Lo de amarrillo Observacin de Bacterias Introduccin

Son tcnicas que permiten observar microorganismos en funcin de la capacidad de los mismos para

retener o no determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la clula y del colorante.

Los colorantes pueden ser de distintos tipos:

Catinicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las clulas y las

tien. Ejemplos: azul de metileno, cristal violeta, safranina.

Aninicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tien las

clulas, sino el entorno. En este caso se habla de tincin negativa. Ejemplos: eosina,nigrosina.

Liposolubles. Se mezclan con los lpidos celulares y los tien. Ejemplo: negro sudn.

Las tinciones pueden ser:

Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas tienen una composicin

qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un

colorante. El colorante tie las clulas (azul de metileno, safranina) o no (nigrosina).

Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de clulas tienen distinta composicin

qumica, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo que permite clasificar los

microorganismos en diferentes grupos, segn su capacidad de tincin. En este apartado estn dos

tinciones de importancia taxonmica y mdica: la tincin de Gram y la de cido-alcohol resistencia (de

Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan ms de un colorante.

Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composicin

qumica, de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tincin de esporas, de flagelos,

de paredes celulares, de corpsculos metacromticos. Pueden utilizarse uno o ms colorantes.

a) Azul de metileno (Tincin positiva). Permite teir el interior celular.

Tie microorganismos procariticos (vivos o muertos). Los eucariticos slo se tien si

estn muertos. Algunas estructuras, como los corpsculos metacromticos, se tien ms

intensamente con este colorante que el resto de la clula.

b) Nigrosina (Tincin negativa). Se trata de un colorante aninico, que no penetra en el

interior celular. Proporciona una visin de la forma y el tamao celulares al observarse los

microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.

Objetivos

1. Realizar una tincin simple de bacterias procedentes de distintas muestras

naturales.

2. Realizar dos tipos de fijaciones bacterianas y saber en qu casos se

recomienda una u otra.

3. Observar la morfologa bacteriana y aprender a distinguir los distintos tipos

de agrupaciones que existen.

4. Practicar con el microscopio al mximo aumento y con el correcto empleo

del aceite de inmersin.

MATERIAL

Mechero Bunsen o de alcohol

Asa de siembra o aguja ebmangada

Pinzas

Portaobjetos

Muestras bacterians de origen natural: yogurt, vinagre, sarro dental, suelo,etc.

Colorantes para tincin:

a) Solucin de cristal violeta al 1%

b) Solucin de safranina al 0.5%

c) Azul de metileno al 1%

Microscopio y aceite de inmersin

BACTERIAS DEL YOGURT

El yogur es un producto lcteo producido por la fermentacin natural de la leche. A escala industrial se

realiza la fermentacin aadiendo a la leche dosis del 3-4% de una asociacin de dos cepas bacterianas:

el Streptococcus termophilus, poco productor de cido, pero muy aromtico, y el Lactobacillus bulgaricus,

muy acidificante. En esta preparacin se podrn, por tanto, observar dos morfologas bacterianas distintas

(cocos y bacilos) y un tipo de agrupacin (estreptococos, cocos en cadenas arrosariadas). Adems, el

tamao del lactobacilo (unos 30m de longitud) facilita la observacin aunque no se tenga mucha

prctica con el enfoque del microscopio.

Procedimiento

1. Extension: Realizar el frotis disolviendo una mnima porcin de yogur en una pequea gota

de agua.

2. Fijacin Fijar con metanol o Xilol para eliminar parte de la grasa.

3. Teir Apoyar el portaobjetos sobre el soporte de tinciones y aadir unas gotas de azul de

metileno ocon un colorante cualquiera de los arriba indicados durante 4-5 minutos.

4. Lavar con agua destilada

5. Secar. pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero de alcohol,

sin permitir que llegue a hervir, hasta que se seque.

6. aadir una gota de glicerina y colocar el cubreobjetos

7. Observar primero con el objetivo 40; luego se aade aceite de inmersin y se observa

con el objetivo 100

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Resultados

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Contestar las siguientes preguntas:

1) El yogur es un alimento ms fcilmente digerible que la leche, por qu?

R/. Es debido a que los cultivos de bacterias que contiene el yogur rompen las cadenas de lactosa y la

hacen mas facil de digerir. el proceso de hacer yogur tambien modifica las protenas de la leche

haciendolas mas digerible.

2) En casos de intolerancia a la lactosa, qu alimento ser ms fcilmente tolerado, la leche o el yogur?

Por qu?

R/. El yogur, porque es un derivado de la leche y se elabora mediante la fermentacin bacteriana de

leche que transforma a los azucares en cidos, as la lactosa se convierte en cido lctico. El menor

contenido de lactosa del yogur con respecto a la leche, hace que sea mejor tolerado por quienes no

consumen leche habitualmente y ademas, permite comenzar a tolerar la lactosa.

3) Qu papel desempea cada una de estas bacterias en la formacin del yogur a partir de la leche?

R/. Tanto Lactobacillus bulgaris como Streptococcus thermophilus realizan

la fermentacin del cido lactico. Transforman los azucares presentes en la leche (lactosa formada por

glucosa y galactosa) en cido lactico. se trata de un proceso anaerobico que confiere acidez al yogur.

4) Qu otros procesos conoces en que se empleen bacterias para la elaboracin de algn producto

alimenticio?

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Proceso Organismo Papel en proceso molcula

original

Producto

final

Fabricacin de

la cerveza

Saccharomyces

cerevisidae(levadura)

Fermentacin

alcohlica y

carbonatacin

Glucosa i/o

fructosa

Etanol

+CO2

F. del pan S. cerevisidae Fermentacin y

carbonatacin

Azucar Co2

F. del vinagre Bacterias del cido

actico

Oxidacin aerobios

estrictos

Alcohol

(etanol)

Acido

actico

BACTERIAS DEL VINAGRE

El vinagre es una solucin acuosa rica en cido actico resultante de la fermentacin espontnea del vino

o de bebidas alcohlicas de baja graduacin. La acetificacin del vino es producida por bacterias

aerbicas del cido actico, principalmente Acetobacter aceti, aunque tambin Gluconobacter. Se trata

de bacilos rectos con flagelos polares.

1. Tomar con una aguja enmangada una pequea porcin de madre de vinagre natural o de

la telilla que se forma sobre la superficie de los vinos agriado.

2. Extender la muestra en el portaobjetos con una gota de agua y hacer el frotis.

3. Dejar secar y fijar con calor.

4. Teir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar.

BACTERIAS DEL SARRO DENTAL

El sarro dental es un depsito consistente y adherente localizado sobre el esmalte de los dientes. Est

constituido principalmente por restos proteicos, sales minerales y bacterias junto con sus productos

metablicos. La flora bacteriana de la cavidad bucal es muy variable dependiendo de las condiciones

que se den en el momento de hacer la preparacin, pero suelen abundar bacterias saprfitas,

pudindose observar gran variedad de morfologas: espiroquetas, cocobacilos, diplococos y bacilos.

1. Con una aguja enmangada tomar una pequea porcin de sarro dental y disolverla en una

gota de agua sobre el portaobjetos.

2. Dejar secar y fijar con calor.

3. Teir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar.

BACTERIAS DEL SUELO

La variedad de bacterias que pueden aparecer en una muestra de suelo es prcticamente infinita,

muchas de ellas no cultivables en los laboratorios y algunas, incluso, desconocidas para los microbilogos.

Para recoger la muestra y hacer el frotis basta con dejar parcialmente enterrado en vertical un

portaobjetos en la tierra de una maceta o de un jardn. Despus de varios das, las bacterias se habrn

adherido al vidrio y slo habr que fijarlas por calor y teirlas con un colorante cualquiera. Previamente

hay que limpiar los bordes del portaobjetos, as como la parte que no se va a teir.

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Preguntas:

1) Cuales son las distintas formas y asociaciones que pueden presentar las bacterias? Explicarlas y haz un

dibujo esquemtico de cada una de ellas.

2) Enumera 5 diferencias entre las bacterias y otros tipos de clulas.

Caractersticas Procariotas Eucariotas

Tamao de 0,5 micras a 2 micras de 2 a 200 micras

membrana

nuclear

sin membrana. No

hacen mitosis

Con membrana. Hacen mitosis

Orgnulos Ribosomas y mesosomas Ribosomas, mitocondrias, vacuolas, etc

sin mesosomas

ADN Una molcula. Sin

cromosomas

De una a varias molculas. Forman

cromosomas

Movimiento Flagelos de estructura

simple

Cilios y flagelos de estructura compleja

Pared celular Delgada y de

peptidoglicano

Slo la presentan los vegetales

(celulosa), los hongos (quitina)

Conclusin

Durante este experimento pudimos observar las diferentes formas que tienen las bacterias.

La mayora de los enterococos, estreptococos y dems grupos o genero microbianos son

algunos patgenos y no patgenos, de estos se pueden preparar fermentaciones, que mediante un largo

proceso,llegan a ser elaboradas en productos comestibles, garantizando la mayor seguridad al consumir

ese producto fermentado.

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Este es de la revista SCIELO

MICROBIOLOGA BSICA

Coloracin de azul de metileno como alternativa para determinar la viabilidad de larvas libres de Trichinella spiralis

V.R. Randazzo*, S.R. Costamagna

Ctedra de Parasitologa Clnica. Universidad Nacional del Sur San Juan 670 (8000) Baha Blanca (Argentina) *Correspondencia. E-mail: viviana.randazzo@uns.edu.ar

RESUMEN

El objetivo de la presente investigacin fue determinar si la coloracin con azul de metileno, de probada utilidad para demostrar la viabilidad de protoesclices deEchinococcus granulosus, puede evidenciar tambin la viabilidad de larvas libres de Trichinella spiralis. Para ello se utilizaron tres suspensiones de larvas de T. spiralis (M1, M2 y M3), las que fueron expuestas a diferentes condiciones y observadas a distintos tiempos: M1 se expuso a -30 C y se observ a los 70 das; M2 a 80 C durante 5 minutos y se observ inmediatamente, y M3 se mantuvo a 4 C durante todo el experimento, como testigo del 100% de vitalidad. Cada suspensin contena 500 estadios larvarios libres. Se emplearon 100 l de solucin de azul de metileno 1:10 000 en agua destilada, agregados a igual volumen de suspensin de larvas, y las muestras fueron observadas al microscopio ptico para evaluar la motilidad. Los resultados evidenciaron que cuando las larvas de T. spiralis estaban muertas (M1 y M2), el 100% se coloreaban totalmente de azul en su interior, y las estructuras internas, en relacin con la capa quitinosa, aparecan retradas y algunas fragmentadas. En la suspensin testigo M3 las larvas no se coloreaban, y como prueba adicional de viabilidad se pudo observar su tpico movimiento en espiral en el 100% de ellas.

Palabras clave: Viabilidad; Trichinella spiralis; Azul de metileno

ABSTRACT

Methylene blue test for the determination of viability of free larvae of Trichinella spiralis. The present research was carried out with the purpose of determining whether or not the methylene blue test could also evidence viability of free larvae of Trichinella spiralis, taking into account its usefulness in the determination of viability of protoscolices in Echinococcus granulosus. To this end, three T. spiralis larval suspensions (M1, M2 and M3) were used, each containing 500 free larval stages. A hundred l of methylene blue solution 1:10000 in distilled water were added to 100 l of the larval suspension. Larvae were observed under optical microscopy to evaluate motility. M1 was exposed to -30 C and could be observed on day 70, M2 was exposed to 80 C during 5 minutes and it was immediately observed under optical microscopy, and M3 was maintained at 4 C during the experiment as a 100% viability testing. Our results indicated that when T. spiralis larvae took up 100% of the methylene blue stain (M1 and M2), their inner structures appeared not only retracted but also stained blue, whereas in the M3 suspension test, larvae remained unstained and 100% of them showed their typical spiral-like movement.

Key-words: Viability; Trichinella spiralis; Methylene blue

La trichinellosis es una zoonosis parasitaria originada por el nematodo Trichinella spiralis, el que puede infestar un gran nmero de mamferos, entre ellos el hombre. En nuestro pas, la provincia de Buenos Aires es el rea de mayor endemicidad (1, 2, 3, 4, 5, 6). La infeccin se produce por el consumo de carne de cerdo cruda o mal cocida que contiene larvas viables de T. spiralis. La coloracin del azul de metileno es utilizada como test de exclusin para demostrar viabilidad de protoesclices de Echinococcus granulosus (2, 11). En el presente estudio se evalu la utilidad de esta coloracin para poner en evidencia la viabilidad de larvas libres de T. spiralis. Esto permitira disponer de un mtodo sencillo y econmico al momento de tener que comprobar la ausencia de larvas viables. La cepa de T. spiralis que se utiliz en este estudio fue tipificada por PCR en el Centro Internacional de Referencia, en Roma (Italia), por el Dr. Edoardo Pozzio. Se utilizaron tres suspensiones de larvas de T. spiralis recientemente obtenidas por digestin enzimtica de msculo de ratn infectado, de acuerdo con metodologa ya descrita (9). Fueron rotuladas como M1, M2 y M3, y cada una contena 500 estadios larvarios libres por ml de agua

http://www.scielo.org.ar/scielo.php?pid=S0325-75412010000200005&script=sci_arttext#amailto:viviana.randazzo@uns.edu.arhttp://www.scielo.org.ar/scielo.php?pid=S0325-75412010000200005&script=sci_arttext#refhttp://www.scielo.org.ar/scielo.php?pid=S0325-75412010000200005&script=sci_arttext#refhttp://www.scielo.org.ar/scielo.php?pid=S0325-75412010000200005&script=sci_arttext#ref

destilada. En trabajos previos hemos demostrado que las larvas de T. spiralis mueren a -30 C en un lapso de 65 das, e inmediatamente a 80 C (6). Teniendo en cuenta estas caractersticas, M1 fue sometida a -30 C durante 70 das y M2 a 80 C durante 5 minutos, para asegurar que el 100% de las larvas muriesen. M3 fue conservada a 4 C como testigo de 100% de viabilidad, ya que es sabido que a esta temperatura las larvas viven ms de 250 das (6). Para los experimentos se utilizaron 100 l de solucin de azul de metileno (AM) 1:10 000 en agua destilada, agregados a igual volumen de suspensin de larvas, y se observ al microscopio ptico. Los resultados evidenciaron que cuando las larvas estaban muertas (M1 y M2), el 100% se coloreaba totalmente de azul en su interior (Figura 1), mientras que en la suspensin testigo M3 las larvas no se coloreaban (Figura 2). La prdida de viabilidad de las larvas se evidenci, adems, por la ausencia de movimientos, por la tpica postura de "coma", producto de la retraccin de las estructuras internas en relacin con la capa quitinosa, y por la fragmentacin de esta ltima, lo que habra facilitado la penetracin del colorante y as, determinar el estado de vitalidad de las larvas.

Figura 1. Larvas de T. spiralis teidas con azul de metileno. Se observan cuatro larvas muertas, que aparecen

teidas de color azul, con forma de coma e inmviles, y una larva viva de aspecto espiralado y sin colorear (flecha).

Figura 2. Larva de T. spiralis viable. Puede visualizarse su forma espiralada y su estructura interna conservada.

La viabilidad de las larvas utilizadas como testigo se confirm, adems, por el tpico movimiento en espiral en el 100% de ellas. Todos los experimentos fueron realizados por cuadruplicado, y en cada observacin se contaron 500 larvas, lo que permiti estimar en todos los grupos la prdida de viabilidad. Para el anlisis estadstico se utiliz el test "t", con lo que pudo establecerse que no hubo diferencias significativas (p < 0,05). La cantidad de larvas viables de T. spiralis consumidas determina, junto con otros factores, la

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variabilidad e intensidad de los signos y sntomas clnicos que presentar el hospedador. Si se quisiera aplicar esta tcnica sobre carne de cerdo, a los fines de determinar si esta es apta o no para el consumo humano, se deber cumplir inicialmente con la tcnica de digestin enzimtica artificial legislada para cada regin de Argentina (10). A partir de la liberacin de las larvas en el digesto, se deber emplear la coloracin de azul de metileno para determinar el verdadero potencial infectante de la carne procesada. La Ley Sanitaria de Carnes N 11123 de la provincia de Buenos Aires (Argentina), en su seccin numeral 9.5.50, dice: "Comprobada la presencia del parsito de Trichinella spiralis en cualquier estado en que se halle se decomisar la res" (10). Para la legislacin vigente en Argentina (Ley Federal Sanitaria de Carnes 22375, complementada por el Decreto N 4238/68 y por la Resolucin 555/2006), tanto a nivel provincial como nacional, la deteccin de larvas de este nematode en carnes o subproductos crnicos sera causa suficiente para prohibir su comercializacin y consumo, independientemente de si las larvas estn vivas o muertas. Considerando que hasta el momento, la evaluacin de la viabilidad de las larvas se determinaba observando sus movimientos caractersticos y el constante enrollamiento y desenrollamiento, y que los signos de mortalidad estaban dados por la ausencia de movimiento y la tpica postura de coma (7, 8), la metodologa propuesta posibilitara determinar mediante una tcnica rpida, sencilla y econmica, con mayor certeza, la viabilidad del estadio larvario de T. spiralis. Un elevado porcentaje de larvas viables (sin colorear) indicara infeccin reciente, lo que nos permitira sealar la verdadera peligrosidad de cada animal en particular y predecir su impacto epidemiolgico. Adems, esta coloracin constituye una herramienta simple y econmica para determinar la verdadera cantidad de larvas vivas que se utilizan en experiencias de laboratorio, lo cual permitira estandarizar las dosis necesarias de cada cepa o especie deTrichinella para generar determinado efecto, a los fines de lograr resultados internacionalmente vlidos y reproducibles. De esta manera, queda demostrada la utilidad del colorante azul de metileno -despus de haber realizado la correspondiente digestin enzimtica artificial- para diferenciar infecciones recientes de T. spiralis(larvas vivas) de otras de larga data (larvas muertas), tanto para fines epidemiolgicos o estudios de brotes como para investigaciones de laboratorio. La muerte de los estadios larvarios producira alteraciones en la cubierta del parsito, lo que facilitara la penetracin del colorante al interior de las larvas.

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