

XbaI

kbp

271

134

A

B

C

271

409

134

19

ST STBG MIX 1X

MIXST STBG

ST STBG MIX


ConcatémèresConcatémères

MixtesMixtes

Etude 1Etude 1

CONCLUSIONS

Un intervalle de plus de 2 h entre les infections réduit Un intervalle de plus de 2 h entre les infections réduit drastiquement la génération de virus recombinantsdrastiquement la génération de virus recombinants

La recombinaison entre alphaherpèsvirus n’est possible La recombinaison entre alphaherpèsvirus n’est possible que dans un laps de temps restreintque dans un laps de temps restreint

Le choix des virus peut influencer l’établissement plus ou Le choix des virus peut influencer l’établissement plus ou moins rapide de la barrière à la surinfectionmoins rapide de la barrière à la surinfection

ETUDE 2ETUDE 2

Recombinaison interspécifique entre deux alphaherpèsvirus de ruminants,

les herpèsvirus bovins 1 & 5

Interspecific recombination between two ruminant Interspecific recombination between two ruminant alphaherpesviruses, bovine herpesviruses 1 & 5 alphaherpesviruses, bovine herpesviruses 1 & 5

F. Meurens, G.M. Keil, B. Muylkens, S. Gogev, F. Schynts, S. Negro, F. Meurens, G.M. Keil, B. Muylkens, S. Gogev, F. Schynts, S. Negro,

L. Wiggers, and E. ThiryL. Wiggers, and E. Thiry

J. Virol. (2004), 78, 9828-9836J. Virol. (2004), 78, 9828-9836

Etude 2Etude 2

Evaluation de la recombinaison entre le BoHV-1.2 mutant

&

Le BoHV-1.2Le BoHV-1.2

Le BoHV-1.1Le BoHV-1.1

Le BoHV-5Le BoHV-5

Le CvHV-2Le CvHV-2

Le CpHV-1Le CpHV-1

Tous ces virus peuvent potentiellement se rencontrer en conditions naturelles

ProtocoleProtocoleEtude 2Etude 2

a

b

c GFP cassetteGFP cassette

gC

10kbp

UL46

UL US

gE--gD gI 1kbp

RFP cassetteRFP cassette

-----

IR TR

BoHV-1.2/BoHV-1.2/gC-GFP-gC-GFP-gI-RFPgI-RFP

BoHV-1.2 mutantBoHV-1.2 mutant

Etude 2Etude 2

X

GFPGFP RFPRFP

BoHV-1.2

BoHV-1.1

BoHV-5

CvHV-2

CpHV-1

BoHV-1.2/DgC-GFP-DgI-RFP

ProtocoleProtocole

CoinfectionsCoinfections

GFP-/RFP-

GFP+GFP+/RFP+RFP+

Parentaux

GFP+/GFP+/RFP-

GFP-/RFP+/RFP+

RecombinantsRecombinants

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

BoHV-1.2/BoHV-1.1/BoHV-5/CvHV-2/CpHV-1/

BoHV-1.2 gC-GFP-gI-RFP

Pourcentages relatifs des populations virales générées

Situations de coinfection

GFP-/RFP+RFP+

GFP+GFP+/RFP-Recombinants

GFP-/RFP-

GFP+GFP+/RFP+RFP+Parentaux

Etude 2Etude 2Caractérisation des virus issus

des coinfections

2

Pas de recombinants avec :CvHV-2

CpHV-1

Etude 2Etude 2

Pourrait être dû à une trop grande Pourrait être dû à une trop grande désynchronisation des cycles viraux de ces virus désynchronisation des cycles viraux de ces virus

par rapport au BoHV-1par rapport au BoHV-1

1)1) Etablissement des cinétiques de pénétration et de multiplication virale des virus utilisés

2)2) Coinfections différées sur base des résultats obtenus de manière à favoriser l’émergence de recombinants avec le CvHV-2 et le CpHV-1

0

1020

3040

5060

70

8090

100110

120

0 30 60 90 120 150 180 210 240

% protectedtime (min)

CpHV-1

CvHV-2

BoHV-5

BoHV-1.1

BoHV-1.2

BoHV-1.2/gC-GFP-gI-RFP

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 3 6 9 12 15 18 21 24

time p.i. (h)titer (log10 pfu/ml)

Cinétique de pénétrationCinétique de pénétration Cinétique de multiplicationCinétique de multiplication

Etude 2Etude 2

CpHV-1

CvHV-2

BoHV-5

BoHV-1.1

BoHV-1.2

BoHV-1.2/gC-GFP-gI-RFP

BoHV-1.2 gC-GFP-gI-RFP < < CvHV-2CvHV-2

CpHV-1

BoHV-1.1

BoHV-5

BoHV-1.2

<CvHV-2

CpHV-1 <BoHV-5 BoHV-5 BoHV-1.1BoHV-1.1BoHV-1.2BoHV-1.2

BoHV-1.2 gC-GFP-gI-RFP

Etude 2Etude 2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Pourcentage relatif des populations virales générées

Situation de coinfection

CvHV-2/BoHV-1.2 gC-GFP-gI-RFP

GFP-/RFP-

GFP+GFP+/RFP+RFP+Parentaux

CvHV-2 >> BoHV-1.2 gC-GFP-gI-RFP

Introduction de délai entre l’infection par le BoHV-1.2 mutant et le CvHV-2

T0 T0 : BoHV-1.2 mutant: BoHV-1.2 mutant

T+2 hT+2 h : CvHV-2: CvHV-2

RecombinantsRecombinants

Avec le CpHV-1

Idem

Etude 2Etude 2

Caractérisation des recombinants BoHV-1/BoHV-5Caractérisation des recombinants BoHV-1/BoHV-5MarquageMarquage

Acs/Virus BoHV-1 BoHV-5 R1 R2BH35 + - - +1507 + - - -2F12 + - - -2915 - + - +1624 - + + -

Réactivité des différents anticorps monoclonaux contre le BoHV-1, le BoHV-5, et les 2 recombinants obtenus des coinfections

BoHV-1/BoHV-5

Ac BH35 gE du BoHV-1Ac 1507 gC du BoHV-1Ac 2F12 gI/gE du BoHV-1Ac 2915 gC du BoHV-5Ac 1624 BoHV-5

Etude 2Etude 2

Caractérisation des recombinants BoHV-1/BoHV-5Caractérisation des recombinants BoHV-1/BoHV-5Profil de restrictionProfil de restriction

Profil de restriction HindIII des virus parentaux et

recombinants

1 : BoHV-1.2 gC-GFP-gI-RFP, 2 : BoHV-5, R1 : Recombinant 1, R2 : Recombinant 2, 3 : BoHV-1.2 gC-

GFP, 4 : BoHV-1.2 gI-RFP

MWMW

5

4

86

10

23.150

100

kpb

33 44R1R1 R2R211 2211 22 33

Localisation du crossover simple potentiel chez R1 & R2

R1R1

R2R2

Dominante BoHV-5

Dominante BoHV-1

CO

UL US

GFP RFP

IR TR

gC BoHV-5

gE BoHV-1.2

R1R1

R2R2

Etude 2Etude 2

CONCLUSIONS

Deux recombinants BoHV-1/BoHV-5 ont été isolésDeux recombinants BoHV-1/BoHV-5 ont été isolés

La recombinaison entre alphaherpèsvirus n’est détectable La recombinaison entre alphaherpèsvirus n’est détectable que lorsqu’ils sont phylogéniquement très prochesque lorsqu’ils sont phylogéniquement très proches

R1 est proche du BoHV-5 et R2 du BoHV-1 R1 est proche du BoHV-5 et R2 du BoHV-1

La méthode sélectionnée permet d’évaluer rapidement et La méthode sélectionnée permet d’évaluer rapidement et facilement la recombinaison entre alphaherpèsvirus facilement la recombinaison entre alphaherpèsvirus

ETUDE 3ETUDE 3

Les concatémères mixtes révèlent la recombinaison entre alphaherpèsvirus

provenant d’espèces différentes

Mixed DNA concatemers reveal recombination Mixed DNA concatemers reveal recombination between alphaherpesviruses originating from between alphaherpesviruses originating from

different animal species different animal species F. Meurens, B. Muylkens, G.M. Keil, F. Schynts, A. Vanderplasschen, F. Meurens, B. Muylkens, G.M. Keil, F. Schynts, A. Vanderplasschen,

D. Ziant, and E. ThiryD. Ziant, and E. Thiry

Manuscrit en préparationManuscrit en préparation

Etude 3Etude 3

Deux aspectsDeux aspects

Recombinaison Recombinaison entre entre

alphaherpèsvirus alphaherpèsvirus de ruminants au de ruminants au

niveau niveau concatémériqueconcatémérique

Inhibition de la Inhibition de la surinfection entre surinfection entre alphaherpèsvirus alphaherpèsvirus

de ruminantsde ruminants

Au niveau Au niveau concatémériqueconcatémérique

Au niveau de Au niveau de l’expression de la l’expression de la

GFP du virus GFP du virus surinfectantsurinfectant

Etude 3Etude 3

Analyse de la recombinaison entre Analyse de la recombinaison entre alphaherpèsvirus de ruminants au niveau alphaherpèsvirus de ruminants au niveau

concatémériqueconcatémérique

IR TR

UL US

VIRUS 1VIRUS 1 VIRUS 2VIRUS 2

Enz

Enz Enz Enz

X kpb3X kpb

Couples d’alphaherpèsvirus testés :BoHV-1.1BoHV-1.1 BoHV-1.2 STBoHV-1.2 ST

BoHV-5BoHV-5 BoHV-1.1BoHV-1.1

BoHV-5BoHV-5 BoHV-1.2 STBGBoHV-1.2 STBG

CvHV-1CvHV-1 BoHV-1.2 STBoHV-1.2 ST

CvHV-2CvHV-2 BoHV-1.1BoHV-1.1

CpHV-1CpHV-1 BoHV-1.2 STBoHV-1.2 ST

CvHV-1CvHV-1 CvHV-2CvHV-2

PrVPrV BoHV-1.2 STBoHV-1.2 ST

Etude 3Etude 3

Analyse de la recombinaison entre Analyse de la recombinaison entre alphaherpèsvirus de ruminants au niveau alphaherpèsvirus de ruminants au niveau

concatémériqueconcatémérique

MW

CvH

V-1

BoH

V-1

.1

CvH

V-2

/BoH

V-1

.1

BoH

V-1

.1/B

oHV

-1.2

ST

BoH

V-5

/BoH

V-1

.1

CvH

V-2

/CvH

V-1

XbaI

200

kbp

150100

50

250300

1 2

A B

XbaI XbaI XbaI XbaI

Virus 1 Virus 2

X kbp2X kbp 3X kbp

Virus 1IR TRC UL US

CvH

V-2

/BoH

V-1

.1

BoH

V-1

.1/B

oHV

-1.2

ST

BoH

V-5

/BoH

V-1

.1

CvH

V-2

/CvH

V-1

Virus 2XbaI

MW

CvH

V-1

BoH

V-1

.1

CvH

V-2

/BoH

V-1

.1

BoH

V-1

.1/B

oHV

-1.2

ST

BoH

V-5

/BoH

V-1

.1

CvH

V-2

/CvH

V-1

XbaI

200200

kbp

150100

50

250

kbp

150150100100

5050

250250300300

1 2

A B

XbaI XbaI XbaI XbaI

Virus 1 Virus 2

X kbp2X kbp 3X kbp

Virus 1IR TR

Virus 1IR TRC UL US

CvH

V-2

/BoH

V-1

.1

BoH

V-1

.1/B

oHV

-1.2

ST

BoH

V-5

/BoH

V-1

.1

CvH

V-2

/CvH

V-1

Virus 2XbaI

Fragments de grande taille

CvHV-2/BoHV-1.1

BoHV-1.1/BoHV-1.2 ST

BoHV-5/BoHV-1.1

CvHV-2/CvHV-1

Concatémères mixtesConcatémères mixtes

Recombinaison entre Recombinaison entre concatémèresconcatémères

Etude 3Etude 3

Inhibition de la surinfection entre Inhibition de la surinfection entre alphaherpèsvirus de ruminantsalphaherpèsvirus de ruminants

Au niveau Au niveau concatémériqueconcatémérique

TT00 TTxx

MW BoH

V-1

.1

BoH

V-1

.2 S

T

BoH

V-1

.2 S

T

BoH

V-1

.1

BoH

V-1

.2 S

T

BoH

V-1

.1

2 4 6 8 2 4 6 8

BoHV-1.1/BoHV-1.2ST

BoHV-1.2 ST/BoHV-1.1

Xba I1X

50

100150200kbp

MW CvH

V-2

BoH

V-1

.2 S

TB

G

BoH

V-1

.2 S

TB

G

CvH

V-2

BoH

V-1

.2 S

TB

G

CvH

V-2

2 4 6 8 2 4 6 8

CvHV-2/BoHV-1.2 STBG

BoHV-1.2 STBG/CvHV-2

Xba I1X

150

50

100

200kbp

MW CpH

V-1

BoH

V-1

.2 S

T

BoH

V-1

.2 S

T

CpH

V-1

BoH

V-1

.2 S

T

CpH

V-1

2 4 6 8 2 4 6 8

CpHV-1/BoHV-1.2 ST

BoHV-1.2 ST/CpHV-1

Xba I1X

50

100150200kbp

MW BoH

V-5

BoH

V-1

.2 S

TB

G

BoH

V-1

.2 S

TB

G

BoH

V-5

BoH

V-1

.2 S

TB

G

BoH

V-5

2 4 6 8 2 4 6 8

BoHV-5/BoHV-1.2 STBG

BoHV-1.2 STBG/BoHV-5

Xba I1X

50

100150200kbp

A

C

B

D

MW BoH

V-1

.1

BoH

V-1

.2 S

T

BoH

V-1

.2 S

T

BoH

V-1

.1

BoH

V-1

.2 S

T

BoH

V-1

.1

2 4 6 8 2 4 6 8

BoHV-1.1/BoHV-1.2ST

BoHV-1.2 ST/BoHV-1.1

Xba I1X

50

100150200kbp

MW CvH

V-2

BoH

V-1

.2 S

TB

G

BoH

V-1

.2 S

TB

G

CvH

V-2

BoH

V-1

.2 S

TB

G

CvH

V-2

2 4 6 8 2 4 6 8

CvHV-2/BoHV-1.2 STBG

BoHV-1.2 STBG/CvHV-2

Xba I1X

150

50

100

200kbp

50

100

200kbp

MW CpH

V-1

BoH

V-1

.2 S

T

BoH

V-1

.2 S

T

CpH

V-1

BoH

V-1

.2 S

T

CpH

V-1

2 4 6 8 2 4 6 8

CpHV-1/BoHV-1.2 ST

BoHV-1.2 ST/CpHV-1

Xba I1X

50

100150200kbp

50

100150200kbp

MW BoH

V-5

BoH

V-1

.2 S

TB

G

BoH

V-1

.2 S

TB

G

BoH

V-5

BoH

V-1

.2 S

TB

G

BoH

V-5

2 4 6 8 2 4 6 8

BoHV-5/BoHV-1.2 STBG

BoHV-1.2 STBG/BoHV-5

Xba I1X

50

100150200kbp

50

100150200kbp

A

C

B

D

A BoHV-1.2 ST/BoHV-1.1

2 h

BoHV-5/BoHV-1.2 STBGB

2 h

BoHV-1.2 STBG/CvHV-2C

2 h

BoHV-1.2 ST/CpHV-1D

4 h

Etude 3Etude 3

Inhibition de la surinfection entre Inhibition de la surinfection entre alphaherpèsvirus de ruminantsalphaherpèsvirus de ruminants

Quadrant Statistics

File: 280602.038

Acquisition Date: 28-Jun-2

Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 20 0.20

UR 7 0.07

LL 8785 87.85

LR 1188 11.88

BoHV-1.1Quadrant Statistics

File: 280602.039


Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 33 0.33

UR 108 1.08

LL 7497 74.97

LR 2362 23.62

BoHV-5

Quadrant Statistics

File: 280602.037


Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 2 0.02

UR 25 0.25

LL 9086 90.86

LR 887 8.87

CvHV-2Quadrant Statistics

File: 280602.043


Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 46 0.46

UR 20 0.20

LL 9587 95.87

LR 347 3.47


File: 280602.044


Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 2 0.02

UR 5 0.05

LL 8580 85.80

LR 1413 14.13

CpHV-1

Quadrant Statistics

File: 280602.040


Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 284 2.84

UR 19 0.19

LL 9288 92.88

LR 409 4.09

PrVQuadrant Statistics

File: 050702.001

Acquisition Date: 5-Jul-2

Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 8753 87.53

UR 446 4.46

LL 195 1.95

LR 606 6.06

BoHV-1.2 gC-GFP

Quadrant Statistics

File: 280602.042


Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 5 0.05

UR 8 0.08

LL 8053 80.53

LR 1934 19.34

BoHV-1.2 Aus12

Quadrant Statistics

File: 050702.012


Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 10 0.10

UR 6 0.06

LL 9872 98.72

LR 112 1.12

(1)

Quadrant Statistics

File: 280602.038


Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 20 0.20

UR 7 0.07

LL 8785 87.85

LR 1188 11.88

BoHV-1.1Quadrant Statistics

File: 280602.039


Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 33 0.33

UR 108 1.08

LL 7497 74.97

LR 2362 23.62

BoHV-5

Quadrant Statistics

File: 280602.037


Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 2 0.02

UR 25 0.25

LL 9086 90.86

LR 887 8.87


File: 280602.043


Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 46 0.46

UR 20 0.20

LL 9587 95.87

LR 347 3.47


File: 280602.044


Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 2 0.02

UR 5 0.05

LL 8580 85.80

LR 1413 14.13

CpHV-1

Quadrant Statistics

File: 280602.040


Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 284 2.84

UR 19 0.19

LL 9288 92.88

LR 409 4.09

PrVQuadrant Statistics

File: 050702.001


Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 8753 87.53

UR 446 4.46

LL 195 1.95

LR 606 6.06

BoHV-1.2 gC-GFP

Quadrant Statistics

File: 280602.042


Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 5 0.05

UR 8 0.08

LL 8053 80.53

LR 1934 19.34

BoHV-1.2 Aus12

Quadrant Statistics

File: 050702.012


Total Events: 10000

Quad Events % Gated

UL 10 0.10

UR 6 0.06

LL 9872 98.72

LR 112 1.12

(1)

T0 T0 : alphaherpèsvirus: alphaherpèsvirus

T+4 hT+4 h : BoHV-1.2 GFP: BoHV-1.2 GFP

Au niveau de Au niveau de l’expression de la l’expression de la

GFP du virus GFP du virus surinfectantsurinfectant

BoHV-1.2 GFP

Un intervalle de 4 h ne permet plus l’expression de la GFP du BoHV-1.2

surinfectant

Etude 3Etude 3

CONCLUSIONS

L’inhibition de la surinfection est conservée parmi les L’inhibition de la surinfection est conservée parmi les alphaherpèsvirus de ruminantsalphaherpèsvirus de ruminants

La recombinaison est détectée au niveau concatémérique La recombinaison est détectée au niveau concatémérique entreentre

BoHV-1.1BoHV-1.1 BoHV-1.2BoHV-1.2

BoHV-5BoHV-5 BoHV-1.1BoHV-1.1

CvHV-2CvHV-2 BoHV-1.1BoHV-1.1

CvHV-1CvHV-1 CvHV-2 CvHV-2

Conclusions générales Conclusions générales

et perspectiveset perspectives

ConclusionsConclusions

Etapes Contraintes

-Prévalence des infections -Spécificité d’hôte-MOI-Interférence virale-Virulence et invasivité

-Clairance immune rapide -Clairance immune rapide -Prévention de l’infection secondaire -Prévention de l’infection secondaire --ManagementManagement-Biologie de l’hôte-Biologie de l’hôte-Site d’entrée, d’inoculation-Site d’entrée, d’inoculation

VIRUS

HOTEHOTE

-Inhition de la surinfection -Spécificité -Virulence et invasivitéVIRUS

-Réponse immune (INF) -Réponse immune (INF) -Sensibilité et permissivité cellulaire-Sensibilité et permissivité cellulaire-Accessibilité cellulaire-Accessibilité cellulaire-Cycle cellulaire-Cycle cellulaire

CELLULECELLULE

-Homologie génétique -Virulence et invasivité

VIRUS

-Réponse immune -Réponse immune

HOTEHOTE

Virus recombinants

+

-

-

-

+

+

Viabilité Dominance Compétition

1)1) COINFECTION DE l’HOTE

2)2) COINFECTION CELLULAIRE

3)3) REPLICATION & RECOMBINAISON

4)4) SELECTION

Paramètres influençant la recombinaisonParamètres influençant la recombinaison

Conséquences : 1) VaccinationConséquences : 1) Vaccination

Risque de recombinaison entre les virus sauvages et Risque de recombinaison entre les virus sauvages et vaccinaux suite à l’utilisation de vaccins vivants (IN) lors vaccinaux suite à l’utilisation de vaccins vivants (IN) lors

d’épidémies d’IBRd’épidémies d’IBR

La recombinaison survient en situation de La recombinaison survient en situation de coinfectioncoinfection

La recombinaison survient en situation de La recombinaison survient en situation de surinfectionsurinfection lorsque le délai est court lorsque le délai est court

Conséquences : 2) EvolutionConséquences : 2) Evolution

La recombinaison dépasse la barrière d’espèce, des La recombinaison dépasse la barrière d’espèce, des recombinants interspécifiques peuvent être générés recombinants interspécifiques peuvent être générés

Evolution

Epidémiologique

ConclusionsConclusions

PerspectivesPerspectives

Etude 1 : étude in vivo, mécanisme(s) d’inhibition de la surinfection (gD, attachement, pénétration)

Etude 2 : étude in vivo des recombinants BoHV-1/BoHV-5, génération de recombinants in vivo, carte précise des recombinants (localisation des crossovers), étude de la recombinaison avec le BuHV-1 et l’ElkHV-1

Etude 3 : identification de recombinants BoHV-1/CvHV-2, tester de nouvelles combinaisons d’alphaherpèsvirus

Merci pour votre attentionMerci pour votre attention

Technology

Ph D Public Lesson