Physical & chemical examination of urine

Physical & Chemical Examination of Urine

ทนพ. สุวิทย์ คล่องทะเล Suwit Klongthalay

Urinalysis

Urinalysis

Physical examination

Chemical examination

Microscopic examination

2 ทนพ.สวิุทย ์คล่องทะเล

Major Functions of the Kidneys

ทนพ.สวิุทย ์คล่องทะเล 3

ก าจัดของเสีย

สมดุลอิเลคโทรไลต์

สังเคราะห์ฮอร์โมน

ควบคุมความดันเลือด

ธ ารงสภาวะดุลกลูโคส

Physical examination

Components

Color

Clarity

Odor

Volume

Foam

Specific gravity

4 ทนพ.สวิุทย ์คล่องทะเล

Key terms

Clarity

Densitometry

Hypersthenuria

Hyposthenuria

Isosthenuria

Refractometry

Specific gravity

Nocturia

Polyuria

Oliguria

Urinometry

Physical Properties : Color


Normal colors: colorless, straw,

light yellow, yellow, dark yellow

and amber

Urochrome: yellow pigment

(predominant); ใช้ประมาณ urine

conc. คร่าวๆ

Uroerythrin: red/pink pigment;

bind to amorphous urate

o refrigerate -> precipitate of

amorphous urate -> pink

color

Urobilin: orange-red/brown

pigment



Physical property Cause Clinical/Laboratory Correlations

Normal color

(straw to amber)

Urochrome, uroerythrin and

urobilin

Colorless Recent fluid consumption Commonly observed with random

specimens

Pale yellow Polyuria or DI

Diabetes mellitus

Dilute random specimen

Increased 24-hour volume

Elevated specific gravity and positive

glucose test result

Recent fluid consumption

Dark yellow

Amber

Concentrated specimen May be normal after strenuous exercise

or in first morning specimen

Dehydration from fever or burns




Orange Bilirubin

Phenazopyridine (Pyridium)

Nitrofurantoin

Phenindione

Mepacrine

Yellow foam when shaken and positive

chemical test results for bilirubin

Drug commonly administered for urinary

tract infections. May have orange foam

and thick orange pigment that can

interfere with reagent strip readings

Antibiotic administered for UTI

Anticoagulant, orange in alkaline urine,

colorless in acid urine

Anti-malaria & Giardia

Yellow-green

Yellow-brown

Bilirubin oxidized to

biliverdin

Colored foam in acidic urine and false-

negative chemical test results for bilirubin




Pink

Red

RBCs

Hemoglobin

Myoglobin

(dark red-brown)

Porphyrins

(dark red or red-purple)

Red diaper

Rifampin

Menstrual contamination

Beets (Betalain)

Cloudy urine, positive chemical test results

for blood and RBCs visible microscopically

Clear urine, positive chemical test results for

blood; intravascular hemolysis

Clear urine, positive chemical test results for

blood; muscle damage

Negative chemical test results for blood

Detect with Watson-Schwartz screening test

or fluorescence under UV light

Serratia marcescens infection

Tuberculosis medication

Cloudy specimen with RBCs, mucus, clots

Alkaline urine of genetically susceptible

persons




Green Pseudomonas infection

(pigment)

Positive urine culture

Blue-green

Amitriptyline

Methocarbamol (Robaxin)

Indican

Methylene blue

Phenol

Antidepressant

Muscle relaxant, may be green-brown

Trp Indole Indican Indigo dye

Bacterial infections ( Klebsiella or

Providencia species)

Fistulas (แผลชอนทะลุ), urinary antiseptics

When oxidized

Cola color : usually old hemoglobin or myoglobin

O2 Bact.




Brown

Black

RBCs oxidized to

methemoglobin

Homogentisic acid

(alkaptonuria)

Melanogen

Phenol derivatives

Argyrol (antiseptic)

Methyldopa or levodopa

Metronidazole (Flagyl)

Seen in acidic urine after standing; positive

chemical test result for blood

Seen in alkaline urine after standing;

specific tests are available

Malignant melanoma; oxidized to melanin

Interfere with copper reduction tests

Color disappears with ferric chloride

Darkens on standing

Darkens on standing

Milky Chyluria

Lipiduria

Thoracic duct obstruction -> lymph

vessel ruptured -> chylomicron released

Nephrotic syndrome, broken bone

Alkaptonuria


oxidized in urine black color

Red urine testing chemically positive for blood


ใส ขุ่น

ปัสสาวะสีด าเกิดได้จากสาเหตใุดบา้ง


_____ 1. Alkaptonuria

_____ 2. Hematuria ตั้งทิ้งไว ้

_____ 3. Pseudomonas infection

_____ 4. Diabetes mellitus

_____ 5. Malignant melanoma

Physical Properties : Urine Clarity


Clarity Term Possible cause

Clear No visible particulates, transparent Normal or dilute

Hazy Few particulates, print easily seen

through urine

Cloudy Many particulates, print blurred

through urine

Turbid Print cannot be seen through urine

Milky May precipitate or be clotted

Pathologic or

nonpathologic

cause

Slig

htly

turb

id

Physical Properties


Causes of Urine Turbidity


Nonpathologic Causes Pathologic Causes

Squamous epithelial cells

Mucus

Amorphous phosphates,

carbonates, urates

Semen, spermatozoa

Fecal contamination

Talcum powder

Vaginal creams

RBCs

WBCs (pyuria)

Bacteria (fresh urine)

Yeast, Parasite

Nonsquamous epithelial cells

Abnormal crystals

Lymph fluid

Lipids

Physical Properties : Urine Clarity


Nonpathologic Turbidity

o squamous epithelial cells and mucus (esp. specimens from women, can

result in a hazy)

o Amorphous : stand or are refrigerated

amorphous phosphates, carbonates in alkali : white turbid

amorphous urates in acidic : pink turbid

o improper preservation -> bacterial growth

Pathologic Turbidity

o RBCs (200 cells/mm3), WBCs (500 cells/mm3), and bacteria caused by

infection or a systemic organ disorder

o abnormal amounts of nonsquamous epithelial cells, yeast, abnormal

crystals, lymph fluid, and lipids

Lab. Correlations in Urine Turbidity


ภาวะ สิ่งที่เกี่ยวข้อง

Acidic Urine Amorphous urates Radiographic contrast media

Alkaline Urine Amorphous phosphates, carbonates

Soluble With Heat Amorphous urates, uric acid crystals

Soluble in Dilute Acetic Acid

RBCs Amorphous phosphates, carbonates

Insoluble in Dilute Acetic Acid

WBCs Bacteria, yeast Spermatozoa

Soluble in Ether Lipids Lymphatic fluid, chyle

ข้อใดบง่ช้ีว่าปัสสาวะท่ีขุ่นมีนัยส าคญัทางคลินิก


____ 1. พบแบคทีเรียในปัสสาวะ (ตั้งทิ้งไว)้

____ 2. ปัสสาวะสด มี squamous epithelial cells

____ 3. พบ spermatozoa ในปัสสาวะ

____ 4. พบ Cystine crystal ในปัสสาวะ

____ 5. ปัสสาวะ มี Amorphous phosphate

Physical Properties : Odor


Not routinely report

Odor Causes

Aromatic

Foul, ammonia-like

Fruity, sweet

Maple syrup

Mousy or musty

Rancid

Sweaty feet

Cabbage

Normal

Bacterial decomposition, UTI

Ketones (diabetes mellitus,

starvation, vomiting)

Maple syrup urine disease

Phenylketonuria

Tyrosinemia

Isovaleric acidemia

Methionine malabsorption

ข้อใดกล่าวถกูต้อง


____ 1. ปัสสาวะกล่ิน Mousy บ่งชี้ Bacterial infection

____ 2. ปัสสาวะของผู้ป่วย PKU มีกลิ่น Rancid

____ 3. ผู้ป่วยเบาหวานมีกลิ่นปัสสาวะแบบ Fruity

____ 4. Sweaty feet เป็นกลิ่นปัสสาวะ Isovaleric acidemia

____ 5. กลิ่น burnt sugar พบได้ในปัสสาวะของ MSUD

Physical Properties : Volume


Factor affecting urine volume

o fluid intake

o fluid loss from nonrenal sources

o variations in the secretion of ADH,

o need to excrete increased amounts of dissolved solids e.g.

glucose or salts

Normal

o Children 500 – 1400 mL/day

o Adult 600 – 1600 mL/day

Abnormal urine volume


Anuria urine < 100 mL/day

o serious damage to the kidneys

o decrease blood flow, shock, severe uremia

Oliguria urine < 500 mL/day

o excessive water loss (vomiting, diarrhea, perspiration, severe

burns), fever, acute glomerulonephritis, kidney stone, edema

Nocturia urine > 500 mL at night

Polyuria urine > 2000 mL/day

o DM, diabetes insipidus, chronic nephritis

o diuretics, caffeine, alcohol

Physical Properties : Specific gravity


บอกความสามารถของ kidney ในการ concentrate หรือ dilute urine

density of a solution compared with the density of a similar volume of distilled water at a similar temperature

Normal range :

o random : 1.003 – 1.035

o 24 hrs : 1.015 – 1.025

หาก urine เจือจางมาก อาจท าให้เซลล์บวมและแตก และพบ cast น้อยลง

แปลผลโปรตีนคู่กับ ถ.พ. เสมอ (เช่น protein 1+ ส าคัญใน low SG)

Increased : Dehydration, vomiting, DM, diarrhea

Decreased : DI

Physical Properties : Foam


White, small amount : Normal

White, large amount : possible protein

Yellow, large amount : may be due to bile / bilirubin

Urinometer


Hydrometer

Buoyancy

No longer recommended by

National Committee for Clinical

Laboratory Standards (NCCLS)

Requires a large volume

A calibrated floating device is

suspended in a volume of urine. Hg

urinometer

urine

Reading level

stem

Specific gravity measurement


Direct methods

o Urinometer : Density

o Harmonic oscillation densitometry (HOD) : Density

Indirect methods

o Refractometer : Refractive index

o Chemical reagent strips : pKa changes of a polyelectrolyte

Refractometer (TS meter)


Measures density of solutions by their refractive index (ratio of the velocity

of light in air to the velocity of light in solution)

o Comparing velocity of light passing through air to velocity passing

through the solution.

o More dense the solution the more altered (bent) the light will be.

Eye piece Cover plate

Measuring prism

Focus adjustment


Refractometer


Refractometer & Urinometer


Specimens with s.p. readings greater than the refractometer or

urinometer scale can be diluted and retested

a specimen diluted 1:2

o read : 1.025

o actual specific gravity : 1.050

Clinical correlations


SG of the plasma filtrate entering the glomerulus is 1.010

Isosthenuria:

o SG of 1.010

o Renal tubules lost absorption and secreting capability (kidney cannot

concentrate or dilute urine)

Hyposthenuria:

o SG lower than 1.010 (or 1.007)

o kidney can dilute the urine but is unable to concentrate

proximal renal tubule and loop of Henle function is retained but the

tubules are unresponsive to ADH

a primary ADH deficiency (central diabetes insipidus) or renal tubule

disease (nephrogenic diabetes insipidus).

Hypersthenuria:

o SG higher than 1.010

Clinical correlations


increased specific gravity

o dehydration, proteinuria, glycosuria, heart failure, renal stenosis,

syndrome of inappropriate antidiuretic hormone secretion, lipid

nephrosis

o falsely elevated : high-density compounds - dextrans and radiographic

dyes used in radiographs (>1.050 หรือ >1.035 แต่ไม่มี protein/sugar)

Decreased specific gravity

o excessive fluid intake, collagen disease, pyelonephritis, hypertension,

protein malnutrition, polydipsia, and diabetes insipidus.

o Diuretic medication as well as the natural diuretics (coffee, alcohol)

DM VS DI


ความถ่วงจ าเพาะน้อย ความถ่วงจ าเพาะมาก

ลดการหลัง่หรือออก ฤทธ์ิของ insulin

ลดการหลัง่หรือออก ฤทธ์ิของ ADH

ข้อใดกล่าวถกูต้อง


____ 1. ปัสสาวะปกติมีค่า ถ.พ. 1.003 - 1.035

____ 2. ปัสสาวะ ถ.พ. 1.010 เรียก Isosthenuria

____ 3. Hyposthenuria พบได้ใน SIADH

____ 4. Refractometer ใช้หลักการดัชนีหักเหแสง

____ 5. Nocturia หมายถึง ปัสสาวะ <500 mL ตอนกลางคืน

Chemical examination


Specific gravity

pH

Protein

Glucose

Ketones

Blood

Bilirubin

Urobilinogen

Nitrites

Leukocyte esterase

• Purpose of the test

• What is normal

• What is abnormal

• Reaction

• Cause of invalid results

Technique of reagent strips testing


Mix specimen well.

Let refrigerated specimens warm to room temperature before testing.

Dip the strip completely, but briefly, into specimen.

Remove excess urine by withdrawing the strip against the rim of the

container and by blotting the edge of the strip.

Compare reaction colors with the manufacturer’s chart under a good light

source at the specified time.

Be alert for the presence of interfering substances.

Understand the principles and significance of the test, read package inserts.

Relate chemical findings to each other and to the physical and microscopic

urinalysis results.



ใช้ fresh urine ผสมให้เข้ากันดี ไม่ต้องปั่น

จุ่มแถมทดสอบลงใน urine ให้ท่วม และไม่เกิน 1 วินาท ี

ยกแถบทดสอบ ปาดกับขอบภาชนะหรือซับกับทิชชู ่เพื่อก าจัดปัสสาวะส่วนเกินและสารเคมีจากแถบทดสอบปนกัน

จับเวลาและอ่านผล เทียบกับแถบสีมาตรฐาน

ข้อควรระวัง ควรทดสอบ urine ภายใน 2 ช.ม.

ถ้าเก็บ urine ในตู้เย็น ตั้งทิ้งที่ RT

แถบทดสอบควรเก็บในภาชนะทึบแสงหรือขวดสีชา มีสารดูดความช้ืน เก็บที่ RT

อย่าสัมผัสถูก reaction pad, หยิบออกเท่าที่จะใช้, ปิดขวดสนิททุกครั้ง

เมื่อเปิดขวดใหม่ ให้ใช้ภายใน 6 เดือน และลงวันที่เปิดที่ขวด

ไม่ใช้แถบทดสอบที่ expired หรือเปลี่ยนส ี

Care of Reagent Strips


Store with desiccant in an opaque, tightly closed container.

Store below 30oC; do not freeze.

Do not expose to volatile fumes.

Do not use past the expiration date.

Do not use if chemical pads become discolored.

Remove strips immediately prior to use.



1 2

3

Specific gravity


Based on a change in the pKa

of a polyelectrolyte on the

reagent pad

Increased ions in solution

causes the polyelectrolyte on

the pad to produce free H+

Free H+ cause a change in pH

on the reagent pad

Change in pH: bromothymol

blue indicator

Reaction Interference


วัดเฉพาะ ionic solutes จึงขจัดการ interfere จาก large organic

molecules เช่น urea and glucose, and by radiographic contrast

media

หากวัด ถ.พ. ด้วยวิธีอ่ืน อาจให้ผลต่างกันได้

False-positive

o ปริมาณโปรตีนที่สูงขึ้น อ่านค่าสูง เพราะ protein anion

False-negative: Highly alkaline urines

o pH 7 SGactual = SGread + 0.005

pH : Clinical significance


Aid in determining the existence of systemic acid-base

disorders

Treatment protocol may require urine pH be maintained at a

specific pH

Aids in identification of crystals during microscopic

examination

Normal pH: 4.5 – 8.0 (mostly are 5.0 - 6.5)

pH : Clinical significance


calcium oxalate precipitates ในภาวะ acidic

o maintaining urine at an alkaline pH discourage calculi

UTI ที่เกิดจาก urea-splitting organisms high pH

o Proteus, Pseudomonas, Klebsiella, Staphylococcus, and Mycoplasma.

o maintenance of an acidic urine can be of value in the treatment

Causes of Acid and Alkaline Urine


formation of bicarbonate following digestion

pH : Principle


Double indicator system

o Methyl red (pH range 4 to 6)

o Bromthymol blue (pH range of 6 to 9)

ควรใช้ fresh urine

จุ่มแล้วไม่ปาด urine ส่วนเกินอาจพา acidic buffer จาก protein pad ท าให้ low pH

Protein


Normal kidneys secrete little protein (<15 mg/dL or 150 mg

per 24 hours) (Qualitative test is negative)

Low-molecular weight serum proteins and proteins produced

in the genitourinary tract

o albumin is the major serum protein found in normal urine

o serum and tubular microglobulins

o Urokinase is produced by renal tubule

o Tamm-Horsfall protein produced by the tubules

o proteins from prostatic, seminal, and vaginal secretions.

Protein : Clinical significance


Proteinuria : > 150 mg/day

Indicator of early renal disease

Proteinuria also caused by non-renal disease

o Functional proteinuria : after excessive exercise, fever,

pregnancy, stress, exposure to heat or cold

o Postural/Orthostatic proteinuria : after prolonged standing

or walking (Increased pressure on the renal vein when in the

vertical position)

Three major categories of proteinuria


Causes of proteinuria

o Prerenal Proteinuria

o Renal Proteinuria : Glomerular and Tubular

o Postrenal Proteinuria

Degree of proteinuria

o Marked : >3.5 g/day

o Moderate : 0.5 – 3.5 g/day

o Minimal : <0.5 g/day

Prerenal proteinuria


Caused by increased levels of low molecular-weight plasma

proteins exceeds the normal reabsorptive capacity of the

renal tubules

o Hemoglobin (Hemolysis)

o Myoglobin (Rhabdomyolysis)

o Acute phase reactants associated with infection and

inflammation

o Bence Jones Protein (multiple myeloma)

Renal proteinuria


Glomerular Proteinuria

o มักเกิด heavy proteinuria

o ส่วนใหญ่เป็น albumin พบในโรค

Nephrotic syndrome : เกิดสูญเสียประจุลบของ glomerular basement membrane

Glomerulonephritis : มีการท าลาย glomeruli

Tubular Proteinuria

o ผิดปกติใน tubular reabsorption ของ low molecular weight protein (เช่น albumin, β2-microglobulin) moderate proteinuria

o พบในโรค

Fanconi syndrome, kidney graft rejection

exposure to toxic substances and heavy metals

severe viral infections

Postrenal proteinuria


เกิดใน lower urinary tract (ureters, bladder, urethra, prostate, and vagina)

Bacterial and fungal infections and inflammations produce exudates containing protein from the interstitial fluid

o Pyelitis

o Cystitis

o Urethritis

False proteinuria: vaginal discharge contamination

o Microscopic view : vaginal epithelium

Renal Proteinuria


ปกติ Glomerular disease

Tubular disorder

Total protein (g/day) Albumin (mg/day) 2-microglobulin (mg/day) การดูดซึมกลับโปรตีนที่ tubule (%)

<0.15 50 0.15 95

>2.5 >500 0.15 3

<2.5 <500 20 50

Mechanism of proteinuria


Over flow

o Low Mw protein มากในพลาสม่า renal tubule ดูดกลับไม่ทัน

o โปรตีนท าให้เกิด damage: Hb, myoglobin

Glomerular proteinuria

o Nephrotic syndrome: glomerular permeability albuminuria

o ปกติ Glomerular กรองโปรตีน 7-10 g/day พบในปัสสาวะ <150 mL/day

o เมื่อพบ proteinuria เก็บ 24-hrs urine Renal function test

protein excretion <500 mL/day ไม่ต้องตรวจเพ่ิมเติม

protein excretion >500 mL/day หรือ high creatinine หาพยาธิสภาพ

ท่อไตช ารุด

Secretion ของโปรตีน โดยไตหรือ epithelium ของ URT


Protein : Method


Reagent strip

o Principle : protein error of indicators

indicators change color in the presence of protein (แม้ว่า pH of medium ยังคงที่)

protein (albumin - more amino groups to accept H+) accepts H+ from the indicator

more sensitive to albumin (contains more amino groups to accept the H+ than other proteins)

ใช้ buffer pH 3

Sulfosalicylic Acid Precipitation Test or Robert’s test

Protein : Reagent strip


Reagents

o Multistix:Tetrabromphenol blue

o Chemstrip: 3′, 3′′, 5′, 5′′ tetrachlorophenol 3, 4, 5, 6-tetrabromosulfophthalein

False positive

o Highly buffered alkaline urine

o Pigmented specimens, phenazopyridine

o Quaternary ammonium compounds (detergents)

o Antiseptics, chlorhexidine

o Loss of buffer from prolonged exposure of the reagent strip to the specimen

o High specific gravity

False negative

o Proteins other than albumin

o Microalbuminuria

Robert test


Nitric acid ท าปฏิกิริยากับโปรตีน เกิดชั้นวงแหวนสีขาวขุ่น

ท าปฏิกิริยากับโปรตีนทุกชนิด

อ่านผล : Negative, Trace, 1+ ถึง 4+

False positive

o Turbid urine ต้องปั่นก่อน เพื่อเอา supernatant มาตรวจ

o วงแหวนสีขาวเกิดเหนือรอยต่อ 2-3 mm อาจเป็น mucin

o สารตัวกลางทึบรังสี

o ยากลุ่ม penicillin, sulfonamide, cephalosporin, tobutamide

False negative

o ปัสสาวะเป็นเบสมาก

Bence-Jones Protein


Monoclonal immunoglobulin light chains พบใน MM, Malignant lymphoma, macroglobulinemia

coagulates at temperatures between 40oC and 70oC and dissolves when the temperature reaches 100oC

วิธีทดสอบ : Heat and acid test, MTSA, Immunoelectrophoresis

Heat and acid test

o ถ้า Robert Test (+) อาจมี Bence-Jones protein

o 10% acetic acid ปรับ pH ปัสสาวะเป็น 5

o แช่ที่ 70oC ถ้าขุ่นแสดงว่า __________ รีบปั่นทื่ 3000 rpm พบตะกอนขาว

o ดูด supernatant ทิ้ง, ใส่ normal urine, conc. Nitric acid แล้วต้มเดือด

o ตั้งให้เย็น กรอง แล้ววัดด้วยวิธี Robert

Modified p-toluene sulfonic acid test

o p-toluene sulfonic acid ตกตะกอน Bence-Jones protein โดยไม่ตกตะกอน albumin

จงเติมหมายเลขหน้าสาเหต ุproteinuria

1 = Prerenal 2 = Renal 3 = Postrenal


____ 1. Microalbuminuria

____ 2. Acute phase reactants

____ 3. Vaginal inflammation

____ 4. Multiple myeloma

____ 5. Prostatitis

2 1 3 1 3

Glucose


Normal blood glucose =

ถูก reabsorb หมด ยกเว้น เกิน renal threshold เกิด glycosuria

สาเหตุ glycosuria

o hyperglycemia -> prerenal condition

DM, Liver disease, Pancreatic disease, CNS damage, ยา เช่น steroid และยาขับปัสสาวะ

Hormone disorder : Hyperthyroidism, Acromegaly, ภาวะหล่ัง epinephrine และ glucocorticoids สูง เช่น เครียด Cushing’s syndrome

o impaired tubular reabsorption -> renal condition (normoglycemia)

Fanconi syndrome, toxic from heavy metal, pregnancy

o อาจตรวจพบหลังทานอาหาร จึงควรตรวจหลังทานอาหาร > 2 hrs หรือหลังตื่นนอนตอนเช้า ถ่ายครั้งที่ 2

Glucose


Reagent strip (ตรวจพบ glucose ตั้งแต่ 75 - 125 mg/dl)

o principle : double sequential enzyme reaction

Multistix: Potassium iodide (green to brown)

Chemstrip: Tetramethylbenzidine (yellow to green)

o False positive : peroxide or strong oxidizing detergents.

o False negative

reducing agents : ascorbic acid (อาจอยู่ในยา e.g. tetracycline)

high ketones level (when low glucose concentrations)

High specific gravity and low temperature --> sensitivity

Glucose : Method


Copper Reduction Test

o Clinitest tablet : เม็ดยามี Cu2SO4, Na2CO3, anhydrous NaOH, Citric acid ตรวจพบตั้งแต่ 250 mg/dl Na2CO3 + Citric a. - Effervescent NaOH + H2O + Citiric a. - Heat release CO2 - prevent room air

o Benedict’s test : ตรวจพบตั้งแต่ 30 - 50 mg/dl

CuSO4 + reducing substances CuOH + Cu

2O + Oxidized substances + H

2O

heat

alkali (yellow) (red)

Ketone bodies


intermediate products of fat metabolism

o acetone (2%), acetoacetic acid (20%), and betahydroxybutyric acid (78%)

Clinical significance

o Diabetic acidosis (DM 1), Insulin dosage monitoring, Starvation, inability to metabolize carbohydrate, Malabsorption/pancreatic disorders, Strenuous exercise, increased loss of carbohydrate from vomiting

spontaneous decarboxylation -hydroxybutyric dehydrogenase

Ketone bodies


Correlation with glucose test : ถ้ากลูโคส 3+ - 4+ ควรตรวจคีโตนบอดีในปัสสาวะทุกครั้ง

Methods : Reagent strip, Acetest

False positive

o phenolsulfonphthalein, bromsulphalein, phenylketone ท าปฏิกิริยาได้

o Highly pigmented red urine, High specificity, Levodopa metabolite

o Medications containing free sulfhydryl groups: mercaptoethane sulfonate sodium (MESNA) and captopril

False negative

o improperly preserved specimens : volatilization of acetone and the breakdown of acetoacetic acid by bacteria

Ketone bodies : Acetest


Sensitivity ต่อ acetoacetic acid เท่ากับ strip คือ 5 - 10 mg/dL

sensitive ต่อ acetone (20-25 mg/dL) มากกว่า strip (50-70 mg/dL)

Acetest tablet contains

o sodium nitroprusside, glycine, strong alkaline buffer (disodium phosphate)

o Lactose - gives better color differentiation

Advantage : be used for serum, plasma, and other body fluid testing

Interfering factors เหมือนกับ reagent strip

5–10 mg/dL 30–40 80–100

Blood



o Hematuria : Renal calculi, Glomerulonephritis, Pyelonephritis, Tumors, Trauma, Exposure to toxic chemicals, Anticoagulants, Non-pathologic (Strenuous exercise, menstruation)

o Hemoglobinuria : (ถ้ามากเกิด acute renal failure)

Hemolysis in URT : Hematuria + Hemoglobinuria

Transfusion reactions, Hemolytic anemias, Severe burns, Infections/malaria, Strenuous exercise/red blood cell trauma

o Myoglobinuria : rhabdomyolysis Muscular trauma, Prolonged coma, Convulsions, Alcoholism/overdose, Drug abuse, Cholesterol-lowering statin medications; ถ้า myoglobin (heme) ออกมามาก จะท าลายเนื้อไต เกิดไตวายเฉียบพลัน

Method

o Benzedine test (carcinogen, high false negative)

o Reagent strip

Blood : Reagent strip


Principle : pseudoperoxidase activity of hemoglobin

green-blue color

tetramethylbenzidine

Blood : Reagent strip


False positive

o Strong oxidizing agents

o Bacterial peroxidases

o Menstrual contamination

False negative

o High SG, High protein -> slow hemolysis

o Formalin

o Captopril

o High concentrations of nitrite > 10 mg/dL

o Ascorbic acid >25 mg/dL

o Unmixed specimens

Differentiation of 3 clinical significance


Characteristic Hematuria Hemoglobinuria Myoglobinuria Urine color

Occult blood

Plasma appearance

Serum CK

LDH

LD isozyme 1&2

LD isozyme 4&5

Haptoglobin

Cloudy, red

+

Normal

Normal

Normal

Normal

Normal

Normal

Pink, red or brown

+

Pink-red

<10 X upper

reference limit

High

High

Normal

Low

Red or Brown

+

Normal

>40 X upper

reference limit

High

Normal

High

Normal

Nitrite: Clinical significance


Rapid screening test for the presence of UTI (Pyelonephritis, cystitis)

detecting initial cystitis, because patients are often asymptomatic or have vague symptoms that would not lead the physician to request a urine culture

Evaluation of antibiotic therapy

Monitoring of patients at high risk for UTI (diabetes, pregnant women)

Screening of urine culture specimens

combination with the leukocyte esterase

Nitrite : Reagent strip


Principle : Nitrite is detected by the Greiss reaction

o Gram negative bact. ปล่อย nitrate reductase

o nitrite (acidic pH) reacts with an aromatic amine to form a diazonium compound

o then reacts with tetrahydrobenzoquinolin compounds to produce a pinkcolored azodye

Confirm positive : Culture & Microscopic exam.

Diazotization reaction

Azo-coupling reaction

Ar-N+ N

Ar-N+ N

Aromatic amine (Ar-NH2)

Ar’ Ar-N=N-Ar’

Nitrite : Reagent strip


False positive

o Improperly preserved specimens (Bact. contamination)

o Medication containing azo compounds e.g. phenazopyridine, Highly pigmented urine -> red urine, red color in acidic medium

False negative

o Nonreductase-containing bacteria e.g. gram pos entercocci, yeast

o Insufficient contact time between bacteria and urinary nitrate (<4 hrs)

o Lack of urinary nitrate (from green vegetables)

o Large quantities of bacteria converting nitrite to nitrogen

o Presence of antibiotics

o Ascorbic acid>25 mg/dl: reduce diazonium salt -> neg./slowdown rx

o High specific gravity, pH < 6 -> reduce sensitivity

Leukocyte esterase


Detects the presence of esterase in the azurophilic granules of granulocytic WBCs and monocytes

Neutrophils are the leukocytes most frequently associated with bacterial infections, สลายตัวเร็วในปัสสาวะ เพราะ phagocytic activity

LE จะมีประโยชน์มาก เมื่อ pH, Nitrite +, WBCs and Bacteria in urine sediments

LE also are present in Trichomonas, Chlamydia and histiocytes

ตรวจไม่พบ LE มิได้หมายความว่าไม่มี infection


o Bacterial and nonbacterial urinary tract infection (Trichomonas, Chlamydia, yeast)

o Inflammation of the urinary tract

o Screening of urine culture specimens (ดูร่วมกับ nitrite)

Principle : Ester hydrolysis + azo coupling reaction

requires the longest time of all the reagent strip reactions (2 minutes)

Leukocyte esterase : Reagent strips


Ester hydrolysis

Azo-coupling

Ar-N+ N Ar-N=N-Ar’

Ar’ ester

(azo dye)

Multistix

Chemstrip

Highly pigmented urine, nitrofurantoin, bilirubin ท าให้อ่านผลยาก เพราะ strip อาจเปลี่ยนเป็นสีเขียวแทนม่วง

False positive

o Strong oxidizing agents e.g. detergent

o Formalin

False negative

o High SG crenation of WBC release of LE

o Glucose > 3 g/dL, albumin > 500 mg/dL, oxalic acid

o ascorbic acid reduce diazonium salt

o Antibiotics e.g. gentamicin, cephalosporins, tetracyclines -> decrease sensitivity of rx

o inaccurate timing

Leukocyte esterase : Reagent strips



Heme สลายเป็น bilirubin ใน macrophage ที่ระบบ RE

Unconjugated bilirubin จับกับ albumin แล้วส่งไปที่ตับ

Conjugated bilirubin ถูกหลั่งเข้าไปในน้้าดีและไปที่ลา้ไส้

2

3

5

UBG ที่เหลือ ถูกส่งไปที่ไต แล้วเปลี่ยนเป็น urobilin

9

Bilirubin ถูก conjugate ด้วย glucuronic acid

4

UBG บางส่วน ถูกดูดซึมจาก gut และเข้า portal blood

7

เม็ดเลือดแดงหมดอายุเป็นแหล่งของ hemoprotein 1


RE System

Urobilinogen @ 10 - 15%

เกือบทั้งหมด

เพียงเล็กน้อย

Hemoglobin degradation

oxidize

Urine : Conjugated bilirubin

o Normal : Negative

Plasma Conjugated bilirubin

o Normal < 0.2–0.4 mg/dL

o TB 1.0 mg/dL


o bile duct obstruction e.g., gallstones or cancer

o Liver disease : Hepatitis and cirrhosis

Methods

o Reagent strip

o Harrison’s spot test

o Ictotest

Bilirubin


Principle : Diazo Reactions

False-positive:

o ยาท าให้ปัสสาวะแดงในภาวะกรด เช่น phenazopyridine, chlorpromanize metabolite

o Indican (intestinal disorders) ปัสสาวะมีสีเหลืองส้ม รบกวนแปลผล

o Metabolites of Lodine รบกวนแปลผล

False-negative:

o Specimen exposure to light

o Ascorbic acid >25 mg/dL รบกวน reaction

o High concentrations of nitrite ลด sensitivity

Bilirubin : Reagent strip


(pink) (azobilirubin)

• Multistix: 2,4-dichloroaniline diazonium salt

• Chemstrip: 2,6-dichlorobenzene-diazonium salt

Principle : Diazo Reactions

Sensitive to 0.05 to 0.10 mg/dL ไวกว่า reagent strip (0.4 mg/dL)

less subject to interference

เม็ดยา ประกอบด้วย

o diazonium salt: 2,6-dichlorobenzene-diazoniuimtetrafluoroborate

o sodium bicarbonate react w SSA -> effervescence

o SSA -> acid environment

Bilirubin : Ictotest

ทนพ.สวิุทย ์คล่องทะเล 81 negative moderate large

• หยดปัสสาวะ • วางเม็ดยา • หยดน้ า

False positive large doses of chlorpromazine แก้ไขโดย wash-through technique

washed unwashed

drug metabolites

bilirubin

Principle : Oxidation of bilirubin by FeCl2 o BaCl2 combines กับ sulfate radicals ใน urine เกิด precipitate of barium

sulfate (bile pigments will adhere to these molecules)

o Ferric chloride ในภาวะมี trichloroacetic acid จะ oxidize bilirubin to biliverdin

Fouchet reagent : Cl3C-COOH, FeCl2, DW

Procedure

o หยดปัสสาวะบน BaCl2 absorbent mat

o หยดน้ ายา Fouchet ทับตรงขอบปัสสาวะ

o Negative : ไม่มีสีเขียว; เกิดสีเขียว : Trace, 1+ - 4+

Sensitivity : 0.005–0.1 mg/dL of bilirubin

Bilirubin : Harrison’s spot test


Conjugated bilirubin + FeCl2 Biliverdin

False positive • Aspirin metabolite react กับ

FeCl2 เกิดสีม่วง บังสี biliverdin

• ปัสสาวะเข้มจาก Pyridium

Bilirubin : Foam test


Urine สี yellowish-brown or greenish-yellow color

เขย่าแล้วมีฟองสี yellow or greenish-yellow (Bilirubin alters the

surface tension of urine and foam will develop after shaking)

False positive

o phenazopyridine

Urobilinogen


Normal Urine : < 1 mg/dL or Ehrlich unit (EU) [0.5 - 2.5 mg/day]

Unstable and rapidly oxidized to urobilin (orange-red) should be refrigerate and prevent from light หรือใช้ fresh specimen

Clinical Significance :

o Increase UBG

liver disease: hepatitis, cirrhosis, heart failure

hemolytic disorders: HA, pernicious anemia, malaria

o Decrease or absent UBG (detect ไม่ได้ด้วย screening test)

obstruction of the bile duct : นิ่วในถุงน้ าดี, โรคอักเสบรุนแรงหรือเนื้องอก

intestinal bacteria ลดจ านวนลงจาก antibiotic

Urobilinogen : Method


Excretion reaches peak levels between 2 and 4 PM

ควรทดสอบภายใน 30 นาที หลังเก็บ urine

ถ้าเป็น 24 hrs urine ต้องใส่ preservative คือ sodium carbonate ที่ปราศจากน้ า และเก็บในขวดสีน้ าตาล

Method

o Reagent strip

o Watson-Schwartz Differentiation Test (Qualitative test)

o Modified of Wallace & Diamond method (Semiquantitative test)

Urobilinogen : Reagent strips


Multistix and Urobilistix Principle : Ehrlich’s aldehyde reaction

False positive o Ehrlich-reactive compounds : porphobilinogen, indican, p-aminosalicylic

acid, sulfonamides, methyldopa, procaine, and chlorpromazine compounds

o Highly-pigmented urine, Azo dye (Phenazopyridine), riboflavin, p-aminobenzoic acid

o ปัสสาวะถ่ายใหม่ เพราะ sensitivity แปรผันตรงกับ temperature False negative o Old specimens : instability of UBG o Preservation in formalin

Ehrlich units (EU)

Urobilinogen : Reagent strips


Chemstrip (more specific)

Principle : azo-coupling (diazo) reaction

False positive

o Highly-pigmented urine

o Azo dye (Phenazopyridine), riboflavin, p-aminobenzoic acid

False negative

o Old specimens

o Preservation in formalin

o High concentrations of ascorbic acid and nitrite

mg/dL

Urobilinogen : Watson-Schwartz Test


differentiating between urobilinogen, porphobilinogen, and Ehrlich-reactive compounds

Principle : Ehrlich’s aldehyde reaction

UBG/PBG + Ehrlich’s reagent Cherry-Red

2.5 mL urine 2.5 mL Ehrlich reagents 5.0 mL sodium acetate

(Ehrlich-reactive compound) (p-dimethylaminobenzaldehyde in HCl)

ท าให้สีเข้มขึ้น และยับยั้งการเกิดสีของ indole และ skatole ใน urine

5 mL chloroform 5 mL butanol



UBG ละลายได้ทั้งใน Butanol และ Chloroform

PBG ไม่ละลาย

Intermediate Ehrlich reactive compound ละลายเฉพาะใน butanol

ก่อน report หลอดที่ positive ทั้งสองสาร ต้องทดสอบโดยการดูดส่วนบนของหลอด chloroform extraction มาเติม chloroform แล้วสังเกตผล



Urobilinogen

Other Ehrlich-

Reactive

substances

Porphobilinogen

Chloroform Extraction

Urine

(Top Layer)

Chloroform

(Bottom Layer)

Colorless

Red

Red

Colorless

Red

Colorless

Butanol Extraction

Butanol

(Top Layer)

Urine

(Bottom Layer)

Red

Colorless

Red

Colorless

Colorless

Red



ข้อควรระวัง

Indole, indole-3 acetic acid และ phylloerythinogen ท าปฏิกิริยากับ Ehrlich reagent และละลายใน chloroform ท าให้เกิด false positive ของ UBG

หากปฏิกิริยาเป็นสีส้มอ่อนๆ อ่านเป็น negative

Modified of Wallace & Diamond method


Semiquantitative method ส าหรับหา UBG หลังจากท า Watsan-Schwartz test

Principle : Ehrlich reaction of diluted urine in each dilution

Normal value : ไม่เกิน Dilution 1:20 (2-4 P.M. ไม่เกิน 1:40)

5 mL 5 mL 5 mL 5 mL

DI (mL)

Urine (mL) Dilution

- 9 5 5 5 5 5

5 1 - - - - - - 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320

5 mL 5 mL

0.5 mL Ehrlich reagent

Incubate for 5 min.


Urine Bilirubin and Urobilinogen in

Jaundice


Classification of Jaundice


Type of jaundice

Example of disease

Plasma free bilirubin

Urine direct bilirubin

Urine urobilinogen

Stool color

Normal 0-1.3 mg/dL Absent 1 mg/dL ปกติ/น้ าตาล

Hemolytic HA HDN

High Absent High น้ าตาลเข้ม

Hepatic Hepatitis Cirrhosis

High High N/H/L ปกติ/น้ าตาล

อ่อน

Obstructive Gall stone Tumor Normal High Low/Absent

น้ าตาลอ่อน/ขาวคล้ายชอล์ก

ทนพ.สวิุทย ์คล่องทะเล 96 Excess ascorbic acid can interfere bilirubin, blood, LE, nitrite, UBG, and glucose and may result in false low results

Summary of Reagent strip test


Parameters Principle Reference Range

Specific Gravity pKa change of polyelectrolyte 1.003 - 1.035

pH Double-indicator system 4.5 - 8.0 (5 - 6.5)

Protein Protein error of indicator Negative

Glucose Double sequential enzyme reaction Negative

Ketones Sodium nitroprusside reaction Negative

Blood Pseudoperoxidase activity of Hb Negative

Nitrite Griess’s reaction Negative

LE Hydrolysis of acid ester by esterase Negative

Bilirubin Diazo reaction Negative

Urobilinogen Ehrlich’s reaction or diazo reaction < 1 mg/dl

Abnormal urine dipstick findings


Urine dipstick test

Nonpathologic causes Pathologic causes

SG Low : polydipsia

High : inadequate volume intake

Low : DI, renal tubular dysfunction

High : volume depletion

pH Low : high protein diet

High : low protein diet, recent meal

Low : acidosis

High : renal tubular acidosis

(inappropriate renal response), UTI

Blood Menses, traumatic catheterization,

exercise

Glomerular disorders, tubular

disorders, UTI, stones, hypercalciuria,

urinary tract trauma, tumor

Protein Orthostatic proteinuria, fever,

exercise

Glomerular disorders, tubular

disorders, UTI

Patel HP, Pediatr Clin North Am. 2006

Abnormal urine dipstick findings


Urine dipstick test

Nonpathologic causes Pathologic causes

Glucose Renal glycosuria Diabetes mellitus, Fanconi syndrome

Ketones Restricted carbohydrate intake Diabetes mellitus

Bilirubin None Hepatitis, biliary obstruction

Urobilinogen Low: systemic antibiotic therapy Hepatitis, intravascular hemolysis

Nitrite None UTI

LE Fever UTI, glomerulonephritis, pelvic

inflammation


false positive and false negative

results in urine dipstick testing


Urine dipstick test

False positives False negatives

SG Contamination during collection/

storage

None

pH High pH from urease producing

organisms (eg, Proteus mirabilis),

prolonged standing of urine

Low pH from mixing of reagents

from adjacent test pads

Blood Oxidizing contaminants

(eg, hypochlorite), microbial

peroxidase associated with UTI

High ascorbic acid, large nitrites,

high SG

Protein Fever, exercise, alkaline urine,

concentrated urine, presence of

cells/bacteria in urine

Dilute urine, low molecular weight

proteins





Urine dipstick test


Glucose Strong oxidizing agents in urine

container

Ascorbic acid, high SG, exposure to

humid environment

Ketones Captopril, methyldopa Prolonged standing of urine,

moisture on test pad

Bilirubin Rifampin, chlorpromazine Ascorbic acid, prolonged standing in

light

Urobilinogen Alkaline urine, sulfonamidesa Broad-spectrum antibiotics,

discolored urine, prolonged standing

in light

Patel HP, Pediatr Clin North Am. 2006 a For Multistix (Bayer Corporation, Elkhart, Indiana).




Urine dipstick test


Nitrite Urine contamination, medications

that turn urine color to red, gross

hematuria

Inadequate dietary nitrate intake

(vegetables), non–nitrate-reducing

bacteria, insufficient incubation time

for conversion of nitrate to nitrite,

ascorbic acid, high urobilinogen

LE Contamination with vaginal fluid,

oxidizing agents, Trichomonas

Ascorbic acid, high protein, high

glucose, high SG, cephalosporins,

tetracycline, nitrofurantoin


References


บุญทรง ปรีชาบริสุทธิ์กุล, อังกูรา สุโภคเวช, บรรณาธิการ. ปัสสาวะ. กรุงเทพฯ: ภาควิชาจุลทรรศนศาสตร์คลินิก คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยมหิดล; 2548.

มานะ โรจนวุฒนนท์, บรรณาธิการ. พยาธิวิทยาคลินิก. พิมพ์ครั้งที่ 2. กรุงเทพฯ: ภาควิชาพยาธิวิทยาคลินิก คณะแพทยศาสตร์โรงพยาบาลรามาธิบดี มหาวิทยาลัยมหิดล; 2556.

นิศารัตน์ โอภาสเกียรติกุล, วัฒนา เลี้ยววัฒนา, ดาราวรรณ วนะชิวนาวิน, มงคล คุณากร, วนิดา วงศ์ถิรพร, บรรณาธิการ. พยาธิวิทยาคลินิก. กรุงเทพฯ: สมาคมพยาธิวิทยาคลินิกไทย; 2545.

Patel HP. The abnormal urinalysis. Pediatr Clin North Am 2006 Jun;53(3):325-37, v.

Mundt LA, Shanahan K. Graff’s Textbook of Routine Urinalysis and Body Fluids. 2nd ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2011.

Strasinger SK, Lorenzo MSD. Urinalysis and Body Fluids. 5th ed. Philadelphia: F. A. Davis Company; 2008.

Education

Physical & chemical examination of urine