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FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
Bioquímica Clínica Biotecnología
Químico Farmacéutico Biólogo
MANUAL DE FARMACOGNOSIA
M en C Paola Malinalli Hernández Hernández
Abril 2015
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PRÓLOGO
El presente manual de laboratorio está conformado por una serie de técnicas básicas en el laboratorio de orgánica junto con la metodología para realizar bioensayos de toxicidad con artemia salina.
La finalidad de este laboratorio es que los estudiantes desarrollen plenamente su capacidad de plantear y proponer soluciones a problemas comunes en la elaboración de un protocolo de investigación en productos naturales, empleando las habilidades desarrolladas en sus cursos anteriores.
Como se mencionó, este manual es una recopilación de métodos básicos de laboratorio que los estudiantes han realizado en otros cursos y que, en este laboratorio, utilizarán como herramienta para separar extractos de organismos naturales (plantas medicinales) y probar su toxicidad; así como interpretar los datos obtenidos con este bioensayo. También la elaboración y la presentación escrita y oral de los diferentes proyectos de investigación y los resultados obtenidos.
Quien preparó este manual hace del conocimiento del lector que no recibió ni recibirá percepción económica alguna por el mismo, y que fue diseñado a solicitud expresa de la Coordinación de la carrera de QFB de la Universidad Simón Bolívar con el objeto de que sea empleado en actividades puramente académicas de la misma institución y con el cometido único de cumplir con los estándares de excelencia que se exigen para las instituciones particulares de educación superior, no responsabilizándose en lo absoluto de la comercialización o lucro que de él se pueda llevar a cabo.
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REGLAMENTO GENERAL DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA.
1 OBLIGACIONES
1.1 Los alumnos deberán presentarse a sus prácticas de laboratorio con bata blanca y limpia.
1.2 Los alumnos deberán entrar al laboratorio con el cabello recogido. 1.3En los laboratorios queda prohibido fumar, consumir alimentos o bebidas. 1.3 Los alumnos no pueden usar zapato abierto tipo huarache ni zapato de tacón alto. 1.4 Los celulares y equipo de radio comunicación deberán permanecer apagados dentro
del laboratorio durante el tiempo que dure la práctica. 1.5 Los alumnos deberán permanecer en el laboratorio durante todo el tiempo que dure la
práctica. 1.6 Se prohíbe tirar desechos sólidos en los canales o tarjas, en cajones y fuera del bote
de basura. 1.7 Queda estrictamente prohibido sentarse en las mesas de laboratorio. 1.8 Se prohíbe estrictamente, utilizar el laboratorio como sitio de reuniones sociales. 1.9 Todo préstamo de material, equipo, cristalería reactivos, ejemplares y preparaciones
de colección, se harán una vez llenado el vale correspondiente. 1.10 La forma 1 y la credencial de laboratorio de la persona que se hace responsable,
serán entregados a la asistente de laboratorio, la cual devolverá la credencial en el momento en que se regrese el material.
1.11 El material de trabajo deberá ser tratado adecuadamente, entregándolo limpio, seco, completo y en buen estado.
1.12 Cualquier muestra que se guarde en los refrigeradores, congeladores, incubadoras, estufas, hornos y muflas deberá estar etiquetada con la siguiente información:
1.12.1 Nombre completo del alumno y semestre 1.12.2 Fecha de almacenaje periodo que se mantendrá almacenada 1.12.3 Tipo de muestra 1.12.4 Nombre de la asignatura o proyecto 1.12.5 Profesor responsable. 1.13 Los frascos no deben tomarse de la tapa o del asa lateral sino tomarse con ambas
manos, una en la base y otra en la parte media. 1.14 Los estudiantes deberán poner candado al casillero asignado y entregar una copia
de la llave, bien identificada a la coordinación de laboratorios. 1.15 Los alumnos deben abstenerse de dejar sus objetos personales sobre los lugares
de trabajo. 1.16 El usuario debe conservar en buen estado el mobiliario, equipo y material de las
áreas académicas. 1.17 Al término de cada sesión el laboratorio deberá permanecer limpio, colocar los
bancos debajo de las mesas y lavarse las manos antes de salir del laboratorio. 1.18 Queda estrictamente prohibida la entrada a personas ajenas a los laboratorios. 1.19 La entrada a áreas de balanzas y equipos será por medio de una bitácora
anotando los datos correspondientes y entregando la credencial de laboratorios de la USB, a la asistente de laboratorio.
1.20 Al finalizar el semestre los casilleros deberán permanecer limpios y abiertos, de lo contrario se abrirán los candados y la coordinación de laboratorios no se hace responsable de su contenido.
1.21 Al escuchar la alarma de emergencia, los alumnos, personal académico, asistentes y responsables de laboratorio deberán participar activamente en los simulacros organizados por el comité de protección civil, de la USB, teniendo en cuenta las siguientes instrucciones: cerrar las llaves de gas y apagar cualquier aparato con el que esté trabajando. Replegarse rápidamente o salir de manera ordena hacia las zonas de seguridad.
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2 RESPONSABILIDADES
2.1 El alumno deberá realizar una investigación bibliográfica antes de entrar a cada sesión de laboratorio.
2.2 El alumno debe asegurarse de comprender lo que va a realizar para llevar a cabo con éxito el experimento.
2.3 El usuario debe asegurarse de conocer el manejo de equipo y sustancias, en caso contrario dirigirse al responsable.
2.4 El alumno deberá analizar las técnicas experimentales para tener presente los puntos que se plantean.
2.5 Antes de iniciar la práctica o proyecto el alumno deberá recopilar todo el material y equipo necesarios para llevar acabo el experimento.
2.6 El material, equipo y reactivos, deberán ser solicitados por el personal académico antes de iniciar el semestre y por los alumnos ocho días naturales antes de cada práctica.
2.7 El solicitante revisará y recibirá el material constatando que se encuentre en buen estado, de lo contrario dará aviso a la asistente de laboratorio.
2.8 Los alumnos, personal académico y personal externo son responsables de cualquier daño que cause a instalaciones, equipo y material proporcionado.
2.9 El alumno deberá colocar todos los objetos personales en los cajones de las mesas o alejados del área de trabajo.
2.10 Se prohibe experimentar fuera de las fechas y los horarios normales de cada materia, a menos que sea por autorización de la coordinación y bajo la vigilancia del responsable de la materia.
2.11 Cada equipo deberá contar con lo siguiente material extra:
1 toalla para limpiar y secar
Un plumón para marcar material de vidrio
Cinta maskingtape
Frascos para residuos 2.12 El usuario deberá mantener limpio y ordenando su área de trabajo. 2.13 La puerta del laboratorio deberá permanecer cerrada y libres de obstáculos el
tiempo que dure la práctica. 2.14 La entrada a las áreas de preparación se hará únicamente, bajo la supervisión de
algún profesor. 2.15 Los alumnos tienen prohibida, la entrada a bodegas y almacenes. 2.16 El alumno dará aviso al personal académico de cualquier accidente que ocurra. 2.17 Los alumnos, personal académico, asistentes de laboratorio y coordinadores
deberán conocer el sistema de alerta, zonas de seguridad, ruta de evacuación, equipo para combatir siniestros y las medidas de seguridad establecidas para cada laboratorio.
3 SANCIONES
Disciplinarias. 3.1.1 Si cualesquiera de los puntos II y III no son cumplidos perderá
automáticamente el derecho a presentar exámenes prácticos. 3.1.2 El material que se encuentre dentro de los refrigeradores,
congeladores, incubadoras, estufas, hornos y muflas, y no esté debidamente etiquetado será desechado y la coordinación de laboratorios no se hace responsable por dicho material.
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3.1.3 La coordinación de laboratorios no se hace responsable del material que permanezca en las áreas de uso común después de las prácticas
3.2 Económicas. 3.2.1 Los daños ocasionados al material de prácticas, equipo, mobiliario e
instalaciones tendrán que ser reparados por cuenta y gastos de la(s) persona(s) involucrada(s) en el daño, (entregando copia de factura) en un plazo no mayor de diez días hábiles. Se firmará un vale indicando el material y sus especificaciones y se retendrá la credencial del responsable.
3.2.2 Los importes causados por la reparación a instalaciones y equipo, serán cubiertos por la(s) persona(s) involucrada(s) en el daño.
3.2.3 Por incumplimiento de los puntos 4.2.1 y 4.2.2, se negará el derecho al uso de las instalaciones de laboratorio de la materia en la que ocurrió el deterioro o daño al material o equipo mencionado.
3.2.4 El alumno que al terminar el ciclo escolar tiene algún adeudo, no tendrá derecho a presentar exámenes finales.
4 La Rectoría, Dirección de Facultad, las Coordinaciones de licenciatura y de
laboratorios de la USB se reservan el derecho de analizar y dictaminar sobre las
cuestiones no contempladas en este reglamento.
Reglamento de la asignatura:
La hora máxima permitida para entrar a clase y tener asistencia, con bata, es 10 minutos después de iniciada la misma.
No se permite ausentarse durante la clase.
Las faltas se justifican por enfermedad y con el visto bueno de la Coordinación Académica.
En caso de algún retraso del grupo por situaciones académicas, avisar a la profesora para que no se de la clase por vista.
Las faltas por eventos académicos (congresos, simposios) fuera de la USB son justificadas.
Cada estudiante deberá traer el manual impreso, engargolado y completo desde la primera sesión práctica de este laboratorio.
A cada equipo le tocará organizar y etiquetar los frascos para residuos de una sesión de laboratorio, esto se decidirá por sorteo.
No puede reponerse la inasistencia a una sesión de laboratorio.
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SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA
Existen equipos protectores para las diferentes partes del cuerpo:
Ojos y rostro: gafas con escudo de protección lateral, careta.
Vías respiratorias: purificadores de aire, extractores, campanas.
Extremidades (manos, pies y piernas): guantes, zapatos de seguridad y botas.
Tronco: bata, delantales.
Equipo de Protección
Lentes de Seguridad. La protección de los ojos debe ser exigida para todo el personal en cualquier laboratorio donde se manejen y almacenen reactivos químicos. Ninguna persona debe entrar al laboratorio sin una adecuada protección de los ojos, no importa la actividad que desarrolle dentro del laboratorio (preparación de reactivos, lavado de material, consulta de bibliografía, etc). Nunca deben usarse lentes de contacto blandos aun cuando se lleven lentes de seguridad, ya que gases y vapores pueden concentrarse debajo y como éstos no pueden ser removidos rápidamente si algún contaminante entra el ojo, puede causar daños permanentes. No obstante no existen fundamentos para no recomendar el uso de lentes de contacto duros, a menos de que la graduación sea lo suficientemente pronunciada en padecimientos como el queratocono (en casos de distorsión severa de la córnea), es preferible no emplearlos, sino hacer uso de los anteojos, y sobre de ellos los lentes de protección. Tómese en cuenta que los lentes de policarbonato pueden ser opacados por los vapores de los disolventes orgánicos, como acetona, aun con el empleo de los lentes de protección.
Guantes. El contacto cutáneo es una fuente potencial de exposición a materiales peligrosos, por lo que es importante tomar en cuenta las siguientes consideraciones con el empleo de guantes: éstos deben ser usados siempre que sea necesario manejar materiales corrosivos o tóxicos. Si se van a manejar objetos punzo-cortantes (tubo de vidrio), debe considerarse que los guantes de hule pueden ser traspasados por ellos, por lo que se recomienda emplear guantes de carnaza o de algodón grueso. Si se van a manejar materiales muy calientes o muy fríos, deben de emplearse guantes térmicos. Existen diferentes tipos de guantes disponibles en el mercado; la selección de éstos dependerá de la operación que se vaya a llevar acabo. Bata de Laboratorio. El uso de la bata de laboratorio previene el contacto de la piel con pequeñas cantidades de reactivos químicos ocasionados por salpicaduras o derrames accidentales durante el trabajo de laboratorio. La bata de laboratorio es, ante todo una protección. La ropa común representa un peligro en casos de accidentes debido al tipo de materiales sintéticos, de baja resistencia al ataque de reactivos químicos, y que por lo general, son fácilmente inflamables, por lo que siempre se debe utilizar una bata de trabajo sobre la ropa. La bata de algodón es la más recomendable por su mayor resistencia, en comparación de otros materiales sintéticos como el rayón o poliéster. Así mismo es mejor una bata de manga larga y de un largo superior al de la ropa común, para mayor protección.
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Equipos de seguridad más especializados
Algunos equipos de protección se emplean menos frecuentemente en los laboratorios de química orgánica, si bien ocasionalmente se requiere echar mano de ellos ante eventualidades, como por ejemplo en el caso de un derrame. Así pues, a continuación se les citará brevemente.
Botas. Las botas cumplen con la función útil de proteger los pies contra caídas accidentales de materiales peligrosos o de derrames ante los cuales se deba uno de enfrentar. Deben en la medida de lo posible ofrecer confort al pie y usarse según medida, puesto que si se les utiliza de un número mayor al del pie pueden ocasionar traspiés y caídas. Al hacer uso de ellas, se debe de estar conciente de que, dependiendo de la altura de la caña, con el uso se generará calor sobre pies y piernas, lo cual se traduce en cierta incomodidad, sobretodo si se es intolerante a situaciones de bochorno.
Los materiales del que están manufacturadas varían dependiendo del uso que se les vaya a dar, pudiendo ir desde el polietileno y ser desechables, hasta estar confeccionadas en materiales resistentes a sustancias químicas agresivas y con casquillo metálico para la protección del usuario. Los largos de la caña varían: pueden limitarse a proteger los tobillos (ANKLE HIGH), hasta por debajo de la rodilla (KNEE HIGH), por encima de ella (THIGH HIGH), toda la pierna (CROTCH HIGH o WADERS) o cubrir incluso hasta el pecho (CHEST BOOTS).
Mascarillas. Las mascarillas contra gases regularmente no se emplean en el laboratorio, puesto que debe de contarse con campanas de extracción donde los vapores tóxicos pueden ser controlados fácilmente. Las mascarillas contra polvo, en contraste, sí se emplean, dado que en ocasiones uno se enfrenta a operaciones donde no conviene hacer uso de la campana de extracción. Como por ejemplo cuando se trasvasa a un matraz por ejemplo una planta finamente molida, o cuando se trasvasan sólidos finos peligrosos como la celita –material de empaque-, el tonsil, la gel de sílice o la alúmina. Estos últimos tienen la consistencia de la arena movediza, y ante el menor esfuerzo o corriente de aire se levantan, pudiendo ocasionar un daño irreversible al sistema respiratorio del operador. Dependiendo de lo que se vaya a hacer, existen mascarillas que simplemente pueden estar confeccionadas en algodón compactado, o bien llegar a ser demasiado sofisticadas poseyendo incluso filtros de respiración con una capa de carbón activado. Recomendaciones para el tipo de zapatos que se calcen durante la práctica. Los zapatos deben ser en cualquier caso bajos y cerrados. Se debe de evitar el empleo de zapatos de tacón que puedan originar un resbalón o una caída. Además, las tapas de los tacones finos (de aguja o estilete) o incluso más gruesos regularmente se encuentran manufacturadas de un material sintético polimérico que es soluble en disolventes orgánicos, los cuales al contacto con estos últimos, si es que se encuentran vertidos sobre el suelo generan una mezcla resbalosa que puede originar accidentes. Se debe evitar además el uso de sandalias y de huaraches debido a que no protegen el pie en lo absoluto ante la eventualidad de un derrame. Causas de incendio en el Laboratorio
La mayoría de los incendios ocurridos en un laboratorio pueden prevenirse si se consideran las medidas necesarias. No obstante que existe material eléctrico para calentar, a veces es necesario encender mecheros y el peligro del mechero es
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inminente en un laboratorio, por lo que es importante considerar las siguientes precauciones:
Nunca caliente directamente un disolvente orgánico con una flama. Si el disolvente
orgánico tiene una temperatura de ebullición inferior a 95°C (a 760mm de Hg) la fuente de calentamiento puede ser una parrilla eléctrica, una manta de calentamiento, baño María o de vapor.
Antes de encender una flama, revise si hay presencia de disolvente orgánico a su
alrededor. Los vapores de disolvente orgánico son más densos que el aire y fluyen hacia abajo: se difunden rápidamente y pueden incendiarse por una flama o chispa que se encuentre a varios metros de distancia.
Nunca deje encendido un mechero si no se va a utilizar. Si utiliza mecheros, evite usar en el laboratorio mangas demasiado amplias, por se propensas a incendiarse con más facilidad. Al realizar trabajo de laboratorio el cabello largo debe recogerse hacia atrás.
Fumar representa peligro de incendio; por lo cual, en un laboratorio queda estrictamente prohibido fumar.
Los canales de desagüe de las mesas del laboratorio son para eliminar el agua de los refrigerantes y no para verter residuos de líquidos inflamables.
Prevención y control de incendios.
Los incendios en un laboratorio pueden ser pequeños o grandes. Los incendios pequeños son aquellos que se presentan al incendiarse la boca de un matraz o de un vaso de precipitados. Para apagarlos, se coloca en la boca del matraz o vaso, una placa de asbesto o un vidrio de reloj.
En un laboratorio también suelen presentarse incendios grandes, en esta situación lo primero es desalojar el laboratorio con orden y rapidez y proceder a apagar el incendio. Para apagarlo es necesario un equipo de seguridad que incluya una variedad de extintores, mangueras para incendio, mantas y sistemas automáticos para apagar fuego (regaderas).
El estudiante debe estar familiarizado con la ubicación y uso de los extintores existentes en el laboratorio; para utilizarlos debe seguir estas instrucciones:
1. Desprenda el alambre sellador (indica que el extintor está totalmente cargado) 2. Quite el seguro. 3. Apunte a la base del fuego con la corneta. 4. Presione la palanca
Los laboratorios deben estar provistos de extintores de dióxido de carbono (CO2)o
extintores de sustancias químicas en forma de polvo seco. Los extintores se clasifican de acuerdo a la naturaleza del fuego.
Los extintores de agua son efectivos contra incendios de papel y basura. No
deben emplearse para apagar fuegos ocasionados por equipos eléctricos, líquidos o metales inflamables.
Los extintores de CO2 son efectivos contra incendios de líquidos (hidrocarburos o pinturas), No deben emplearse contra incendios eléctricos de instrumentos y sistemas ópticos, de hidruro de litio y aluminio o de metales alcalinos.
Los extintores de polvo seco, contienen carbonato de sodio y son efectivos para
incendios eléctricos, líquidos y cuando existen grandes cantidades de disolvente.
Los extintores de formulación granular (como el cloruro de sodio) son efectivos
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contra incendios de metales como magnesio, litio, sodio, potasio, hidruros metálicos y otros compuestos organometálicos.
Incendios en ropa
Su sus ropas se incendian, camine (no corra) a la regadera más cercana. Si esta no está cerca tírase al suelo y ruédese para extinguir las flamas y pida ayuda. El fuego de las ropas también puede apagarse cubriendo a la persona con una manta y rodándola después. El movimiento de rodamiento es importante porque el fuego puede aún quemar debajo de la manta. Las toallas húmedas también se utilizan para apagar el fuego de la ropa.
Las personas quemadas deben mantenerse quietas y abrigadas para prevenir el
shock. Debe solicitarse inmediatamente atención médica.
Manejo de sustancias
Disolventes orgánicos. Los disolventes orgánicos presentan una doble peligrosidad ya sea por su inflamabilidad o por su toxicidad, así que deben ser tratados con mucha precaución. Los disolventes orgánicos nunca deben calentarse directamente con una flama; el calentamiento debe ser mediante baño maría o vapor, parrillas y mantas de calentamiento, deben manejarse en la campana y nunca deben inhalarse ni estar en contacto con la piel directamente. Los disolventes orgánicos nunca se desechan por el drenaje, deben ser recuperados mediante destilación para ser usados nuevamente.
Ácidos y Bases. Al trabajar con sustancias corrosivas siempre deben usarse lentes de seguridad y guantes, además de manejarlas en la campana. El contacto de estas sustancias con la piel puede provocar severas quemaduras; en caso de salpicaduras, se debe de enjuagar el área con abundante agua fría. Por último, los ácidos y bases deben ser neutralizados antes de desecharse al drenaje.
Sustancias Carcinogénicas. Un alto número de células de cuerpo humano permanecen casi constantes debido a los mecanismos de regulación. Si estos mecanismos se atrofian o son deficientes, presentará una proliferación excesiva de células (neoplasia). Un neoplasma es un tumor o masa de tejido anormal y puede ser benigno o maligno. Múltiples agentes químicos –los cuales caen dentro de la categoría de las sustancias carcinógenas- pueden producir neoplasias, ejerciendo su acción activando los virus oncógenos. Otros agentes actúan sobre las células directamente.
Montaje de aparatos
Las piezas esmeriladas de los diferentes equipos para el trabajo experimental con cantidades pequeñas (1-10 g), proporcionan la facilidad de montar diferentes sistemas (reflujo, destilaciones, etc) en forma rápida y efectiva, para conservar estas ventajas, las piezas requieren cuidados en su mantenimiento.
Los cuidados mínimos que deben proporcionarse son los siguientes: Engrasar ligeramente las juntas macho esmeriladas de las piezas.
Asegurarse ligeramente que las superficies de las juntas no lleven residuos sólidos o líquidos antes de engrasarlas porque disminuyen la eficiencia del sellado al presentarse juntas en las juntas esmeriladas, y además pueden hacer las veces de pegamento si es que el equipo será llevado a una temperatura elevada. Así, antes de iniciar el montaje de aparatos deben limpiarse las partes esmeriladas de las piezas con una torunda de algodón impregnada de acetona.
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Si se pegan las juntas esmeriladas, lo que debe hacerse es lo siguiente:
1. Golpear suavemente con el mango de madera de una espátula por ejemplo las
juntas pegadas. 2. Calentar las juntas pegadas en agua caliente o baño de vapor. 3. Calentar las juntas pegadas en una solución de glicerina-agua (1:1)
Debe evitarse el calentar las juntas pegadas directamente en la flama del mechero, porque este calentamiento puede ser tan rápido que ocasione la expansión violenta de las juntas y éstas se agrieten. No intente forzar demasiado el material de vidrio con un movimiento torsional, pues puede romperse y ocasionar serios daños a las manos.
Equipo de Calentamiento
Para calentar líquidos existen varios dispositivos, los cuales se describen a
continuación, de acuerdo con su utilización:
Baño de vapor. Se utiliza para calentar líquidos con un punto de ebullición máximo de 90°C, y se utiliza también para disolventes de punto de ebullición bajo, especialmente los inflamables. Consiste en una tubería normalmente de cobre por la que sale vapor de agua, y éste se arroja hacia unos receptáculos donde descansan los matraces con el disolvente a ser evaporado.
Parrilla eléctrica con resistencia protegida. Se usa para calentar disolventes inflamables; si la parrilla presenta alambres eléctricos dañados, no es adecuada para el trabajo de laboratorio.
Canastillas eléctricas. Se emplean para calentar el contenido de matraces de fondo redondo. Existen canastillas para cada tamaño de matraz. Antes de usarla revise las condiciones en que se encuentra, si está maltratada en grado tal que quede expuesta la resistencia, no la utilice ya que representa un peligro de incendio. La canastilla de calentamiento se conecta al reóstato, el cual se utiliza para ajustar el voltaje y la temperatura. Mecheros Bunsen. Su empleo está muy extendido en los laboratorios escolares a diferentes niveles, por tal motivo hay que hacer énfasis en su uso correcto. Los mecheros se usan para doblar tubo de vidrio y para calentar soluciones acuosas y líquidos de punto de ebullición alto que no sean inflamables. Para calentar con mechero se recomienda usar una tela de asbesto entre el matraz y mechero para distribuir en forma uniforme el calor y evitar un sobrecalentamiento localizado.
Baño María. Se emplea para calentar disolventes orgánicos de punto de ebullición menor al punto de ebullición del agua.
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INDICE
Pags
TÉCNICAS DE AISLAMIENTO 12
EXTRACCIÓN SIMPLE Y MÚLTIPLE
16
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (CCF)
20
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
23
EVALUACIÓN BIOLÓGICA DE LOS EXTRACTOS ORGÁNICOS
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TÉCNICAS DE AISLAMIENTO.
ANTECEDENTES
Los aceites esenciales son sustancias volátiles que acompañan generalmente a las partes aéreas de una planta (es decir, a toda la planta menos la raíz, si bien es posible, en principio, aislar componentes volátiles también de las partes subterráneas). Muchos de estos compuestos poseen propiedades de interés, como por ejemplo, medicinales, saborizantes, etc. Para poder aislarlos, de puede hacer uso de técnicas en donde se aprovechan algunas de sus propiedades físicas (como la solubilidad en ciertos disolventes acuosos y su no nubilidad en fases acuosas), que permiten obtenerlos mediante operaciones en condiciones más o menos suaves, las cuales permiten la conservación de su estructura molecular. En esta práctica se conocerán algunas de ellas. OBJETIVOS
Aislar el aceite esencial de un producto natural utilizando las siguientes técnicas de laboratorio:
a) Destilación por arrastre de vapor b) Extracción continua en equipo Soxhlet c) Extracción directa
y conocer las características de cada una de ellas para emplearlas como alternativa en la extracción de una sustancia, según los criterios que se establecerán en esta práctica.
MATERIAL
Para el experimento de extracción 1 Probeta graduada 25mL
mediante arrastre con vapor 1 Mechero con manguera
Tubo de vidrio (el que sea necesario
1 Matraz Erlenmeyer de 500 mL, 1 Espátula
con tapón de hule monohoradado 2 Anillos metálicos
2 Telas de alambre 3 Pinzas de 3 dedos con nuez
1 Matraz Kitasato de 500 mL con 1 Recipiente de peltre
tapón de hule 3 soportes
1 Mechero
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1 refrigerante de agua con 2 Pinzas de 3 dedos con nuez
mangueras 1 Mechero
2 trozos de manguera de 10-15 cm 1 Tela de alambre
de longitud 1 Soporte
1 Tubo de ensayo grueso inmerso 1 Anillo metálico
dentro de un frasco con hielos y
agua Para el experimento de extracción
mediante reflujo
Para el experimento de extracción
mediante arrastre con equipo 1 Matraz redondo de 100mL 24/40
Soxhlet 1 Refrigerante para agua 24/40 con
mangueras
1 Equipo Soxhlet 24/40 con cámara 2 Pinzas de 3 dedos con nuez
de extracción y refrigerante para 1 Canasta de calentamiento con
agua con mangueras extensión
1 Matraz redondo de 500 mL, 24/40 1 Reóstato
1 Dedal para Soxhlet
SUSTANCIAS
Acetato de etilo y sulfato de sodio anhidro.
Dentro de los productos naturales que se pueden utilizar para la extracción podemos recomendar: té de limón (zacate limón), clavo, pimienta, pétalos de rosa, cáscara de naranja, etc.
PROCEDIMIENTO
a) Destilación por arrastre de vapor.
Coloca aproximadamente 250 mL de agua en el matraz kitasato (generador de vapor) y agrega perlas de ebiullición. Coloca un tapón de hule y mediante una manguera únelo a un tubo de vidrio de 5 cm. el cual se conectará en serie mediante una segunda manguera a un tubo en forma de L que penetrará el tapón bihoradado que estará insertado en el matraz Erlenmeyer, procurando que el extremo que queda en el interior del matraz Erlenmeyer llegue casi al fondo. Adiciona todo el producto natural que se pueda dentro del matraz Erlenmeyer, de tal manera que no quede presionado. Por el segundo orificio del tapón inserta un nuevo tubo de vidrio en L cuyo extremo también deberá de llegar casi al fondo, mientras que el otro extremo lo insertarás en un tapón de hule monohoradado, el cual a su vez estará insertado en un refrigerante de agua con mangueras.
Inicia el calentamiento del matraz kitasato. El sistema no debe de quedar forzado, y los vapores que se generen deben escapar por el refrigerante de manera controlada. El aceite deberá, conforme se caliente, depositarse dentro del tubo de ensayo en la cámara fría que deberá de colocarse al final del equipo. .
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b) Extracción continua Soxhlet
Coloca en el matraz redondo el diclorometano suficiente para que se llene el matraz bola del equipo Soxhlet a la mitad y agrega perlas de ebullición. Llena el dedal de celulosa con té de limón cortado en pequeños trozos y colócalo en la cámara de extracción. Calienta cuidadosamente hasta la ebullición de diclorometano, cuyos vapores deberán de condensarse en el refrigerantes para caer sobre el té limón. En el momento en que la cámara de extracción se llena, el disolvente cae por gravedad al matraz. Este proceso se repite continuamente de tal manera que cada vez se extrae mayor cantidad de aceite esencial. Luego de unas 4 o 5 descargas, concentra finalmente el extracto a sequedad en rotavapor
Apariencia de varios equips Soxhlet operando (izquierda) y modo de funcionar de ellos (derecha)
c) Extracción directa a reflujo
Coloca en un matraz bola de 100 mL y té limón cortado en trozos hasta que se ocupe la tercera parte del volumen; agrega cuerpos de ebullición y el cloruro de metileno suficiente de tal manera que la mezcla heterogénea cubra hasta 2/3 partes del volumen del matraz. Calienta a reflujo durante 30 minutos para extraer el aceite esencial. Desmonta el equipo y decanta el extracto obtenido. Sécalo con
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sulfato de sodio anhidro y decántalo en un recipiente limpio y seco. Concentra el extracto a sequedad en el rotavapor.
Modo de disponer el flujo de agua en las mangueras en un calentamiento a reflujo.
BIBLIOGRAFÍA
Brewster, R.Q., Vanderwerf, C.A. y McEwen, W.E., Curso práctico de química orgánica, 3ª , ed., Alambra, S.A., Madrid, España, 1970.
Moore, J.A. y Dalrymple, D.L., Experimental Methods in Organic Chemistry, 2a ed., W.S. Saunders Co., Philadelphia, EU, 1976. pp:65-67. 179-180
Pavia, D.L Lampman, GM y Kriz, G.S., Introduction to Organic Laboratory Techniques, W.B. Saundars Co., Philadelphia, E.U. 1976
Roberts, R.M., Gilbert, J.C., Rodewald, L.B., Wingrove, A.S., Modern Exsperimental Organic Chemistry, 3a. ed Holt Reinehart and Winston, Nueva York, E.U., 1979
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EXTRACCIÓN SIMPLE Y MÚLTIPLE
ANTECEDENTES
En química orgánica se manejan dos tipos de medios, asignados así de manera puramente arbitraria: las fases orgánicas y las fases acuosas. Los primeros involucran cualquier disolvente orgánico y los solutos en él contenidos, mientras que la fase acuosa es, estrictamente hablando, aquélla donde el disolvente es agua y posee solutos solubles en ella (aunque regularmente puede tener una cierta participación de un disolvente orgánico). Los sustratos de una y otra fase, no obstante, pueden poseer una cierta solubilidad, a una temperatura dada, en ambas fases, y a esta tendencia se le puede cuantificar (lo anterior viene dado por la constante de reparto, que es la relación de concentraciones que un soluto alcanza en dos fases no miscibles y en contacto entre sí, al equilibrio). De esta manera, si un soluto se encuentra por alguna razón disuelto en una fase en la que no es afín, se puede transferir a otra al ponerlo en contacto su solución con este último disolvente. A este proceso se le conoce como extracción, y puede llevarse a cabo en una sola etapa (extracción simple) o en varias (extracción múltiple), lo cual dependerá de la constate de reparto del soluto en cuestión.
OBJETIVO
Conocer las técnicas de extracción simple y múltiple y sus fundamentos para
utilizarlas como operaciones unitarias de rutina en los cursos experimentales de la química orgánica 2 y 3.
MATERIAL
1 Embudo de separación con tapón 7 Tubos de ensayo de 10 mL
1 Embudo de vidrio 1 Espátula
1 Probeta de 25Ml 1 Pipeta graduadas de 10 mL
2 Pinzas de 3 dedos con nuez 1 Agitador de vidrio
1 Vasos de recipitados de 250mL 1 Soporte
1 Recipiente de peltre 1 Anillo metálico
1 Vaso de pp. De 150mL
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SUSTANCIAS
30 mL de solución yodo-yodurada (prerarada a partir de 1 o 2 cristales de yodo en 100 mL de agua y disolviéndolo con el yoduro de potasio que sea necesario). 60 mL de diclorometano
20 mL de acetato de etilo
cloruro de sodio (el que sea necesario)
Imagen de una extracción simple. A la izquierda, un soluto (yodo) en una fase en la cual no es afín: agua; si se le adiciona un disolvente orgánico no miscible con ella (como acetato de etilo) y se agita esta mezcla heterogénea, el yodo pasará a la fase del acetato de etilo, en la que sí presenta afinidad (imagen de la derecha).
PROCEDIMIENTO
Para efectuar la extracción simple, adiciona por medio de un embudo de vidrio 15 mL de cada uno de los disolventes (no los debes mezclar, usarás primero uno y luego el otro) a la solución yodoyodurada. El embudo de extracción deberá de estar perfectamente cerrado y debe de verificar que en el momento de colocar el tapón superior no se derrame nada de líquido al invertirlo. Usa guantes. Manteniendo el embudo en posición vertical e invertida, abre la llave de paso para que se libere el exceso de presión dentro del embudo (operación que se denomina purgado), cierra nuevamente la llave y agita vigorosamente durante aproximadamente 10 minutos. Atiende las indicaciones del profesor para conocer la manera correcta de agitado –ver figura-. Periódicamente debes de liberar la presión de los vapores haciendo purgados, para luego de ello continuar con la agitación. Si la fase acuosa es decolorada antes de los 10 minutos, suspende la agitación y permite que las fases se dispersen. Colecta cada una de las fases en recipientes por separado. Anota tus resultados. Observa lo que ocurre con cada una de las fases orgánicas luego de agitar
Para efectuar la extracción múltiple, adiciona 3 mL del disolvente que hayas seleccionado como el peor para extraer a los 15 mL restantes de la solución yodoyodurada. Efectúa una extracción tal y como lo hiciste anteriormente, solo que ahora durante 3 minutos. Colecta la fase orgánica del diclorometano en un
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tubo de ensayo con la capacidad suficiente y vuelve a extraer la fase acuosa nuevamente con otros 3 mL de diclorometano. Continúa haciendo esto hasta completar 5 extracciones. Finalmente, compara las coloraciones de los diferentes extractos orgánicos. Anota tus resultados.
Nota. Para la preparación de la solución yodo-yodurada, se puede hacer lo siguiente: en 100 mL de agua (no es necesario que sea destilada) disuelve una punta de espátula de yoduro de potasio; acto seguido, adiciona unos cuantos cristalitos de yodo metálico y agita. La solución deberá de ponerse inmediatamente amarillenta, pasando a tomar un color café a medida que se adiciona más yodo. Se te recomienda que no prepares una solución muy concentrada, dado que posteriormente puedes tener problemas para la extracción en el sentido de requerir demasiada cantidad de disolvente para sacarlo de la fase acuosa.
Arriba a la izquierda: adiciona los líquidos al embudo auxiliándote siempre de un embudo; arriba centro, asegúrate de que no hay fugas en tu embudo una vez cerrada la llave y colocado el tapón; arriba derecha, asegúrate de purgar tu embudo con frecuencia. Abajo izquierda, recuerda que para que puedas evacuar los líquidos del embudo, requieres remover el tapón. Adicionalmente, usa siempre guantes.
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BIBLIOGRAFÍA
J. G. Ávila, C. García, I. C. Gavilán, F. León, J. M. Méndez, G. Pérez, M. A. Rodríguez, G. Salazar, A. A. Sánchez, E. Santos, R. M. Soto. Química Orgánica: Experimentos con un enfoque ecológico. Dirección General de Publicaciones y Fomento Editorial, UNAM. México, 2001.
F. A. Carey. Organic Chemistry. 4ª. Edición. The McGraw-Hill Companies, Inc. Estados Unidos, 2002.
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CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (CCF)
OBJETIVOS:
- Conocer y aplicar la técnica de cromatografía en capa fina. - Relacionar la polaridad de las
sustancias y los diferentes eluyentes utilizados en esta técnica.
MATERIAL:
1 probeta de 10 mL
1 espátula de Cr/Ni
3 vasos de pp de 100 mL
1 cámara de elución
Papel filtro de poro grueso
Pinzas para cromatofolio
Cromatofolios
Lámpara de UV
Cámara de yodo para revelar
SUSTANCIAS:
Hexano, acetato de etilo, acetona, metanol
TECNICA:
IMPORTATE: ASEGURATE DE QUE TODO EL MATERIAL EMPLEADO EN ESTA PRÁCTICA SE
ENCUENTRA ABSOLUTAMENTE SECO.
Los cromatofolios o cromatoplacas deben marcarse de la siguiente forma
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La raya superior señala hasta donde debe llegar el disolvente una vez eluída la placa y la línea
inferior señala el lugar donde se pondrá la muestra (punto de aplicación). Todo se escribe con lápiz
(no lapicero).
RF (factor de referencia)
Es la relación de la distancia que recorre la sustancia en la placa y la distancia que recorre el
eluyente a partir del punto de aplicación y se expresa como una fracción decimal. Este valor puede
utilizarse para seleccionar el eluyente o la mezcla de ellos, con los que se eluye la placa.
Para cada placa debe hacerse un dibujo que represente el cromatofolio después de revelado y
debe calcularse el Rf de cada compuesto.
Cámara de elución.
Se prepara con una porción de papel filtro que cubre casi en su totalidad la pared de la cámara
dejando una porción descubierta para poder visualizar la elución. El disolvente o mezcla de ellos
debe agregarse unos minutos antes que el cromatofolio para que el papel filtro absorba el
disolvente y se sature el ambiente dentro de la cámara; ésta se tapa, y solo se descubre hasta que
se introduce el cromatofolio.
A) Polaridad
Se utilizarán 3 cromatofolios cada uno marcado en la parte superior como sigue Hx para hexano,
AcOEt para acetato de etilo y MeOH para metanol. Marcar en cada cromatofolio 2 puntos de
aplicación, en el primero poner la solución contenida en el frasco A, y en el segundo la solución
contenida en el frasco B.
Preparar 3 cámaras cromatográficas cada una con 4 ml del disolvente que le corresponda. Eluir
hasta la marca superior de la placa en la cámara.
Revelar cada placa con la lámpara de UV (onda corta) y marcar el contorno delas manchas que
se observan con un lápiz (no lapicero). Después revelar con Yodo.
B) Pureza
Marcar en un cromatofolio limpio 2 puntos de aplicación, en el primero poner el frasco C y en el
segundo el frasco D. Eluir con Ac0Et. Revelar con luz UV y después con Yodo.
C) Identificación de sustancias.
Preparar 2 cromatoplacas cada una con 2 puntos de aplicación, en el primero poner el frasco B y
en el segundo la suspensión del medicamento preparada por tu profesor. Eluir una con MeOH y
otra con AcOEt. Dejar secar y revelar con UV y Yodo.
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Tratamiento de residuos.
Depositar los disolventes utilizados en frascos de otras prácticas que contenga el mismo.
Los cromatofolios se desechan en la bolsa donde se ponen los papeles filtro utilizados en otras
prácticas.
BIBLIOGRAFÍA.
ÁVILA, Z. et all. Química Orgánica, Experimentos con un enfoque ecológico.
Universidad Nacional Autónoma de México. 2009
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CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
ANTECEDENTES
La cromatografía es un método muy útil de separación de mezclas, purificación de sustancias e
identificación de compuestos.
Para llevar a cabo una purificación de un compuesto sea sólido o líquido, se utiliza la técnica de
cromatografía en columna, que sirve para separar mezclas cuyo peso se encuentra por arriba de
los 50 mg. Es una técnica sencilla que se puede llevar a cabo a temperatura ambiente.
La cromatografía en capa fina es una técnica que ayuda a determinar el número de componentes
de una mezcla y como una prueba preliminar para realizar una cromatografía en columna, entre
otras aplicaciones.
MATERIAL
1 columna para cromatografía
1 soporte universal
1 pinzas de 3 dedos o pinzas para columna
Gel de sílice para columna
2 vasos de pp de 100 ml
1 vaso de pp de 250 ml
1 probeta 100 ml
1 agitador de vidrio
1 pinzas de Cr/Ni
Frascos viales (aproximadamente 20)
Embudo de vidrio de talle largo
1 matraz Erlenmeyer de 250 ml
Algodón
Parrilla
Lámpara de luz UV
Sustancias
Hexano, acetato de etilo, acetona, metanol.
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Procedimiento general para empacar por vía húmeda.
Se coloca la columna de cromatografía en un soporte con ayuda de unas pinzas de tres dedos, de
tal forma que se encuentre totalmente vertical y con una altura al tamaño de los frascos viales.
Para empacar la columna, se coloca la llave de la columna en posición de cerrado (si la llave es de
vidrio, se deberá engrasar ligeramente). Se introduce hasta el fondo un pequeño pedazo de
algodón con ayuda de una varilla de vidrio o de metal, se agregan 5 mL del eluyente o la mezcla
de disolventes a utilizar y se presiona suavemente el algodón para eliminar las burbujas. Se
prepara una suspensión de sílica gel para columna, aproximadamente 8 g en 30 mL de eluyente y
se agita la suspensión hasta que no se observen burbujas de aire. Con ayuda de un embudo de
vidrio se vierte la suspensión en la columna lo más rápido posible y se golpea ligeramente la
columna con los dedos para que el empaquetamiento sea uniforme. Se abre la llave para eliminar
el exceso de disolvente cuidando de no dejar secar la silica gel, se debe mantener el eluyente
aproximadante a 0.5 cm arriba de la sílica
En un vaso de precipitados de 100 mL se disuelve la mezcla problema con la mínima cantidad de
eluyente, de 2 a 3 mL, , con ayuda del agitador, se vierte lo más rápido posible y con cuidado para
no mover la superficie de la sílica en la columna. Se abre la llave para colectar el eluyente y que se
adsorba la muestra aplicada, se debe tener cuidado de que la columna no se seque.
Se marcan los frascos viales a 6 mL y se colectan las fracciones (eluatos), se verifica la separación
realizando cromatoplacas (se preparan las cromatoplacas y capilares previamente como la
práctica anterior). No olvidar la eferencia.
Se eluyen las cromatoplacas en una mezcla del eluyente utilizado y se observa en cuales
fracciones hay presencia del compuesto separado revelando con una cámara de UV o una cámara
de yodo. En cada cromatoplaca se debe observar el cambio de coloración de la mancha del
producto principal (a menor concentración menor intensidad de color).
Para recuperar el principio activo se destila el disolvente por medio de una destilación simple
usando como fuente de calentamiento un baño María, se deja un residuo de 5 mL
aproximadamente y se vierte en un vidrio de reloj para que termine de evaporarse en la campana.
Finalmente se pesa el producto recuperado.
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Figura 1: Esquema de montaje de columna cromatográfica
Bibliografía.
ÁVILA, Z. et all. Química Orgánica, Experimentos con un enfoque ecológico.
Universidad Nacional Autónoma de México. 2009
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EVALUACIÓN BIOLÓGICA DE LOS EXTRACTOS ORGÁNICOS
Objetivos (el estudiante debe plantearlos).
ANTECEDENTES
1. Describir el método para la determinación de la toxicidad para el crustáceo Artemia salina
Leach, indicando sus ventajas y aplicaciones.
2. Señalar cuál es intervalo de valores de concentración letal media para considerar como activo
un extracto en el bioensayo indicado en el punto (1).
3. Describir dos métodos para calcular la concentración letal media en el bioensayo de toxicidad
para A. salina.
Material, equipo, reactivos y material biológico
Balanza analítica 1 Espátula cromo-níquel 1
Pipeta volumétrica 5 mL 1 Soporte universal 2
Pipeta graduada 1 mL 1 Anillo metálico 2
Pipeta graduada 2 mL 1 Cristalizadora 1
Embudo de filtración mediano 1 Caja de Petri 3
Vaso de precipitados 250 mL 2 Lámpara portátil 1
Agitador de vidrio 1 Baño de temperatura constante 1
Frascos viales 10 mL 30 Termómetro 1
Microjeringa 10 L 1 Tamiz 1
Microjeringa 100 L 1 Agua destilada
Microjeringa 500 L 1 Medio salino artificial (“Instant Ocean”)
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Pipeta Pasteur con bulbo 3 Huevecillos de Artemia salina
Matraz volumétrico 2 L 1 Papel filtro
Embudo de filtración 2 Placa de vidrio para el cristalizador 1
a Material por grupo
PROCEDIMIENTO
Desarrollo de las larvas
Incubar los huevecillos del crustáceo A. salina durante 48 horas en un medio salino artificial, a una
temperatura entre 30 y 35°C y con iluminación.
Preparación de las muestras de prueba
1. Preparar las muestras en frascos viales transparentes de 10 mL.
2. Preparar disoluciones de los extractos cuya concentración en un volumen final de 5 mL sea de
10, 100 y 1000 ppm. Utilizar disolventes para la preparación de las disoluciones.
3. Transferir, por separado, el volumen necesario de cada disolución a un vial y evaporar el
disolvente hasta sequedad a temperatura ambiente y empleando una corriente de aire. Ensayar
tres réplicas por cada concentración de prueba.
Bioensayo
1. Trasladar 10 larvas del crustáceo a cada uno de los viales que contengan las muestras a
evaluar y “aforar” a 5 mL utilizando medio salino artificial.
2. Incubar las muestras durante 24 horas a una temperatura entre 30 y 35°C y con iluminación.
3. Transcurrido el tiempo de incubación, contar el número de crustáceos sobrevivientes.
4. Calcular la concentración letal media.
Preparación de las muestras control
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1. Preparar tres viales que contengan únicamente medio salino. Estas muestras serán utilizadas
como control negativo.
2. Utilizar hexano, acetato de etilo y metanol para preparar los controles de disolvente.
RESULTADOS
Tabla 1. Resultados del bioensayo de toxicidad para el crustáceo A. salina (extracto hexánico).
[extracto hexánico]
( g/mL)
organismos vivos
vial 1 vial 2 vial 3
10
100
1000
Disolvente (hexano) organismos vivos
vial 1 vial 2 vial 3
500 L
500 L
500 L
Medio salino organismos vivos
Réplica 1
Réplica 2
Réplica 3
Tabla 2. Resultados del bioensayo de toxicidad para el crustáceo A. salina (extracto de acetato de
etilo).
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[extracto AcOEt]
( g/mL)
organismos vivos
vial 1 vial 2 vial 3
10
100
1000
Disolvente (AcOEt) organismos vivos
vial 1 vial 2 vial 3
500 L
500 L
500 L
Medio salino organismos vivos
Réplica 1
Réplica 2
Réplica 3
Tabla 3. Resultados del bioensayo de toxicidad para el crustáceo A. salina (extracto metanólico).
[extracto MeOH] ( g/mL) organismos vivos
vial 1 vial 2 vial 3
10
100
1000
30
Disolvente (MeOH) organismos vivos
vial 1 vial 2 vial 3
500 L
500 L
500 L
Medio salino organismos vivos
Réplica 1
Réplica 2
Réplica 3
Tabla 4. Resultados del bioensayo de toxicidad para el crustáceo A. salina (extracto de acetato de
etilo-metanol 1:1).
[extracto AcOEt-MeOH
1:1] ( g/mL)
organismos vivos
vial 1 vial 2 vial 3
10
100
1000
Disolvente(AcOEt-MeOH
1:1)
organismos vivos
vial 1 vial 2 vial 3
500 L
500 L
500 L
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Medio salino organismos vivos
Réplica 1
Réplica 2
Réplica 3
2. Determinar la CL50 de los extractos de y de los controles positivos, trazando las gráficas de
número de organismos muertos vs log concentración del extracto y número de organismos
acumulados (vivos y muertos) en función del logaritmo de la concentración del extracto. Anexar las
gráficas.
