Propriétes addititives de la variance et élargissement de pic(solution)
232CHM 3102
Quelles sont les variances et déviations standards correspondant aux phenomènes de diffusion associés à l’injection, détection et la colonne si le débit est de 1 mL/min, la largeur de pic à mi-hauteur est de 15 s, le volume d’injection 25 µL et le volume de la cellule du détecteur est de 20 µL?
σ2obs.= σdet.
2 + σinj.2 + σcol.
2
= (W0.5/2.35)2 = (15s/2.35)2 = 40.72 s2
σinj.2 = (∆tinj.)2/12 = [(0.025ml/(1ml/min))*60s/min]2/12 = 0.19 s2
σdet.2 = (∆tdet.)2/12 = [(0.020ml/(1ml/min))*60s/min]2/12 = 0.12 s2
σ2col.= σobs.
2 - σinj.2 - σcol.
2 = 40.72 s2 - 0.19 s2 - 0.12 s2 = 40.41 s2
σcol.= 6.36 s
NB. La contribution a l’élargissement de pic associée a l’injection et la détection estconsiderée acceptable si celle-ci est moins de 5% de la variance observée.
Purification de protéines - stratégies
233CHM 3102
Propriétés des protéines et stratégie de purification
• Instabilité à la température• Stabilité au pH• Stabilité au solvants organiques• Nécessité d’utiliser des détergents• Sel (force ionique)• Co-facteur et stabilité d’activité• Sensibilité aux protéases• Sensibilité aux métaux• Activité redox• Poids moléculaire• Charge• Affinité biospécifiques• Modifications post-traductionelles• Hydrophobicité
Purification de protéines - stratégies
234CHM 3102
Définir la pureté nécessaire
99% Utilisation thérapeutique, études in vivo
95-99% Cristallographie, caractérisationphysico-chimiques
< 95 % Antigène pour production d’anticorps, séquençage d’Edman
Minimiser les étapes de purification
Pure
téFinitionHaute pureté
Purif. Interm.Enlever les impuretés
CaptureIsoler, concentreret stabiliser
PréparationExtraction, clarification
Étapes
Purification de protéines - stratégies
235CHM 3102
Étapes de purification
Amersham BiosciencesProtein PurificationHandbook18-1132-29
Echange d’ion
Interaction hydrophobique
Affinite
Exclusion
Phaseinverse
236CHM 3102
Chromatographie d’affinité
Purification de protéines avec 6xHis
Protéine- 6xHis Metal (Ni 2+) Chelate(tetradentate)
•Lysat cellulaire avec protéine-6xHis en condition native ou dénaturante
•Liaison His-Ni a pH 8 (pI His6 ~5.6)•Capacité ~ 200 uL billes pour 60 ugprotéine 6-His (e.g. dihydrofolatereductase).
•Lavage tampon Tris-Phosphate•Elution par compétition avec 50-500mM imidazole; diminution de pH; EDTA
Chromatographie d’affinité -Exemple
237CHM 3102
Purification 6xHis phosphatase (19 kDa) a partir de 1.2 L lysat de E. coli
Gel SDS-PAGE1: Marqueur moleculaires2: Lysat de protéines montrant la surexpression de la phosphatase3. Proteines non-retenues sur billes Ni-NTA (6 mL)4. Elution 20 mM imidazole5. Elution 100 mM imidazole6-7. Elution 500 mM imidazole
1 2 3 4 5 6 7Non-retenu (3)
20 mM (4)100 mM (5)
500 mM (5)
QIA expressionist 5th Ed., www1.qiagen.com
Chromatographie par échange d’ions
238CHM 3102
Principe de séparation
Concentration de proteines de charge opposee
Gradient de force ionique et déplacementde protéine faiblement associée à la résine
Elution progressive des protéines avec l’augmentation du gradient de force ionique
Chromatographie par échange d’ions
239CHM 3102
Types de résines
Résine Groupes fonctionnels pH oper.________________________________________________________
Anion
Diethylaminoethyl -O-CH2-CH2-N+H(CH2-CH3)2 3-8
Amino ethyl quaternaire -O-CH2-CH2-N+H(C2H5)2–CH2-CHOH-CH3 3-11
Ammonium quaternaire -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 3-11
Cation
Carboxymethyl -O-CH2-COO- 5-11
Methyl sulfonate -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-SO3- 4-11
Sulfopropyl -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3- 4-11
Chromatographie par échange d’ions
240CHM 3102
Sélection selon le pI de la protéineChar
ge
net
te
pI
102 4 6 8
Gamme de stabilité
Courbe de titration théorique
Chromatographie par échange d’ions
241CHM 3102
Sélection du pH et ordre d’élution
pH acide inférieuraux pI des protéines, interactions préférentielles avec résine échangeusede cation
pH basique supérieuraux pI des protéines, interactions préférentielles avec résine échangeused’anion.
pH plus basique. Uneprotéine positivementchargée (rouge) interagitavec la résine cationiqueet peut être séparée des autres. Alternativementles autres protéinespeuvent etre séparéesavec une résine anionique, alors que la protéine en rouge n’est pas retenue.
pH moins acide. Uneprotéine negativementchargée(bleu) interagitavec la résine anionique et peut être séparée des autres. Alternativement les autres protéines peuventetre séparées avec unerésine cationique, alorsque la protéine en bleu n’est pas retenue. résine échangeuse d’anion
résine échangeuse de cation
Chromatographie par échange d’ions
242CHM 3102
Force ionique et facteur de capacité
Ln(k
’)
1/√I
lysosyme α-chymotrypsinogen
Cytochrome C
ou: Ap: Aire du polyelectrolyteσp: Densité de chargeF : Constante de Faradayε0: Cst. Permittivitéεr: Cst dielectrique de la phase mobileI : Force ioniqueΦ: Rapport volume occupé par phase
stationnaire et mobile: Vs/Vm
Anal. Chem, 63, 1867 (1991)
Chromatographie par échange d’ions
243CHM 3102
Sélectivité et élution
Gradient linéaire
Elution par plateau
Chromatographie par échange d’ions
244CHM 3102
Diamètre des particules et résolution
Amersham BiosciencesIon Exchange Chromatography& ChromatofocusingPrinciples and Methods11-0004-21
Chromatographie par échange d’ions
245CHM 3102
Caractéristiques des résines
Chromatographie par échange d’ions
246CHM 3102
Tampons
Purifying proteins for proteomicsR.J. Simpson, p. 127
Chromatographie par échange d’ions
247CHM 3102
Exemples de séparation
Amersham BiosciencesIon Exchange Chromatography& ChromatofocusingPrinciples and Methods11-0004-21
Anion (faible)
Anion (fort)
Anion (fort)
Anion (faible)
Chromatographie par échange d’ions
248CHM 3102
Exemples de séparation
Amersham BiosciencesIon Exchange Chromatography& ChromatofocusingPrinciples and Methods11-0004-21
Résine échangeuse de cation
Chromatographie par échange d’ions
249CHM 3102
Chromatographie d’exclusion moléculaire
250CHM 3102
Phase stationnaire : pores de taille contrôléeGels (agarose, dextrane, polyacrylamide)Supports rigides (silice poreuse)
Phase mobileSolubilise l’échantillonGonfle le gelCompatible avec le système de détectionIsocratiqueEx : TRIS, phosphate, NaCl, et detergent neutre
Séparationbasée sur la taille des molécules, et donc leur aptitude à pénétrer dans le réseau de pores
Chromatographie d’exclusion moléculaire
251CHM 3102
Chromatographie d’exclusion moléculaire
252CHM 3102
Gel, structure et porosité
Harris, 6e Ed. p. 652Structure de polyacrylamide
Chromatographie d’exclusion moléculaire
253CHM 3102
Coefficient de distribution et masse moléculaire
ViV0
Vm
VR = V0 + KD Vi KD = VR – V0Vm – V0
Volume mort, V0 est determiné en utilisant le dextran blue 2000 (Mr = 2 x 106 Da). Vmcorrespond au volume de la phase mobile et est la somme du volume mort et du volume interne Vi.
Chromatographie d’exclusion moléculaire
254CHM 3102
Exemple de séparation
L’ordre d’élution est inversementproportionel à la masse moléculaire.
Utilité pour l’observation et le contrôledu repliement et de l’aggrégation de protéines. Frequemment utilisée pour désaler les protéines par exempleaprès digestion ou modification chimique.
Harris, 6e Ed. p. 653
Chromatographie d’exclusion moléculaire
255CHM 3102
Gamme de linéarite
Diamètre des pores de la phase stationnaire de polystyrene
Harris, 6e Ed. p. 653
Pour chaque phase stationnaire il existe un domaine ou le log Mr et le volume d’élution est linéaire. La gamme de masse augmente avec la dimension des pores (Ex: G2000SW, pore 13 nm, separation: 0.5-60 kDa et G5000SW, pore 100 nm, separation > 1.5 MDa)
Chromatographie d’exclusion moléculaire
256CHM 3102
Tampons volatils recommandés
pH Tampons Contre-ion pK-pour tampon
2.0 Formic acid H+ 3.75
2.3-3.5 Pyridine/formic acid HCOO- 3.75; 5.25
3.0-5.0 Trimethylamine/formic acid HCOO- 3.75; 9.25
3.0-6.0 Pyridine/acetic acid CH3COO- 4.76; 5.25
4.0-6.0 Trimethylamine/acetic acid CH3COO- 4.76; 9.25
6.8-8.8 Trimethylamine/HCI CI- 9.25
7.0-8.5 Ammonia/formic acid HCOO- 3.75; 9.25
8.5-10.0 Ammonia/acetic acid CH3COO- 4.76; 9.25
7.0-12.0 Trimethylamine/carbonate CO32- 6.50; 9.25
7.9 Ammonium bicarbonate HCO3- 6.50; 9.25
8.0-9.5 Ammonium carbonate/ammonia CO3
2- 6.50; 9.25
8.5-10.5 Ethanolamine/HCI CI- 10.0
8.5 Ammonium carbonate CO32- 6.50; 9.25
Exercise
257
Dans le but de préparer une colonne d’immunoaffinité vousdevez purifier des anticorps IgG à partir d’épanchement ascitiquede souris, quelle mode de séparation et quel type de colonneutiliserez vous et comment pourriez vous vérifier la pureté de l’échantillon?
1. Mode de séparation: Chromatographie d’exclusionmoléculaire, Ab: ~150 kDa
2. Colonne: Choisir porosité permettantune bonne selectivité
Bio-Gel P-300 60,000-400,000 Da
Exercise
258
Dans le but de préparer une colonne d’immunoaffinité vousdevez purifier des anticorps IgG à partir d’épanchement ascitiquede souris, quelle mode de séparation et quel type de colonneutiliserez vous et comment pourriez vous vérifier la pureté de l’échantillon?
3. Séparation et caractérisation
+ DTT
160 kDa
~27 kDa
~52 kDa
Pont disulfure
Chromatographie par interaction hydrophobique
259CHM 3102
Principe de séparation∆G = ∆H - T∆S
Ligand PH
Protéine
Régionhydrophobe
Ligand
PH
+ +
Support solide
Moléculed’eau
L’échantillon protéique est dissout dans un tampon de sel de haute concentration.
Les molécules d’eau près de la surface du ligand et de la surface hydrophobe de la protéine sontplus ordonnées qu’en solution (effet “protection”).
Le déplacement des molécules d’eau entourant le ligand et la région H de la protéine donne lieu a une augmentation d’entropie rendant ainsi cette interaction thermodynamiquement favorisée.
Interactions de type van der Waals augmentent entre le ligand et la région H avec l’augmentation
de la structure ordonnée de molécule d’eau en présence de sel (“salting out”).
• Fractionation of proteins by hydrophobic interaction chromatography, with reference to serum proteins. Proceedings Intl. Workshop on Technology for Protein Separation & Improvement of Blood Plasma Fractionation. Reston, Virginia, 1977, 410–421, Hjertén, S.
• Salt effects on hydrophobic interactions in precipitation and chromatography of proteins: an interpretation of the lyotropic series. Arch. Biochem. Biophys. 183 (1977) 200–215, Melander, W.,Horvath, C.
• Role of physical forces in hydrophobic interaction chromatography. Separation & Purification Methods 9 (1980) 267–370, Srinivasan, R., Ruckenstein, E.
Chromatographie par interaction hydrophobique
260CHM 3102
Facteurs affectant la chromatographie par interaction hydrophobique
Type de ligand et degré de substitutionType de support solideConcentration et type de selpHTempératureAdditifs
Chromatographie par interaction hydrophobique
261CHM 3102
Type de ligand type et degré de substitution
Cap
acité
de
liais
on
(mg p
roté
ine/
ml gel
)
C4 C6 C8µmol ligand/ml gel10 20 30
• La capacité de liaison de l’adsorbant augmenteavec la chaine alkyl et le degré de substitution.
• Un plateau de capacité de liaison est atteintlorsque le degré de substitution est elevémarquant un ancrage multipoint de la protéine et une difficulté d’élution.
• Le degré de substitution est plus faible qu’enchromato. phase inverse (d’environ 30 vs. >100 µmol ligand/ml gel).
Les gels Sepharose sont produits par Amersham Bioscienceset comprennent de l’agarose (3,6-anhydro-L-galactose)“cross-linked” formant des macropores permettant l’accès de biomolecules de 4 MDa (agarose 6%), 27 MDa (agarose 4%). Les gels superose sont des billes de 13 um diam. d’agarose(12%) “cross-linked” pour colonne FPLC.
Chromatographie par interaction hydrophobique
262CHM 3102
Type de support
Les supports solides sont typiquement hydrophilique et contiennent des gels à base d’hydrate de carbone e.g. agarose ou co-polymères synthétique greffés.
La selectivité sur un support de co-polymère ne sera pas la même que sur un support de type agarose utilisant le mêmetype de ligand.
Pour obtenir le même type de résultats il serait nécessaire de modifier les conditions d’adsorption et d’élution.
Chromatographie par interaction hydrophobique
263CHM 3102
Concentration et type de sel
Capacité de charge sur unecolonne Phenyl Sepharose en fonction de la concentration de sel initiale (AmershamPharmacia Biotech).
Formationde ppt.
• Protéines sont injectées dans un tampon de sel de haute concentration (sous le point de ppt).
• La colonne est préconditionnée avec le mêmetampon et concentration de sel.
• Les protéines sont eluées avec un gradient de selprogressivement plus dilué (tampon dilué ou avec de l’eau).
Série de Hofmeister et effet sur la ppt
Aug. de la ppt (“salting out”)
Anions: PO43-, SO4
2-, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3-, ClO4
-, I-, SCN-
Cations: NH4+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Mg2+, Ca2+, Ba2+
Aug. de l’effet chaotropique (“salting in”)
Voir: Arch. Biochem. Biophys. 183 (1977) 200–215, Melander, W.,Horvath, C.Separation & Purification Methods 9 (1980) 267–370, Srinivasan, R., Ruckenstein, E.
Chromatographie par interaction hydrophobique
264CHM 3102
pH Volume d’elution/volume protèines non-retenues
En général les interactions hydrophobiques sont diminuéesavec l’augmentation de pH possiblement avec l’apparitiond’un plus grand nombre de site négativement charge rendant la protéine plus hydrophilique.
La diminution du pH occasionneune augmentation apparentedes interactions hydrophobiquespossiblement dû a un changement de conformation rendant la protéine plus hydrophobe.
1: Soyabean trypsin inhib. 5: Enolase2: Hum. Serum Alb. 6: Ovalbumine3: Lysozyme 7: RNase4: Transferrin 8: Cytochrome C
Hjertén, S., Yao, K., Eriksson, K.-O., Johansson, B. “Gradient and isocratic High Performance Hydrophobic Interaction Chromatography of proteins on agarosecolumns”. J. Chromatog. 359 (1986) 99–109,
Chromatographie par interaction hydrophobique
265CHM 3102
Température
Généralement les interactions hydrophobiques augmententavec l’accroissement de température dû à l’effet entropique et aux forces d’attractions van der Waals.
Cependant dans certains cas les protéines peuvent êtredénaturées et changer de conformation avec l’augmentation de température donnant lieu à un changement de solubilité en solution
Chromatographie par interaction hydrophobique
266CHM 3102
Additifs
• De faibles concentrations d’alcools, détergents et d’agents chaotropique(“salting-in”) miscibles dans l’eau affaiblieront les interactions hydrophobiques et occasionneront l’élution des protéines.
• Les groupes non-polaires alkyls des alcools et détergents compétitionnentavec les protéines liées et peuvent déplacer celles-ci du ligand.
• Les effects chaotropiques des sels affectent la structure de la sphèred’hydratation des protéines liées et diminue la tension de surface de l’eau.
• L’utilisation d’additifs ne doit pas compromettre l’activité des protéines ouleur dénaturation.
• Ceux-ci peuvent etre utilisés pour reconditionner les colonnes et dissocierles protéines adsorbées.
Chromatographie par interaction hydrophobique
267CHM 3102
Exemple de séparation% A
100
80
60
40
20
Colonne: Phenyl Superose PC 1.6/5Echantillon: Fraction active d’un homogénat de cerveau de
boeuf purifié par CEA.Tampon A: 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, I mM EDTA,
1.7 M (NH4)2SO4.Tampon B: 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, I mM EDTA.Débit: 50 µl/min.Détection: A280nm ou activité GAP-3 (hydrolyse 32P-GTP)
Nice, E., Fabri, L., Burgess, A., Simpson, R., Hellman, V., Andersson, K., A multidimensional HPLC strategy for the purification of proteins and peptides for micro-sequence analysis: - The role of micropreparative ion exchange columns. 10th International Symposium of Proteins, Peptides and Polynucleotides, Wiesbaden, Germany, October 1990
Chromatographie par interaction hydrophobique
268CHM 3102
Exemple de séparation% B
100
80
60
40
20
0
Colonne: Alkyl Superose HR 5/5Echantillon: 100 µl ascite de souris contenant anticorps
monoclonal IgG1(a) ou IgG2a (b).Tampon A: 0.1M phosphate, pH 7, 2 M (NH4)2SO4.Tampon B: 0.1M phosphate.Détection: A280nm
Amersham Biosciences