MEDIMPEX LLC 2015.08.08

СТАНДАРТ PCR ТҮҮНИЙ АЖИЛЛАГААНЫ ЗАРЧИМ, ХЭРЭГЛЭЭ,

АЧ ХОЛБОГДОЛ

ҮНДСЭН ОЙЛГОЛТ

PCR машин бол (Polymerase Chain

Reaction) Буюу Полимеразын гинжин урвалд

суурилан ДНХ болон түүний хэсгүүдийг богино

хугацаанд тэрбум дахин хувилан олшруулах

зориулалттай орчин үеийн молекул биологичдийн

“лабораторийн зэвсэг” болсон чухал

төхөөрөмжүүдийн нэг юм.

Аливаа организмын эс бүрт тухайн эсийн бодисын

солилцоо, энергийн хангамж, дохио дамжуулалт

зэрэг бүхий л үйл ажиллагааны болон зохицуулгын

генетик мэдээлэлийг агуулагч геномын ДНХ-ийн

молекул ганц хувь агуулагддаг мөн ДНХ нь 2нм

диаметр бүхий маш жижиг молекул

учир түүнийг дангаар нь ялган авч

оношлогоонд ашиглахад бэрх

болсон учир генийг хувилах улмаар

олон давталттайгаар шинжилгээ,

ононшлогоо хийх технологи

боловсруулах шаардлагийн үүднээс энэ чиглэлийн

судалдаа хийгдэж.

Анх 1985 онд Kary Mullis гэх эрдэмтэн анх

организмын генийг олшруулах, тодорхойлох тус

аргийг нээсэн бөгөөд тэрээр уг ажилаараа 1993 онд

Химийн салбарт Нобелийн шагнал хүртсэн.

ДНХ нь хоёр гинжнээс тогтох, энэ хоёр гинж нь

харилцан комплементар1 буюу ижил мэдээлэл

агуулдаг гэж хэлж болох юм. Хоёр гинж

хоорондоо устөрөгчийн холбоогоор холбогдсон2

байдаг. Тэгвэл PCR нь энэхүү дурьдсан хоёр чанар

дээр үндэслэгдсэн байдаг.

Мөн PCR-ийн процессийн дараагийн нэгэн чухал

бүрдэл бол ДНХ-Полимеразе энзим3 юм.

Энэ нь ДНХ молекулын нийлэгжилтэнд оролцож

шинээр нийлэгжих дараалалын нуклеотидуудын

хоорондох фосфодиэфирийн ковалент холбоосыг

үүсгэхэд шаардагдах идэвхжлийн энергийг

бууруулах биологийн катализаторын үүргийг

гүйцэтгэнэ. Өөрөөр хэлвэл шинээр гинж нийлэгжих

үед А-Т, С-G-уудийг хооронд нь молекулын

түвшинд “гагнах” үүрэгтэй гэж ойлгож болох юм.

PCR-ийн процесс нь өндөр температурт явагддаг

учир ДНХ-Полимеразе энзим нь идэвхиэ алддаггүй

байх шаардлагатай байдаг. Ийм шинж чанар бүхий

энзимыг АНУ-н Yellowstone-д орших Халуун

рашаанаас олдсон Thermus

aquaticus хэмээх бактериас 1994

онд ялган авч одоогоор Taq DNA

polymerase нэрээр худалдааландан

ашиглагдаж байна.

ДНХ-ийн тодорхой хэсгийг

олшруулхын тулд мөн reverse болон forward гэсэн

хоёр праймер4 (primer) гэж нэрлэгдэх, днх-ийн

тодорхой дараалалтай комплементар дараалал

бүхий богино (20-30 нуклеотид) олигонуклетид

шаардагддаг. Энэхүү праймерийн сонголтод

үндэслэн судлаач өөрийн хүссэн генийг, хүссэн

дараалалыг PCR-аар олшруулан авах боломж

бүрддэг. Праймеруудыг молекул биологийн болон

химийн бодис үйлдвэрлэг компаниудаас дурын

сонголттойгоор худалдан авч болхоос гадна,

өөрсдөө лабораторийн нөхцөлд синтезлэн гарган

авч ашиглах боломжтой байдаг.

ДНХ-ийн молекулын бие биенээс тодорхой зайд орших 2 хэсгийн тодорхой дараалал

мэдэгдэж байвал тэдгээрийн дунд орших хэсгийг PCR-аар олшруулж болдог байна.

PCR-ийн урвалын үндсэн бүрдэл:

PCR-машин буюу Thermal cycler

дээжнээс ялгасан ДНХ

днх-Полимеразе энзим

Праймерууд

A,T,G,Cгэсэн 4 төрлийн нуклеотид буюу dNTP

Mg2+ Ион: Днх полимеразе энзимын кофактор

Mg ион нь өөрөөр хэлвэл энзимыг идэвхитэй ажиллахад “туслах” үүрэгтэй оролцдог ион юм.

Agilient “Sure Cycler 8800 Thermal Cycler” машины техникийн ерөнхий үзүүлэлтүүд

Өндөр нарийвчлалтай температур мэдрэгч

Нэг секунтэд температурыг 6°C- өөрчлөх хурд

Урвал явуулах 96 болон 384 үүртэй

7” LCD мэдрэгч бүхий дэлгэц

Хэрэгчлэгчдэд хялбаршуулсан программ хангамж

Урвалын явцыг Web ашиглан хянах сүлжээний систем

Extension Уртасах

Энэ үед орчны температурыг 720С болгож урвалын орчинд A,T,G,C

гэсэн 4 төрлийн нуклеотид болон днх-Полимеразе энзим байвал

праймерууд уртасаж ДНХ-нийлэгжинэ. Үүнийг Extenction-Уртасах

шат гэнэ.

Denaturation Денатураци

Орчны температурыг 940С хүргэхэд ДНХ-н хос гинж тогтворгүй болж

устөрөгчийн холбоос салж хоёр ширхэг дан гинж болж хоорондоо

сална үүнийг Denaturation-Денатурацийн шат гэнэ.

940С

Annealing

Орчны температурыг 540С болгож эргэн хөргөхөд ДНХ-н хос гинж

тус бүр дээр богино комплементар дараалал бүхий прамерууд очиж

холбогддог үүнийг Annealing шат гэнэ. Праймерын бүрдэлээс

хамааран температурыг тохируулж болдог.

Праймер 540С

1-р алхам

2-р алхам

3-р алхам

Праймер уртасах Праймер уртасах

Праймер

720С

АЖИЛЛАГААНЫ ЗАРЧИМ

PCR-ийн урвал нь денатураци, annealing, extension гэсэн 3 алхамаас тогтдог бөгөөд тус

гурван алхамыг дахин дахин давтан мөчлөг байдлаар явагддаг. Шат тус бүрийг схемчлэн

харуулав.

Зураг.1

Давхар гинжит

ДНХ молекул

Хоёр дан гинж

днх-ийн эхний шатны

денатураци ойролцоогоор

1-5 минут, харин мөчлөг

бүрт явагдах урвал 45

секундээс 1 минут,

ойролцоогоор 35-40

мөчлөгчтэйгээр явагдахад

днх-ийн прагмент

хангалттай хэмжээнд

хүртэл олширдог байна.

Зураг.2 Тодорхой нэг генийн PCR-ийн бүтээгдэхүүний тооны өсөлтийн схем.

ПОЛИМЕРАЗЫН ГИНЖИН УРВАЛЫН

ХЭРЭГЛЭЭ

ДНХ-ийн молекулыг олшруулах

Генийн байршил болон зохицуулагч дараалал

тодорхойлох

Linkage analysis (identify genes for traits/diseases)

Хортой хавдар зэрэг өвчнийг тодорхойлох

Халдварт өвчин үүсгэгчийн скринниг хийх

Микробын гаралтай мал, амьтны халдварын

шинжлгээ

Удамшлын гаралтай бодисын солилцооны эмгэг

Хүйс тодорхойлох шинжилгээ

Шүүх эмнэлгийн шинжилгээ

Эх, эцэг тогтоох шинжилгээ

Зан төрхийн экологийн судалгаа

Популяцийн генетикийн онолын болон хэрэглээний судалгаа

Физиологийн генетик болон дасан зохицолын судалгаа

Филогенетик, систематикийн судалгаа

Генетик инженерчлэл

Хувиргасан амьд организмын гаралтай хүнсний бүтээгдэхүүн тодорхойлох., гэх мэт олон чиглэлд

ашиглагдаж байна.