18 coloraciones

PROCESO DE TEJIDOS Y CITOPREPARACIÓN

CFGS Anatomía Patológica y Citología 94

UNIDAD DIDÁCTICA 18

COLORACIONES, MATERIAS COLORANTES, GENERALIDADES. 1.- INTRODUCCIÓN. 2.- TIPOS DE COLORACIÓN.

2.1.- Coloraciones topográficas. 2.2.- Coloraciones citológicas. 2.3.- Coloraciones histoquímicas. 2.4.- Coloraciones estructurales.

3.- PROCEDIMIENTOS DE COLORACIÓN.

3.1.- Coloraciones simples directas. 3.2.- Coloraciones indirectas tras la aplicación de mordiente. 3.3.- Coloraciones progresivas. 3.4.- Coloraciones regresivas seguidas de diferenciación. 3.5.- Coloraciones sobre piezas en bloque.

4.- PRINCIPALES MATERIALES COLORANTES.

4.1.- Según su origen:

4.1.1.- Colorantes naturales. 4.1.2.- Colorantes artificiales.

4.2.- Según su composición química y afinidad tintorial:

4.2.1.- Colorantes ácidos y básicos. 4.2.2.- Colorantes neutros. 4.2.3.- Colorantes indiferentes. 4.2.4.- Colorantes metacromáticos. 4.2.5.- Tinción negativa. 4.2.6.- Impregnaciones metálicas.

5.- RECOMENDACIONES GENERALES. 6.- TÉCNICA DE TINCIÓN HEMATOXILINA EOSINA. 7.-PREPARACIÓN DE HEMATOXILINA:

7.1.- Hematoxilina de Cole para 1000 cc. 7.2.- Hematoxilina de Harris para 250 cc.

8.- PREPARACIÓN DE EOSINA ALCOHÓLICA.



1.- INTRODUCCIÓN. El fundamento de toda coloración se basa en la afinidad que poseen ciertos tejidos o componentes celulares por una sustancia colorante determinada. No existe una coloración estándar que sirva para cualquier tipo de estudio histológico, sino que cada técnica de tinción posee sus ventajas y sus inconvenientes y suele exigir normalmente una fijación en particular. 2.- TIPOS DE COLORACIONES.

2.1.- Coloraciones topográficas. Son aquellas que dan una visión general de la estructura de un tejido. Son coloraciones utilizadas como técnicas de rutina, siendo su prototipo la tinción con HEMATOXILINA-EOSINA.

2.2.- Coloraciones citológicas. Permiten el estudio de las diferentes estructuras celulares, (núcleo, mitocondrias, gránulos de secreción, etc.). Su elaboración es mucho más delicada y suele exigir fijadores particulares.

2.3.- Coloraciones histoquímicas. Permiten el estudio de los componentes químicos celulares o titulares (proteínas, glucógeno, lípidos, etc.).

2.4.- Coloraciones estructurales. Permiten el estudio de los componentes de algunas estructuras tisulares como por ejemplo fibras elásticas, reticulina, etc. 3.- PROCEDIMIENTOS DE COLORACIÓN.

3.1.- Coloraciones simples directas. En estas coloraciones solamente se tiñe un determinado tejido, directamente en función de su afinidad por un colorante en particular.



3.2.- Coloraciones indirectas tras la aplicación de mordiente. Un mordiente es una sustancia que se utiliza para aumentar la captación selectiva de un determinado colorante. Puede aplicarse sobre el tejido o bien puede entrar en la composición de los líquidos fijadores o del propio colorante. La mayoría de los mordientes son sustancias oxidantes como:

El Ácido Crómico. El Permanganato Potásico. El Ácido Fosfotungstico etc.

Entre los mordientes más habituales cabe destacar a los alumbres como:

El Alumbre Potásico. El Alumbre Férrico etc.

Estos alumbres forman con algunos colorantes naturales las lacas (alumbres+colorante natural = Laca).

3.3.- Coloraciones progresivas. En ellas se detiene la coloración en el momento en que se ha obtenido el color deseado, por ejemplo las coloraciones con azul de metileno o de Toluidina.

3.4.- Coloraciones regresivas seguidas de diferenciación. En ellas se prolonga la coloración hasta que el tejido quede sobre coloreado y a continuación se utiliza un diferenciador que elimina el colorante de los tejidos que poseen poca afinidad por él. Este proceso ha de ser seguido en muchas ocasiones por el... Los diferenciadores pueden ser de distinta naturaleza, los más utilizados son:

Alcoholes de alta concentración. Ácidos como el Ácido Clorhídrico o el Acido Pícrico. Mezclas de alcoholes y ácidos o incluso los alumbres que se utilizan algunas veces

como diferenciadores.

3.5.- Coloraciones sobre piezas en bloque. En ellas la muestra es teñida antes de ser dividida en cortes, está práctica está actualmente casi abandonada, realizándose casi siempre solo coloraciones sobre cortes.



4.- PRINCIPALES MATERIAS COLORANTES.

4.1.- Según su origen:

4.1.1.- Colorantes naturales. Suelen ser de origen vegetal, por ejemplo, la hematoxilina, la orceína, el azafrán etc., aunque algunos como el carmín, tienen una procedencia animal (concretamente la cochinilla).

4.1.2.- Colorantes artificiales. Son un grupo variado de compuestos derivados de los productos de destilación de la hulla o bien de origen sintético.

4.2.- Según su composición química y afinidad tintorial:

4.2.1.- Colorantes ácidos y básicos. Son en su mayoría sales solubles en agua en las cuales se distinguen dos partes importantes:

El grupo cromóforo o cromógeno que es la fracción del colorante que realmente imparte el color.

El grupo auxocrono que es la fracción que se fija a los tejidos. El hecho de calificar a un colorante como ácido o como básico depende de la naturaleza del grupo cromóforo. Son colorantes básicos aquellos en los que el grupo cromóforo es básico y son colorantes ácidos aquellos cuyo grupo cromóforo es ácido. Como norma general los colorantes básicos tieñen estructuras ácidas o basófilas y los colorantes ácidos tiñen estructuras básicas o acidófilas. Estructura ácida ® apetencia por bases (basófila) tinción por colorantes básicos. Estructura básica ® apetencia por ácidos (acidofila) tinción por colorantes ácidos. Los colorantes básicos más utilizados son:

Hematoxilina. Azul de Metileno. Fucsina básica. Azul de Toluidina. Verde de Metilo.



Los colorantes ácidos más utilizados son:

Eosina. Verde Brillante. Fucsina Ácida. Eritrosina. Naranja.

4.2.2.- Colorantes neutros.

Son aquellos en que sus dos componentes, el ácido y el básico, son cromóforos.

4.2.3.- Colorantes indiferentes. No se trata de sales con componentes ácidos o básicos sino que actúan simplemente por disolución, por ejemplo, el Rojo Escarlata o el Sudán se disuelven en el interior de las gotas de lípidos confiriéndoles su color característico.

4.2.4.- Colorantes metacromáticos. Tiñen algunas estructuras con un color distinto al del colorante. Son principalmente colorantes básicos como el Azul de Toluidina, el cual tiñe de azul las estructuras epiteliales y conjuntivas, pero da un color rojo púrpura al mucus y sustancia fundamental del tejido cartilaginoso.

4.2.5.- Tinción negativa. El orgánulo a investigar no es teñido pero si el resto de la célula, por ejemplo, con la Hematoxilina-Eosina vemos los distintos componentes celulares teñidos, salvo las gotas de grasa que generalmente habrán quedado disueltas tras los procesos de fijación, aclaración, etc. (todo destaca menos lo que no esta teñido).

4.2.6.- Impregnaciones metálicas. Se realiza principalmente con sales de plata (impregnaciones argénticas) y con sales de oro. Se utiliza especialmente para estudio del tejido nervioso, aparato de Golgi, membrana basal, reticulina, etc. 5.- RECOMENDACIONES GENERALES.

1. Conservar los colorantes en frascos bien cerrados y al abrigo de la luz. (lugares oscuros).

2. Cambiar frecuentemente las soluciones colorantes y los medios de diferenciación.



3. Escurrir bien los portaobjetos después de cada baño.

4. Cuidar los lavados especialmente después del mordiente y las

5. Cuando sea posible vigilar la diferenciación al microscopio.

6. El tiempo de coloración es variable en función de:

a) La naturaleza de la muestra, pues los tejidos ricos en células como el tejido epitelial se tiñen con más rapidez que los que poseen escasa células.

b) Del grosor de los cortes, los cuales deben ser finos.

c) De la fijación previa (muchos colorantes exigen fijaciones particulares).

d) De la calidad comercial del colorante.

e) De la maduración de la solución colorante: Estas no deben hematoxilina

tiñen mejor tras varios días de maduración.

f) De la temperatura ambiental: Una temperatura demasiado fría puede retrasar el tiempo de coloración.

6.- TÉCNICA DE TINCIÓN HEMATOXILINA EOSINA. Después de desparafinar en la estufa:

1º Pasar por cuatro XILOLES (7 minutos cada uno, el último 10 minutos.) 2º Pasar por ALCOHOL de 100º, 96º y 90º (un paso cada uno). 3º Lavar en AGUA corriente (un paso). 4º Hematoxilina de Cole durante 10 minutos. 5º Lavar en AGUA CORRIENTE BIEN (un paso). 6º Diferenciar en ÁCIDO CLORHÍDRICO al 1% (según). 7º Lavar en AGUA corriente, 5 minutos. 8º Teñir en EOSINA alcohólica, 5 minutos. 9º Pasar por cuatro cambios de ALCOHOL de 96º, (un paso cada uno). 10º Pasar por dos cambios de ALCOHOL de 100º. 11º Pasar por dos cambios de XILOL (un paso cada uno). 12º Secar y montar.



7.-PREPARACIÓN DE LA HEMATOXILINA.

7.1.- Hematoxilina de Cole para 1000cc. COMPONENTES:

· Hematoxilina 1.5 g · Alcohol de 100º 12.5 cc · Solución Yodoalcohólica al 1 % 50.0 cc · Agua destilada 250.0 cc · Solución saturada de Alumbre Amoniacal hasta 1000 cc 687.5 cc

SOLUCIÓN YODOALCOHÓLICA:

· Alcohol de 100º 100.0 cc · Yodo sublimado 1.0 g

PREPARACIÓN: Disolver 1.5 gramos de Hematoxilina en 12.5 cc de alcohol de 100º, añadir 250 cc de agua destilada, 50 cc de solución yodoalcohólica al 1 %, y 687.5 cc de solución saturada de Alumbre amoniacal hasta conseguir 1 litro. Hervir, enfriar y filtrar.

7.2.- Hematoxilina de Harris para 250 cc. COMPONENTES:

· Hematoxilina 1 g · Alcohol de 96º 10 cc · Alumbre Potásico o Sulfato de Alúmina o Amoníaco 20.0 g · Agua destilada 217.0 cc · Óxido de Mercurio amarillo 687.5 cc · Ácido Acético Glacial 3 cc

PREPARACION: Disolver 1 gramo de Hematoxilina en 10 ml de alcohol de 96º y 20 gramos de Alumbre Potásico en 217 ml de agua destilada. Al cabo de 24 horas mezclar las dos soluciones, añadiendo 0.5 gramos de Óxido de Mercurio amarillo, calentar la solución, enfriarla y después filtrar. Esta solución tiñe en 1-2 minutos de su preparación.



Deshidratación (Alcoholes crecientes)

Hidratación (Alcoholes

decrecientes)

Limpiar

Inhibe la acción del HCl y limpia

Limpiar

8.- PREPARACIÓN DE EOSINA ALCOHÓLICA. Solución A ® 100 ml de alcohol de 70º más 1 gramo de Eosina Amarillenta. Solución B ® 100 ml de alcohol de 100º. Eosina alcohólica final ® Solución A más Solución B.

TÉCNICA DE PAPANICOLAU

Alcohol de 80º 30 segundos 1 Alcohol de 70º 30 segundos 2 Alcohol de 50º 30 segundos 3 Agua destilada 30 segundos 4

(Solución no alcohólica) Hematoxilina de Harris 5 minutos 5 Agua destilada 30 segundos 6

(Diferenciador) HCl 0.25% 6 veces 7 Agua corriente 6 minutos 8 Agua destilada 30 segundos 9 Alcohol de 50º 30 segundos 10 Alcohol de 70º 30 segundos 11 Alcohol de 80º 30 segundos 12 Alcohol de 95º 30 segundos 13

(Solución alcohólica) Orange G 90 segundos 14 Alcohol de 95º 30 segundos 15 Alcohol de 95º 90 segundos 16 EA-50 ó EA-65 90 segundos 17 Alcohol de 95º 30 segundos 18 Alcohol de 95º 30 segundos 19 Alcohol de 95º 30 segundos 20 Alcohol de 100º 30 segundos 21 Alcohol-Xilol (1/1) 30 segundos 22 Xilol 30 segundos 23

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