9. Solubiologian tutkimusmenetelmiä

Alle olen koonnut muutaman solubiologiassa yleisesti käytetyn

tutkimusmenetelmän. Suurin osa menetelmistä on nykyisin automatisoitu, mutta

on tärkeätä, että ymmärrät niiden taustalla olevat ajatukselliset periaatteet.

Solubiologian tutkimusmenetelmät kehittyvät sellaisella nopeudella, että niiden

kattava kuvaaminen on mahdotonta. Olennaista kuitenkin on tietty solubiologisen

tutkimuksen perusmeininki, nimittäin se, että ala tarjoaa valtavasti

ideointimahdollisuuksia luoville persoonille.

Meininkiin kuuluu myös pieni annos eräänlaista noituutta. Tutkimuksissa ei juuri

milloinkaan tapahdu mitään ihmeellistä tai edes näkyvää. Koeputkissa ja

pipeteissä käsitellään lähinnä pisaroiksi luokiteltavia näytemääriä. Työvaiheiden

päättyessä näytteet usein ulkoisesti näyttävät aivan samalta kuin töiden

alkaessakin. Noitamaisten rituaalien lopputuloksena kuitenkin esimerkiksi

siirtogeenisissä eliöissä ilmenee perin juurin kouriintuntuvia uusia ominaisuuksia.

Geenitutkimuksen kehitys on perustunut moninaisiin oivalluksiin, joita yksittäiset

tutkijat tai tutkimusryhmät ovat sattumoisin saaneet. Jännittävää on nähdä,

millaisia neronleimauksia tulevaisuus tuokaan tullessaan! Mieti siis, miltä on

mahtanut tuntua tutkijoista, jotka ovat keksiskelleet mm. tässä esittämiäni

menetelmiä.

9.1. Yhdistelmä-DNA-tekniikassa käytettävät työkalut

Ennen varsinaisiin menetelmiin tutustumista käymme läpi merkittävimmät

geenitekniikassa käytetyt työkalut. Jotta ymmärrät, mitä työkaluasioista selitän,

sinun tulee etukäteen selvittää itsellesi käsite 3´→ 5´-suunta. Tämä käsite selviää

kirjallisissa kurssimateriaaleissamme olevasta tiedostosta, jonka otsikkona on ”

DNA-replikaatio”.

Yhdistelmä-DNA-tekniikalla tarkoitetaan DNA-jaksojen siirtämistä solusta toiseen

(ensimmäinen onnistuminen vuonna 1972 tuloksena Nobel-palkinto). Bakteeri- ja

hiivasoluihin siirretyillä geeneillä tuotetaan jo ihmisen insuliinia, kasvuhormonia ja

interferonia sekä niitä tuman sisäisiä entsyymejä (proteiineja), joita geenitekniikka

yleisesti tarvitsee työkaluikseen. Viimeksi mainittujen keksiminen on luonnollisesti

ollut koko toiminnan edellytys.

Tärkeimpiä yhdistelmä-DNA-tekniikassa tarvittavia entsyymejä ovat:

1) RNA- ja DNA-polymeraasi

- rakentavat asianomaisia nukleotidiketjuja

- geenien monistamisessa eli PCR:ssä käytetään nykyisin kuumissa lähteissä

elävien bakteerien polymeraaseja

2) Käänteiskopioijaentsyymi eli käänteistranskriptaasi

- rakentaa lähetti-RNA:sta asianomaisen DNA-jakson

- tekee siis transkription takaperin

- eristetty retroviiruksista (esim. HIV on retrovirus)

3) DNA- ja RNA-ligaasi

- liittää yhteen nukleotidijaksoja

4) Restriktioentsyymit

- katkovat nukleiinihappoja kukin tietyn emäsjärjestyksen kohdalta, jättäen

leikkauskohtiin lyhyen yksijuosteisen jakson ”sticky end” (tahmea pää,

muutama esimerkki alla kuvassa 55)

- samalla restriktioentsyymillä katkaistujen DNA-jaksojen sticky endeissä on

toistensa kanssa pariutumiskykyiset emäsjaksot, joten kohdatessaan ne

kiinnittyvät itsestään kiinni toisiinsa

- edellisen ominaisuuden vuoksi restriktioentsyymit ovat käteviä silloin, kun

DNA-jaksoja halutaan leikata irti ja siirtää solusta toiseen

- restriktioentsyymien avulla voidaan määrätä, millainen emäsjärjestys tulee

irrotettavan DNA-jakson kumpaankin päähän (tämä helpottaa esimerkiksi

PCR-tekniikassa tarvittavien alukkeiden eli praimereiden valintaa)

- restriktioentsyymejä tuottavia geenejä on eristetty bakteereista ja tunnetaan

yli 100 erilaista

- seuraavassa on joitakin sticky end –esimerkkejä (DNA:n katketessa DNA

muuttuu yksijuosteiseksi lihavoinnilla merkittyjen emäsjärjestysten kohdalla,

lihavoimattomat emäkset tarvitaan lihavoitujen jaksojen naapureiksi, jotta

restriktioentsyymi tunnistaisi katkaisupaikan)

Kaikki edellä luetellut entsyymit ovat proteiineja ja niitä tuotetaan teollisesti

mikrobien, lähinnä koli-bakteerin (Eschericia coli) avulla.

Siirettäviä DNA-jaksoja voidaan ”viritellä” nykyisin lähes kaikin mahdollisin tavoin.

Niihin voidaan liittää halutunlaisia sticky end –jaksoja, niiden säätelyosia voidaan

vaihtaa toisenlaisiksi yli lajirajojen, sticky end –päitä voidaan leikata tylpiksi,

siirtogeeneihin voidaan liittää esim. 200 nukleotidin mittaisia halutunlaisia

emäsjaksoja, DNA:han tai RNA:han voidaan liittää sellaisia nukleotideja, joissa

G AATTC C TTAA G

G GATC CC CTAG G

A AGCT T T TCGA A

G TCGA C C AGCT G

GC GC CG CG

Tämä katkaisupaikka jää tylpäksi, siis ilman sticky end –päätettä.

Kuva 55. Esimerkkejä restriktioentsyymeille ominaisista katkaisupaikoista.

roikkuu monoklonaaliseen vasta-aineeseen liitettyjä fluoresoivia eli valoa hohtavia

lisäosia jne.

Useimpien geenitekniikassa käytettyjen tutkimusmenetelmien käyttö alkaa siitä,

että tutkittavasta DNA-jaksosta tuotetaan PCR-menetelmällä riittävän paljon

kopioita.

Toinen monessa eri menetelmässä toistuva työvaihe on nimeltään elektroforeesi.

Siinä läskiä muistuttavan elektroforeesihyytelölevyn toiseen päähän (valmistettu

etupäässä keittiöstä tutuista aineksista) tehtyyn viiltoon tipautetaan pisara

esimerkiksi DNA:ta, RNA:ta tai proteiinimolekyylejä sisältävää näytettä.

Kun levyn läpi tämän jälkeen johdetaan sähkövirta, tutkittavan näytteen sisältämät

molekyylit alkavat liikkua virran mukana. Mitä lyhyemmästä molekyylistä on

kysymys sitä nopeammin (= pitemmälle) se läskin sisällä liikkuu. Jokaisesta

molekyylien kokoluokasta muodostuu näin oma raitansa läskin sisälle (raidat

näkyvät UV-valossa). Raitojen määrä kertoo, kuinka monta molekyylien

kokoluokkaa näytteessä on.

Tapahtumaa voitaisiin verrata repun kantamiseen. Kevyttä reppua (pieniä

molekyylejä) jaksaa kuljettaa nopeasti ja pitkälle, raskasta reppua (suuria

molekyylejä) taas hitaasti ja vain lyhyen matkan. Repun kantajaa

elektroforeesissa vastaa sähkövirta (Kuva 56).

Alla olevasta menetelmien luettelosta puuttuvat monoklonaalisten vasta-aineiden

käyttöön liittyvät sovellutukset. Ne olen esitellyt immunologiaa käsittelevän

tiedostoni yhteydessä.

9.2. PCR-menetelmä (kuva 57 alla)

PCR-menetelmä alkaa siitä, että koeputkeen lisätään kopioitavan DNA-näytteen

ohella DNA-polymeraasia, DNA-nukleotideja ja praimereita. Praimereiden

emäsjärjestys tulee valita sellaiseksi, että se vastaa DNA-näytteen 3´-päissä

olevia emäsjärjestyksiä. Tämä emäsjärjestys taas määräytyy DNA-jakson

irtileikkaamisessa käytettävän restriktioentsyymin perusteella (Helppoa tietää

siis!). Erilaisia praimereita saa nykyisin ostaa pullossa.

Yhden kopiointikierroksen jälkeen tuloksena on kaksi alkuperäisen kaltaista DNA-

molekyyliä. Seuraavan kierroksen jälkeen kopioita on neljä, sitten kahdeksan,

kuusitoista jne. Koska yksi kierros kestää parisen minuuttia, saadaan vaikkapa

kahden tunnin aikana kaksi potenssiin 60 kappaletta kopioita.

+-

+-

Kuva 56. Elektroforeesin toimintatapa. Kun sähköä johtavan elektroforeesilevyn päihin kytketään elektrodit, alkavat näytteessä (sininen viiva) olevat molekyylit liikkua levyn sisällä sähkövirran mukana. Pienet molekyylit liikkuvat nopeammin kuin suuret. Lopulta molekyylien kokoluokat erottuvat levyssä omina raitoinaan (harmaat juovat).

Menetelmässä käytetään nykyisin DNA-polymeraasia, joka on eristetty Thermus

aquaticus –nimisestä bakteerista. Tämä laji elää kuumissa lähteissä ja sen

lämpötilaoptimi on 75 C astetta. Elintavastaan johtuen lajin DNA-polymeraasi

kestää lämmityksen myös 98 C asteeseen. Tämän ominaisuuden vuoksi DNA-

polymeraasia ei tarvitse lisätä PCR-putkeen enää reaktiokulun aikana.

Kuva 57. PCR-menetelmä eli geenien kopioiminen koeputkessa

3´AATCGTAGCTAAGGTTCTTCGATT5´

3´AATCGTAGCTAAGGTTCTTCGATT5´

5´TTAGCATCGATTCCAAGAAGCTAA3´

5´TTAGCATCGATTCCAAGAAGCTAA3´

3´AATCGTAGCTAAGGTTCTTCGATT5´

Kuumennus + 98 C, jolloin DNA avautuu kahdeksi yksijuosteiseksi molekyyliksi

GATT5´

5´TTAGCATCGATTCCAAGAAGCTAA3´ 5´TTAG

3´AATCGTAGCTAAGGTTCTTCGATT5´

Lämmitys 75 C:een, jolloin DNA polymeraasi alkaa toimia

Monistettava DNA-näyte

Jäähdytys 45 C:een, jolloin praimerit (merkitty harmaalla) kiinnittyvät paikoilleen ihan itsestään..

Yhden kierroksen jälkeen tuloksena on kaksi alkuperäisen DNA-jakson kaltaista kopiota.

5´TTAGCATCGATTCCAAGAAGCTAA3´ 3´AATCGTAGCTAAGGTTCTTCGATT5´

5´TTAGCATCGATTCCAAGAAGCTAA3´

9.3. Vektorit eli geenikuljettimet (siis vähän niin kuin traktorit)

Yhdistelmä-DNA-tekniikassa tarvitaan DNA-jakson kohdesoluun kuljettavia

apulaisia, niin sanottuja vektoreita.

Bakteerien perimää muutettaessa tärkein vektorityyppi ovat plasmidit eli

rengasmaiset DNA-jaksot. Siirrosgeeni on siirrettävissä näihin. Bakteerit ahmivat

plasmideja sisälleen kasvatusmaljalta.

Eläin- ja kasvisoluihin siirrosgeenit viedään usein viruksen avulla ja sen genomiin

kytkettynä. Tekniikkaa sovelletaan usein myös bakteereihin. Suora mikroinjektio eli

ruiskutus tumaan on myös joskus mahdollista.

Kasveihin geenit saadaan siirrettyä käyttämällä vektorina Agrobacterium-suvun

maaperäbakteereita (=agrobakteereita). Nämä siirtävät omia plasmidejaan

kasvisoluihin siten, että ne kiinnittyvät saumattomasti kasvikromosomien osiksi.

Solun jakautuessa kromosomien mukana kulkevat siirtogeenit siirtyvät kaikkiin

tytärsoluihin. Tämä on valtava etu, sillä ellei siirtogeenejä saada liittymään

kromosomeihin, siirretyt DNA-jaksot usein hukkuvat soluista niiden jakautuessa.

Ilmeisesti katoaminen johtuu siitä, että mitoosin metafaasissa muodostuva

tumasukkula sukkularihmoineen kiinnittyy vain kromosomaalisessa DNA:ssa

oleviin sentromeerikohtiin. Solussa irrallaan olevat muut DNA-jaksot jätetään

tumasukkulavaiheessa oman onnensa nojaan. Tutkijapiireissä on tämän

murhenäytelmän estämiseksi kehitetty jopa keinotekoisia pienoiskromosomeja

sentromeereineen. Toiveena on, että keinokromosomin saanut solu kohtelisi sitä

tavanomaisten kromosomiensa tapaan.

Bakteereihin siirrettävä geeni liitetään ennen siirtoa usein johonkin toiseen ns.

merkkigeeniin, kuten antibioottiresistenssitekijöihin (=

lääkeainevastustuskykytekijöihin). Lopullisen istutuksen jälkeen merkkigeenin

avulla voidaan tunnistaa onnistuneet istutukset altistamalla kasvatusmaljan

bakteerit kyseiselle antibiootille. Vain ne bakteerit, joissa on resistenssitekijä (siis

myös siirretty geeni) säilyvät hengissä lääkekäsittelystä.

Siirtogeeneihin on liitettävä sellainen geenin säätelyosa, joka toimii siirron

kohteena olevassa solutyypissä. Bakteereihin siirrettäessä käytetään bakteereille

ominaisia säätelyosia, aitotumallisiin soluihin tarvitaan näille ominaiset

säätelyosat. Säätelyosat voidaan valita sellaisiksi, että ne esimerkiksi tietyn

lääkeaineen vaikutuksesta käynnistävät tai sulkevat siirtogeenin. Tietyillä

säätelyosilla siirtogeenit saadaan käynnistymään tai sulkeutumaan lämpötilaa

vaihtamalla. jne. Luovuudelle on tilaa! On myös hyvä muistaa, että geenit, joissa

on intronijaksoja mukana (tsekkaa käsite introni tiedostosta ”karmea totuus

proteiinisynteesistä”), eivät toimi bakteerisoluissa.

9.4. Genomisen geenikirjaston perustaminen (Kuva 58)

Bakteeri

1. Genominen (= kaikki solun sisältämä) DNA eristetään.

2. DNA:ta monistetaan PCR-menetelmällä.

3. DNA pilkotaan jollakin restriktioentsyymillä.

4. Liitetään DNA-pilkkeet plasmideihin, jotka on avattu samalla restriktioentsyymillä. Tällöin plasmidien ”sticky endit” sopivat DNA-pilkkeiden päihin.

5. Plasmidit istutetaan bakteereihin. Bakteerit ottavat plasmideja sisäänsä ihan itsestään.

6. Bakteereita viljellään maljoilla niin laihana seoksena, että kukin bakteeripesäke syntyy yhden bakteerin jälkeläisistä. Tällöin kukin pesäke on samaa bakteerikloonia.

Bakteerin oma DNA

Bakteeripesäke

Siirretty DNA

7. Kun kasvatusmaljoja on paljon, on todennäköistä, että jokainen DNA-jakso on päässyt ainakin yhden bakteerin sisään. Jos jokin tietty DNA-jakso alkaa myöhemmin tuntua kiinnostavalta, kyseistä DNA-jaksoa sisältävät pesäkkeet voidaan myöhemmin tunnistaa maljoilta geenikoettimien avulla.

Kasvatusmalja

Kuva 58. Genomisen geenikirjaston perustaminen

Geenikoettimille komplementaarista DNA:ta sisältävien bakteeripesäkkeiden

etsiminen geenikirjastoista

(Tämä osio tulee uudelleen tekstin loppupuolella haulikkosekvenssoinnin

yhteydessä, joten älä ihmettele.)

Jos bakteeriviljelmään on kerralla istutettu suuri määrä erilaisia DNA-jaksoja,

voidaan viljelmästä tunnistaa vaikkapa jonkin tietyn geenin saaneet bakteerit

geenikoettimien avulla. Ehtona on, että tiedetään jokin lyhyt, kyseiselle geenille

luonteenomainen emäsjärjestys. Tällöin voidaan PCR:llä valmistaa tälle

emäsjärjestykselle komplementaarisia geenikoettimia. Geenikoettimet

valmistetaan yleensä radioaktiivisista nukleotideista, jolloin ne on helppoa

myöhemmin havaita radioaktiivisuudelle herkällä filmillä.

Mainitun geenin sisältävien pesäkkeiden etsimistä varten kasvustosta otetaan

kopio esimerkiksi nailonkelmulle yksinkertaisesti painamalla se kasvatusalustaa

vasten. Kustakin pesäkkeestä jää tällöin kelmulle pieni bakteereita sisältävä

tahra.

Kelmulle kiinnittyneistä bakteereista liuotetaan pois kaikki muut solujen rakenteet

paitsi DNA-molekyylit. DNA-molekyylit avataan yksijuosteisiksi emäskäsittelyllä ja

kestävöidään kiinni muovikelmuun.

Seuraavaksi kelmua huljutetaan valmistamiamme geenikoettimia sisältävässä

liemessä. Tällöin kelmulla tapahtuu in situ –hybridisaatio sellaisten DNA-

molekyylien kohdalla, joissa esiintyy geenikoettimellemme komplementaarisia

emäsjärjestyksiä.

Nailonkelmua ja kasvatusmaljalla olevia bakteeripesäkkeitä toisiinsa vertailemalla

komplementaarisia emäsjärjestyksiä sisältävät pesäkkeet voidaan jäljittää. Niissä

olevat bakteerit otetaan nyt lähempään jatkokäsittelyyn.

9. 5. Northern blotting eli solukkonäytteen sisältämien kaikkien lähetti-RNA-molekyylien eristäminen

- aluksi tutkittava solukkonäyte murskataan puuroksi ja siitä liuotetaan pois muut orgaaniset molekyylityypit (siis hiilihydraatit, rasva-aineet ja proteiinit) paitsi nukleiinihapot (=DNA ja RNA)

- mRNA-molekyyleissä on Poly-A-häntä (asia tulee esille tiedostossa ”Karmea totuus proteiinisynteesistä”) → käytetään eristämiseen suodatinta, jossa on paljon Poly-T-häntiä

- uutetaan mRNA-molekyylit irti suodattimesta ja pannaan näyte elektroforeesihyytelölle sähkökenttään → hyytelölle ilmestyy raidoitus molekyylien kokoluokkien mukaan (pienet molekyylit siirtyvät kauas lähtöpaikastaan, suuret jäävät sen lähelle)

- otetaan raidoista kopsut imupaperille - myöhemmin raidoista voidaan valkata kulloinkin kiinnostavilta tuntuvien

geenikoettimien (esim. homeobox) avulla jatkotarkasteluun mielenkiintoisimmat

- käänteiskopioijaentsyymin avulla voidaan loihtia ao. geenit esim. istutettaviksi pöpöihin (näin tuotettua DNA:ta kutsutaan cDNA:ksi)

- jos käänteiskopiointiin otetaan kaikki raidat, saadaan syntymään geenikirjasto - näin tuotetussa geenikirjastoissa on mukana vain geenien rakenneosia

koodaavat DNA-jaksot (lähetti-RNA-molekyyleissähän ei ole introneita eikä geenien säätelyosia)

- cDNA-kirjastot ovat siis hieman erilaisia kuin bakteerikantoihin kloonatut ns. genomiset kirjastot (kirjassa s. 42), jotka puolestaan sisältävät kaiken tutkittavalle eliölajille ominaisen DNA:n (intronit, eksonit, säätelyjaksot ja geenien ulkopuolelle jäävän nonsense-DNA:n)

9.6. In Situ –hybridisaatio (Kuva 59) eli geenikoettimien toimintaperiaate

Kiinnostuksen kohteena oleva DNA-jakso, vaikkapa homeo-sekvenssi

PCR:ään, jossa radiohiiltä sisältäviä nukleotideja

PCR pysäytetään kuumaan (siis yksijuosteiseen) vaiheeseen ja DNA-molekyylien pysyminen yksijuosteisina varmistetaan esim. emäskäsittelyllä

Kudosleike (esim alkion pitkittäisleikkaus) upotetaan näin tuotettuja geenikoettimia sisältävään liuokseen (kuva oikealla).

Huljutetaan pesuliuoksessa irto-DNA: t pois.

Radio-DNA-juosteet (= geenikoettimet) kiinnittyvät niihin kohtiin leikettä, joissa on niiden emäsjärjestykselle vastakkaisia mRNA-juosteita

Radioherkällä filmillä geenikoettimien sijaintipaikat näkyvät täplinä tai raitoina alkiossa. Näissä kohdissa kyseinen geeni toimii!

ATGGCCAAT

TACCGGTTA

ATGGCCAAT

ATGGCCAAT

ATGGCCAAT

ATGGCCAAT

UACCGGUUA

Tutkittava leike (esim. ohutleike alkiosta) RNA-molekyyleineen

Yksijuos-teista radio-DNA:ta

Kuva 59. In Situ –hybridisaatio eli geenikoettimien toimintaperiaateKuvasarjan ymmärtääksesi tee ensin itsellesi selväksi PCR-menetelmä.

9.7. DNA-sormenjälki

Tämän menetelmän ymmärtäminen edellyttää, että olet ensin perehtynyt PCR-menetelmään ja elektroforeesin perusideaan.

Epäillyltä kudosnäyte Rikospaikalta kudosnäyte (verta, hius, hilsettä tms.)

Eristetään esim. yksi kromosomi

Eristetään se sama kromosomi

PCR:ään PCR:ään

DNA paloitellaan restriktioentsyymillä

DNA paloitellaan samalla restriktioentsyymillä

Näyte elektroforeesihyytelölle

Näyte elektroforeesihyytelölle

Jos raidat kummassakin hyytelössä ilmestyvät samoille kohdille, epäilty on syyllinen.

9. 8. DNA:n sekvenssointi eli emäsjärjestyksen lukeminen

Kenties tärkein solubiologisen tutkimuksen saavutuksista on kyky lukea DNA:ssa

olevia emäsjärjestyksiä. Emäsjärjestyksien perusteella voidaan päätellä DNA:n

koodaamien proteiinien aminohappojärjestys (kolme rinnakkaista emästähän

koodaa aina yhtä aminohappoa). Näin voidaan paremmin ymmärtää esimerkiksi

tiettyjen geenivirheiden aiheuttamia molekyyli- ja solutason vaikutuksia. DNA:n

emäsjärjestyksen selvittäminen antaa myös mahdollisuuden vertailla eri eliölajien

geenirakenteita. Vaikkapa Homeobox-geenien toimintatapa ja niiden

universaalius eläinkunnassa ymmärrettiin vain tällaisen puuhastelun tuloksena.

Kuvaan tässä niin sanotun Sanger-menetelmän (Nobel-palkinto vuonna 1980),

jota kutsutaan myös dideoksynukleotidimenetelmäksi. Menetelmän kehitti tutkija

nimeltään Frederick Sanger. Samainen kaveri oli jo vuonna 1958 saanut

ensimmäisen Nobel-palkintonsa selvitettyään insuliini-hormonin

aminohappojärjestyksen (1955).

Sanger-menetelmä

Sanger-menetelmä alkaa leikkaamalla haluttu DNA-jakso irti jostakin laajemmasta

DNA-näytteestä, esimerkiksi kromosomista. Leikkaamisessa käytetään

restriktioentsyymejä. Koska nämä entsyymit leikkaavat DNA:ta vain tiettyjen

emäsjärjestysten kohdalta, voidaan restriktioentsyymien avulla määrätä, millainen

emäsjärjestys tulee irrotettavan DNA-jakson kumpaankin päähän (kuva 60).

Tutkittavassa DNA-molekyylissä olevien sticky end -päiden emäsjärjestykset

tunnetaan leikkaamisessa käytetyn restriktioensyymin perusteella. Sen sijaan

DNA-jakson muu emäsjärjestys (alla olevissa esimerkeissä sinisellä) on tässä

vaiheessa tuntematon. Tämä on siis se osa DNA-molekyyliä, joka halutaan

sekvenssoida.

Esimerkiksi, jos toinen yksöisjuosteista on 3´ATGAGGATGGTAA 5´, on tälle

kompelementaarinen yksöisjuoste emäsjärjestykseltään 5´CCTACCATTAGTA 3´.

Kaksoisjuosteena ne näyttäisivät seuraavalta:

ssDNA:n tuottaminen

Emäsjärjestyksen selvittäminen aloitetaan ns. epäsymmetrisellä PCR:llä. Siinä

kopioitavan DNA-kaksoisjuosteen päät muokataankin emäsjärjestykseltään

erilaisiksi. Tällöin praimerit voidaan valita sellaisiksi, että ne kiinnittyvät DNA-

juosteessa vain jompaankumpaan 3´-päähän (kuva 61).

G AATTC C TTAA G

G GATC CC CTAG G

A AGCT T T TCGA A

G TCGA C C AGCT G

GC GC CG CG

Tämä katkaisupaikka jää tylpäksi, siis ilman sticky end –päätettä.

Kuva 60. Esimerkkejä restriktioentsyymeille ominaisista katkaisupaikoista.

3´ATGAGGATGGTAA 5´ 5´CCTACCATTAGTA 3´.

Edellä kuvatun toimenpiteen vuoksi PCR:n tuottamat kopiot edustavatkin nyt vain

toista DNA:ssa alkujaan olevista yksöisjuostetyypeistä. Epäsymmetrisen PCR:n

tuloksena syntyvää DNA-näytettä kutsutaan tästä lähtien ssDNA:ksi (ss tulee

sanoista ”single stranded” eli yksijuosteinen).

ssDNA:ta ei siis ole mikä tahansa yksijuosteisia DNA-molekyylejä sisältävä näyte,

vaan sellainen, joka nimenomaan sisältää vain jompaa kumpaa

komplementaarista juostetyyppiä. Selostamani vaihe on erittäin tärkeä syystä,

jonka perustelen lopussa menetelmän yleiskuvauksen jälkeen.

Eristetyt ssDNA-kopiot jaetaan nyt neljään eri koeputkeen. Jokaisessa

koeputkessa PCR:ää jatketaan tämän jälkeen yksi kierros, kuitenkin sillä erolla,

5´CCTACCATTAGTA 3´3´ATGAGGATGGTAA 5´

5´CCTACCATTAGTAGCCGC 3´3´ATGAGGATGGTAATCATCGGCG 5´

Alkuperäinen restriktioentsyymillä irroitettu kaksoisjuoste, jonka molemmissa 3´-päissä on sama peilikuvamainen emäsjärjestys.

Kaksoisjuosteen toisen pään aloittava emäsjärjestys on muutettu toisenlaiseksi (harmaat emäkset). Nyt praimerit voivat kiinnittyä vain koskemattomaksi jätettyyn 3´-päähän.

Kuva 61. DNA:n muokkaaminen epäsymmetristä PCR:ää varten.

että nyt tavallisten DNA-nukleotidien lisäksi kuhunkin putkeen sujautetaan jonkin

verran myös ns. dideoksynukleotideja. Tällaisia nukleotideja DNA-polymeraasi voi

kyllä liittää aikaisempien nukleotidien jatkoksi, mutta se ei pysty liittämään uusia

nukleotideja enää dideoksynukleotidien perään. Kopiointi siis pysähtyy aina, kun

polymeraasi pahaa aavistamatta liittää ketjun jatkoksi dideoksynukleotidin

(ddDNA-nukleotidin).

Tavallisten ja dideoksynukleotidien eroa havainnollistaa mojovasti seuraava

vertaus: jos tavalliset nukleotidit ovat normaaleita Lego-palikoita, niin

dideoksynukleotidien yläpinnalta puuttuisivat Legoille ominaiset nystermät.

Jos ensimmäiseen koeputkeen laitetaan vain sellaisia ddDNA-nukleotideja, joiden

emäs on A eli adeniini (kuva 62), keskeytyy kopiointi tässä putkessa aina kohtaan,

missä viimeisenä emäksenä on adeniini. Putkeen syntyy suuri määrä

geenikopioita, jotka ovat täydellisen pitkiä vain silloin, kun polymeraasin tielle ei

ole osunut yhtään ddDNA-nukleotidia.

Loppuun asti kopioituneiden molekyylien seassa on nyt suuri joukko eri kohdilta

kesken jääneitä tynkiä. Näitä on monen kokoisia, mutta jokaisessa molekyylissä

viimeisenä emäksenä on adeniini. Sanger-menetelmän lopputilanne

havainnollistuu kuvissa 63 ja 64.

TTCTGGATGTTAGAGTA

A

G

G

A

A

C

T

T

A

A

A

A

C

DNA-polymeraasia

DNA:n ddA-nukleotideja (tämän polymeraasi voi liittää nukleotidiketjun jatkoksi, mutta tähän kopiointi pysähtyy)

Tavallisia DNA-nukleotideja

PCR:n tuloksena saatuja ssDNA-juosteita (3´-pään emäsjärjestys mustalla).

Kuva 62. ddA-nukleotideja sisältävä koeputki Sanger-menetelmän lähtötilanteessa.PCR-putkeen lisätään kuvassa näkyvät lähtöaineet emäsjärjestyksen selvittämistä varten. Siniset aakkoset kuvaavat tutkittavassa DNA-näytteessä olevaa emäsjärjestystä, jota tässä vaiheessa ei vielä tunneta.

Dideoksy-A-nukleotidit on kuvaan merkitty punaisella.

Kutakin neljää dideoksynukleotidityyppiä varten tarvitaan oma koeputkensa.

TCAT

TCAT

Praimereita

Sama toistetaan muissakin koeputkissa. Jokaiseen koeputkeen lisätään

tavanomaisten PCR-ainesten lisäksi myös jonkin verran dideoksy-nukleotideja.

Neljästä putkestamme yhdessä on dideoksy-nukleotidien emäksenä tymiini.

Yhdessä putkessa on dideoksy-nukleotideja, joissa emäksenä on guaniini. Ja

neljännessä putkessa dideoksy-nukleotidien emäksenä on sytosiini. PCR:n

Kuva 63. ssDNA:ta sisältävät koeputket dideoksy-nukleotidimenetelmällä toteutetun PCR-kierroksen jälkeen. Kussakin putkessa on valtava populaatio eri kohdista kesken jääneitä (siis vain lyhyeltä matkalta kaksijuosteisia) kopioita alkuperäisestä DNA-juosteesta. Mustat viivat ovat mallijuosteita, värilliset viivat ovat uusia kopioita. Kaikki uudet kopiot päättyvät dideoksy-nukleotidiin.

Seuraavassa vaiheessa jokaisesta koeputkesta tehdään ajo elektroforeesilevyllä (kuva 65 ).

ddA-putki ddT-putki ddC-putki ddG-putki

Kuva 64. Näyte dideoksy-A-tyyppisiä nukleotideja sisältävän koeputken sisällöstä PCR-kierroksen jälkeen. Dideoksy-A-nukleotidit on kuvaan varjostettu punaisella ja praimerit turkoosilla. Tosiasiassa koeputkessa on valtaisa populaatio kaikkia kuvassa näkyviä A-emäksen kohdalle pysähtyneitä DNA-kopioita. Tämä ilmenee parhaiten kuvasta 63.

TTCTGGATGTTAGAGTA

AA

A

A

TCAT

TC

TTCTGGATGTTAGAGTA

TTCTGGATGTTAGAGTA

TTCTGGATGTTAGAGTA

TCAT

TCAT

TCAT

ATC

CAATC

CCTACAATC

JNE…

jälkeen jokaisessa putkessa on valtaisia määrä eri kokoisia DNA-kopioiden tynkiä

hyvin lyhyistä jaksoista aina kokonaisiin kopioihin asti. Mutta jokaisessa putkessa

tyngät päättyvät aina emäkseen, jonka tyyppisiä dideoksynukleotideja putkeen oli

lisätty (kuvat 63 ja 64).

DNA:n emäsjärjestys saadaan nyt selville elektroforeesin avulla. Siinä läskiä

muistuttavan elektroforeesihyytelölevyn (valmistettu etupäässä keittiöstä tutuista

aineksista) toiseen päähän tehtyyn viiltoon tipautetaan näytteet edellä mainituista

koeputkista. Jokaiselle putkelle tehdään oma elektroforeesiajo. (kuva 65).

Kun levyn läpi tämän jälkeen johdetaan sähkövirta, DNA-kopiot alkavat liikkua

virran mukana. Mitä lyhyemmästä molekyylistä on kysymys sitä nopeammin (=

pitemmälle) se ”läskin” sisällä liikkuu.

Jos esimerkiksi praimerit on valmistettu radiohiiltä sisältävistä nukleotideista,

jokaisesta molekyylien kokoluokasta muodostuu oma radioaktiivinen raitansa

”läskin” sisälle (raidat näkyvät radioaktiivisuudelle herkällä filmillä). Kun neljän

näytteemme jättämiä raitoja tutkitaan rinnakkain, voidaan DNA-juosteen

emäsjärjestys lukea suoraan levyiltä (kuva 65). Emästen pariutumissäännön

perusteella selviää saman tien tietenkin myös komplementaarisen juosteen

emäsjärjestys.

Vertaus pituusjuoksukilpailuun

Elektroforeesivaihetta voitaisiin verrata joukkuemuotoisesti tapahtuvaan

pituusjuoksukilpailuun. Kilpailussa on neljä rinnakkaista rataa (= neljä eri ”läskiä”).

Radat voidaan nimetä emästen mukaan ddA-, ddT-, ddG- ja ddC-radaksi (kuva

65) .

+-

+-

-

+

+

+

-

-

ddA-levy

ddT-levy

ddC-levy

ddG-levy

Kuva 65. Elektroforeesin käyttö DNA:n sekvenssoinnissa Sanger-menetelmällä. Jokaisen dideoksynukleotideja sisältäneen koeputken (= värit) sisältö ajetaan erikseen omalla elektroforeesilevyllään. Sekvenssoitavan DNA-näytteen emäsjärjestys on luettavissa raidoista helposti, kun levyt asetetaan rinnakkain. Kuvassa emäsjärjestys vasemmalta oikealle olisi CGTATGCATCGATCGATCG (saat järjestyksen selville kuljettamalla pystyssä olevaa viivotinta kuva-alueen poikki nuolien kulkusuunnassa).

Kunkin radan alkuun asettuu joukko eri tavoin raskas- / kevytrakenteisia juoksijoita

(= eri kokoisia DNA:n kopioita asianomaisia dideoksy-nukleotideja sisältäneestä

koeputkesta). Kun lähtölaukaus kajahtaa (sähkövirta kytketään), jokaisen

joukkueen jokainen jäsen (=tutkittavat molekyylit) singahtaa matkaan

samanaikaisesti, mutta pysytellen tiukasti omalla radallaan. Mitä pitempään

kilpailun annetaan jatkua sitä suuremmaksi kevytrakenteisten juoksijoiden

etumatka kasvaa raskasrakenteisiin juoksijoihin nähden. Kilpailuajan päättyessä

(= kun sähkövirta katkaistaan) kukin juoksija pysähtyy radalleen. Rata-alueella (=

neljä rinnakkaista läskiä) nyt olevien juoksijoiden järjestys kertoo suoraan DNA-

molekyylissä olevan emäsjärjestyksen.

Miksi Sanger-menetelmässä tarvitaan nimen omaan ssDNA:ta?

Kuvitteellisessa DNA-näytteessämme toisilleen komplementaaristen juosteiden

emäsjärjestykset ovat esimerkiksi seuraavat: 3´ATGAGGATGGTAA5´ ja 5

´CCTACCATTAGTA 3´.

Jos emäsjärjestystä olisi yritetty selvittää molempia juosteita sisältävästä

näytteestä, olisi jokaisen dideoksy-G-juovan kohdalle ”läskiin” muodostunut juova

myös dideoksy-C-näytteestä. Samoin jokaisen dideoksy-A-juovan kohdalle olisi

muodostunut juova myös dideoksy-T-näytteestä. Näin siksi, että

komplementaariset emäkset A / T ja C / G sijaitsevat yhtä kaukana molekyylien

päistä.

Olisimme siis saaneet selville kylläkin peräkkäiset emäsparit, mutta emme sitä,

mitkä asianomaisista emäksistä olisivat kuuluneet samaan juosteeseen. Tässä on

siis syy siihen, että Sanger-menetelmän dideoksyvaiheessa käytetään vain ja

nimen omaan ssDNA:ta.

Lukulaitteita

Emäsjärjestyksen selvittämisessä käytetään nykyisin myös automaattisia

lukulaitteita. Niidenkin toimintaperiaate on edellä kuvatun kaltainen (ei

todennäköisesti kuitenkaan kauan, sillä DNA:n suoraankin lukemiseen kykeneviä

välineitä ollaan jo kovalla tohinalla kehittelemässä).

9.9. Geenisirut, oppikirjassa s. 44

(= DNA-mikrosirutekniikka, DNA-siru tai DNA-lastu, englanniksi esim.

microarray tai DNA-array)

Jotta ymmärrät tähän kirjoittamani näkökulmat, sinun täytyy ensin selvittää

itsellesi seuraavat aikaisemmin opiskellut asiat:

- PCR-menetelmä

- Northern blotting eli solukkonäytteen sisältämien kaikkien lähetti-RNA-

molekyylien eristäminen poly-A-hännän avulla

- käänteistranskriptaasin toimintaperiaate ja käyttö geenitekniikassa

- in situ-hybridisaatio ja geenikoettimien toimintaperiaate

Geenisirut koostuvat mikroskooppilasille kestävöidyistä tuhansista

geenikoettimista, joihin hybridisoidaan tutkimusnäytteen RNA:sta valmistettua

komplementaarista DNA:ta (cDNA).

Geenisiruja valmistetaan siten, että cDNA-kirjastoista poimitaan esimerkiksi

tiettyjen syöpägeenien kloonit. Klooneista valmistetaan geenikoettimet ja ne

kestävöidään pipetointirobotilla (»mikrosirukirjoitin») mikroskoopin aluslasille.

Kutakin geenikoetinta sijoitetaan aluslasille tietylle kohdalle, selvärajaiseksi

täpläksi (kuva oppikirjassa sivulla 44). Yhdelle aluslasille kirjoitetaan tavallisesti 10

000–20 000 erilaista DNA-jaksoa. Tulevaisuudessa siirryttäneen koko genomin (=

yksittäisen lajin kaikki geenit) kattaviin noin 50 000 kloonin laseihin.

Potilaalta, esimerkiksi syöpäkasvaimesta otetusta näytteestä, eristetään lähetti-

RNA-molekyylit, jotka käännetään käänteistranskriptaasin avulla cDNA:ksi. Nämä

cDNA-molekyylit leimataan fluoresoivalla eli valoa hohtavalla väriaineella.

Kasvaimesta peräisin olevat molekyylit voidaan leimata vaikkapa keltaisiksi.

Potilaan leimattua cDNA-näytettä hybridisoidaan (= in situ –hybridisaatio)

geenisirulla olevien koettimien kanssa huljuttamalla sirua näytemolekyylejä

sisältävässä liuoksessa. Jos näytemolekyyleissä esiintyy geenikoettimiin nähden

komplementaarisia emäsjärjestyksiä, nämä kiinnittyvät asianomaista koetinta

sisältävän täplän kohdalle.

Keltaisten valotäplien sijainti sirulla kertoo, mitkä syöpägeeniversiot näytteen

sisältämissä soluissa ovat toiminnassa. Siis sen, mitkä nimenomaiset geenivirheet

kyseisen kasvaimen ovat aiheuttaneet. Tarkka tieto kasvaimen genetiikasta auttaa

löytämään parhaan mahdollisen lääkityksen.

Standardoiduille siruille on olemassa valmiita tietokonepohjaisia lukuohjelmia,

jotka antavat tulosyhteenvetoja valmiina taulukkoina. Tulkinta on siis suurelta osin

automatisoitua.

Geenisirutekniikalla kyetään keräämään aivan uudella tavalla tietoa geenien

normaalista ja patologisesta toiminnasta pian jopa koko genomin mittakaavassa.

Geenisirutekniikan sovellusmahdollisuudet koskettavat lähes kaikkea biologista ja

lääketieteellistä tutkimusta, lääkekehitystyötä ja diagnostiikkaa.

9.10. Haulikkosekvenssointi eli Chromosome walking (Geeni s. 68)

Tässä selostetun menetelmän ymmärtämiseksi sinun tulee etukäteen osata

seuraavat asiat:

- PCR-menetelmä

- restriktioentsyymien toimintaperiaate

- in situ-hybridisaatio ja geenikoettimien toimintaperiaate

- Sanger-menetelmä

- elektroforeesi

- mielellään myös genomisten geenikirjastojen tekeminen (kirjassa s.42),

mutta näiden tekeminen valkenee ehkä myös alla olevasta

- käsite plasmidi

- käsite ssDNA

Johdanto

Haulikkosekvensoinnin perusidea on, että pitkien DNA-jaksojen, esimerkiksi

kokonaisten kromosomien emäsjärjestyksen selvittämisessä joudutaan

tyytymään lyhyiden askelten taktiikkaan. Sanger-menetelmä (tässä tiedostossa

kohta 9.8.) tai sitä hyödyntävät automaattiset lukulaitteet eivät nimittäin sovellu

kovinkaan pitkien DNA-jaksojen sekvenssoimiseen.

Pitkät DNA-jaksot pilkotaan niin lyhyiksi, että Sanger-menetelmää voidaan

käyttää. Syntyvien DNA-pilkkeiden järjestys menee pilkkomisen seurauksena

sekaisin. Jos kuitenkin pilkkominen tehdään useammalla eri restriktioentsyymillä,

kullakin erikseen, pilkkeiden järjestys voidaan myöhemmin päätellä vertailemalla

toisiinsa eri restriktioentsyymeillä pilkottujen DNA-jaksojen emäsjärjestysten

päällekkäisyyksiä (Kuva 66).

Sen, miten kaikki käytännössä tapahtuu, yritän selittää seuraavassa. Ennen

varsinaiseen haulikkomenetelmään paneutumista on kuitenkin syytä tehdä

selväksi bakteerikasvatuksena toteutettavien geenikirjastojen olemus. Näitä

nimittäin tarvitaan mainitussa puuhastelussa. Myös kirjassa sivulla 42 on esitetty

tällaisten geenikirjastojen tuotantotapa, joten tsekkaa se kyseisellä sivulla

olevasta kuvasta.

Bakteeriviljelmät geenikirjastoina

Bakteereita kasvatetaan pyöreillä, suunnilleen kämmenen kokoisilla

kasvatuslaustoilla: petrimaljoilla. Bakteerikasvustot näkyvät maljalla pieninä

Alkuperäinen, pilkkoutumaton DNA-molekyyli, jonka emäsjärjestys halutaan selvittää. Molekyyli on liian pitkä kerralla sekvenssoitavaksi.

Restriktioentsyymi 1:llä pilkottu DNA

Restriktioentsyymi 2:lla pilkottu DNA

Restriktioentsyymi 3:lla pilkottu DNA

Kuva 66. Haulikkosekvenssoinnin perusperiaate. Alkuperäinen DNA-näyte on liian pitkä kerralla sekvenssoitavaksi. Siksi sitä aluksi monistetaan PCR-menetelmällä. Monistettua DNA:ta jaetaan useaan eri koeputkeen (= värit). Kun kuhunkin putkista laitetaan erilaiselle emäsjärjestykselle herkkää restriktioentsyymiä, DNA pilkkoutuu kussakin koeputkessa eri kohdista. Tuloksena on sekvenssointiin sopivia, lyhyitä DNA-jaksoja, joissa kuitenkin on niin paljon päällekkäisiä emäsjärjestyksiä, että alkuperäisen DNA-näytteen koko emäsjärjestys voidaan lopulta päätellä.

täplinä, ns. bakteeripesäkkeinä eli plakkeina. Bakteerit istutetaan maljalle niin

laimeana liuoksena, että kukin bakteeripesäke syntyy yksittäisestä bakteerista.

Kaikki yhdessä pesäkkeessä olevat bakteerit ovat siis geneettisesti täsmälleen

samanlaisia eli identtisiä. (Kuva 67)

Bakteeri

1. Genominen (= kaikki solun sisältämä) DNA eristetään.

2. DNA:ta monistetaan PCR-menetelmällä.

3. DNA pilkotaan jollakin restriktioentsyymillä.

4. Liitetään DNA-pilkkeet plasmideihin, jotka on avattu samalla restriktioentsyymillä. Tällöin plasmidien ”sticky endit” sopivat DNA-pilkkeiden päihin.

5. Plasmidit istutetaan bakteereihin. Bakteerit ottavat plasmideja sisäänsä ihan itsestään.

6. Bakteereita viljellään maljoilla niin laihana seoksena, että kukin bakteeripesäke syntyy yhden bakteerin jälkeläisistä. Tällöin kukin pesäke on samaa bakteerikloonia.

Bakteerin oma DNA

Bakteeripesäke

Siirretty DNA

7. Kun kasvatusmaljoja on paljon, on todennäköistä, että jokainen DNA-jakso on päässyt ainakin yhden bakteerin sisään. Jos jokin tietty DNA-jakso alkaa myöhemmin tuntua kiinnostavalta, kyseistä DNA-jaksoa sisältävät pesäkkeet voidaan myöhemmin tunnistaa maljoilta geenikoettimien avulla.

Kasvatusmalja

Kuva 67. Genomisen geenikirjaston perustaminen

Bakteeriviljelmä voidaan tehdä bakteereista, joihin on siirretty jokin vieras eli

siirtogeeninen DNA-jakso. Jos yksittäisestä pesäkkeestä otetaan bakteerinäyte ja

eristetään bakteerien sisältämät DNA-molekyylit, voidaan siirtogeeninen jakso

tarvittaessa leikata uudelleen irti bakteerin omasta genomista jatkotutkimuksia

varten. Tämä käy näppärästi, sillä siirtogeenien istuttamisessa käytetyn plasmidin

sticky end -päät ovat siirtäjän tiedossa. Jos plasmidit avataan samalla

restriktioentsyymillä, jolla ne ennen siirtogeenin istuttamista avattiin, irtautuvat

siirtogeenijaksot ulos plasmideista sellaisinaan. Ne voidaan sitten monistaa

PCR:n avulla ja erottaa muista DNA-molekyyleistä elektroforeesilla.

Geenikoettimille komplementaarista DNA:ta sisältävien bakteeripesäkkeiden

etsiminen geenikirjastoista

Jos bakteeriviljelmään on kerralla istutettu suuri määrä erilaisia DNA-jaksoja,

voidaan viljelmästä tunnistaa vaikkapa jonkin tietyn geenin saaneet bakteerit

geenikoettimien avulla. Ehtona on, että tiedetään jokin lyhyt, kyseiselle geenille

luonteenomainen emäsjärjestys. Tällöin voidaan PCR:llä valmistaa tälle

emäsjärjestykselle komplementaarisia geenikoettimia. Geenikoettimet

valmistetaan yleensä radioaktiivisista nukleotideista, jolloin ne on helppoa

myöhemmin havaita radioaktiivisuudelle herkällä filmillä.

Mainitun geenin sisältävien pesäkkeiden etsimistä varten kasvustosta otetaan

kopio esimerkiksi nailonkelmulle yksinkertaisesti painamalla se kasvatusalustaa

vasten. Kustakin pesäkkeestä jää tällöin kelmulle pieni bakteereita sisältävä

tahra.

Kelmulle kiinnittyneistä bakteereista liuotetaan pois kaikki muut solujen rakenteet

paitsi DNA-molekyylit. DNA-molekyylit avataan yksijuosteisiksi emäskäsittelyllä ja

kestävöidään kiinni muovikelmuun.

Seuraavaksi kelmua huljutetaan valmistamiamme geenikoettimia sisältävässä

liemessä. Tällöin kelmulla tapahtuu in situ –hybridisaatio sellaisten DNA-

molekyylien kohdalla, joissa esiintyy geenikoettimellemme komplementaarisia

emäsjärjestyksiä.

Nailonkelmua ja kasvatusmaljalla olevia bakteeripesäkkeitä toisiinsa vertailemalla

komplementaarisia emäsjärjestyksiä sisältävät pesäkkeet voidaan jäljittää. Niissä

olevat bakteerit otetaan nyt lähempään jatkokäsittelyyn.

Siinäpä lämmittelyä kerrakseen ja nyt varsinaisesti haulikkomenetelmän

kimppuun!

Sekvenssoitavana voi siis olla tavattoman pitkä DNA-jakso kuten kokonainen

kromosomi. Alkuperäinen tuntematon ssDNA:n emäsjärjestys voisi mukamas

olla vaikkapa seuraavanlainen (kuvitellaan, että tämä oikeasti olisi aivan

tajuttoman pitkä):

ATCGGCATTAAGCACCTTAGAAATGCAACCCCGTACGGATAATGATCGTAGC

TA (Koska emäsjärjestys on pitkä, se saattaa ulottua tässä kahdelle riville. Siksi

se saattaa näyttää kaksijuosteiselta, mutta ei kuitenkaan sitä ole.)

DNA-jaksoa monistetaan PCR:llä ja saatuja kopioita lorautetaan esim. neljään eri

koeputkeen.

Kussakin koeputkessa olevat DNA-jaksot pilkotaan nyt erilaisella

restriktioentsyymillä. Jokainen restriktioentsyymi katkoo DNA:ta erilaisen

emäsjärjestyksen kohdalta, joten jokaiseen koeputkeen syntyy erilainen DNA-

silppujen kokoelma. Näiden silppukokoelmien olemusta ja eroja selostan

myöhemmin yksityiskohtaisemmin.

Jotta tehty työ ei menisi hukkaan, silppukokoelmat istutetaan plasmidivektorien

avulla bakteereihin kuvan 67 esittämällä tavalla (tsekkaa myös kirjan sivulla 42

oleva kuva geenikirjaston tekemisestä).

Kustakin silppukokoelmasta (= värit kuvassa 66) tehdään siis erillinen oma

geenikirjastonsa. Vektorina käytettävän plasmidin avaamisessa tulee käyttää

samaa restriktioentsyymiä kuin millä silppu kyseisessä koeputkessa tuotettiin.

Näin sekä istutettavissa DNA-jaksoissa että plasmideissa on valmiiksi toisiinsa

sopivat sticky end –päät.

Seuraavien väliotsikoiden alla (= koeputket nro 1 – 4) näkyviin restriktiosilppuihin

en ole merkinnyt kullekin restriktioentsyymille ominaisia sticky end –

emäsjärjestyksiä.

Koeputki nro 1

Koeputkessa 1 oleva restriktiosilppu voisi koostua vaikkapa seuraavan kokoisista

DNA-jaksoista

ATCGGCATTAAGCAC CTTAGAAATGCAACC CCGTACGGATAATG

ATAGCGTAGCTA

DNA-silpusta voidaan elektroforeesin avulla eristää yhtä silppumolekyylien

kokoluokkaa edustava DNA-jakso. Tästä DNA-jaksosta selvitetään esimerkiksi

Sanger-menetelmällä siinä oleva emäsjärjestys.

Kun emäsjärjestys on saatu selville, valmistetaan sen jommassa kummassa

päässä oleviin emäksiin nähden komplementaarinen geenikoetin.

Kuvitellaanpa, että edellä sekvenssoimamme DNA-jakso olisi yllä olevassa DNA-

molekyylissä vasemmanpuoleisimpana oleva molekyyli. Siihen olen harmaalla

merkinnyt meitä erityisesti kiinnostavat viimeiset emäkset AGCAC. Näille

komplementaarinen koetin olisi siis TCGTG.

Tämän koettimen avulla (nailonkelmulla tapahtuva in situ –hybridisaatio)

etsisimme nyt sille koplementaarisen emäsjärjestyksen sisältävät pesäkkeet

silppua 2 sisältävästä geenikirjastosta.

Koeputki nro 2

Restriktiosilppu koeputkessa nro 2 voisi koostua vaikkapa seuraavanlaisista

DNA-jaksoista (huomaa, että DNA on katkeillut eri kohdista kuin koeputkessa 1).

ATCGGCAT TAAGCACCTTAGAAATG CAACCCCGTA

CGGATAATGATAGCGTAGCTA

Edellisessä kohdassa valmistamaamme koetinta vastaava komplementaarinen

emäsjärjestys esiintyy tässä silpustossa toisena näkyvissä DNA-jaksoissa

(merkitty silppuun harmaalla). Uuden in situ –hybridisaatiokierroksen avulla

saisimme selville ne bakteeripesäkkeet, joissa kyseinen DNA-jakso esiintyisi

kirjastossa nro 2.

Nyt näissäkin pesäkkeissä olevan siirto-DNA-juosteen emäsjärjestys selvitettäisiin

Sanger-menetelmällä ja siinä viimeisinä oleville emäksille valmistettaisiin

komplementaarinen koetin. Tämä olisi emäsjärjestykseltään TTTAC.

Tämänkin koettimen avulla etsisimme nyt sille koplementaarisen

emäsjärjestyksen sisältävät pesäkkeet silppua 3 sisältävästä geenikirjastosta.

Koetinta vastaava komplementaarinen emäsjärjestys on merkitty silppuun 3

(seuraavan väliotsikon alla) harmaalla.

Koeputki nro 3

Restriktiosilppu koeputkessa nro 3 voisi koostua vaikkapa seuraavanlaisista DNA-

jaksoista

ATCGGCATTAAGCACCTTA GAAATGCAACCCCGTACGG

ATAATGATAGCGTAGCTA

Harmaalla merkityn jakson sisältävän DNA-juosteen emäsjärjestys selvitettäisiin

jälleen Sanger-menetelmällä ja vuorostaan siinä viimeisinä oleville emäksille

valmistettaisiin komplementaarinen koetin. Tämä olisi emäsjärjestykseltään

ATGCC.

Tämänkin koettimen avulla etsisimme nyt sille koplementaarisen

emäsjärjestyksen sisältävät pesäkkeet silppua 4 sisältävästä geenikirjastosta.

Tätä koetinta vastaava komplementaarinen emäsjärjestys on merkitty silppuun 4

(seuraavan väliotsikon alla) harmaalla.

Koeputki nro 4

Restriktiosilppu koeputkessa nro 4 voisi koostua vaikkapa seuraavanlaisista DNA-

jaksoista

ATCGGCATTAAGCACC TTAGAAATGCAACC

CCGTACGGATAATGATAGCGTAGCTA

jne. jne. jne.

Huomaathan, että...

Pilkotusta pitkästä DNA-juosteesta restriktioentsyymeillä saatavien lyhyiden DNA-

jaksojen sekvenssoiminen esim. Sanger-menetelmällä ei ole vaikeata. Mutta

vaikeata on selvittää, missä järjestyksessä nämä lyhyet DNA-jaksot esiintyvät

alkuperäisessä pitkässä DNA-juosteessa, kuten vaikkapa kromosomissa.

Yllä esitetyssä menetelmässä järjestys selviää kätevästi silppujen

emäsjärjestyksessä esiintyvien päällekkäisyyksien avulla. Päällekkäisyydet

havaitaan tietokoneohjelmien avulla. Kun palapeli kootaan lopulta yhteen,

tuloksena syntyy esim. kokonaisen kromosomin täydellinen emäsjärjestys alusta

loppuun saakka. Esimerkiksi ihmisen genomin emäsjärjestystä selvitettäessä (ns.

Human Genome Project) meneteltiin juuri edellä kuvatulla tavalla.

Oppikirjassa haulikkomenetelmä esitellään sivulla 68. Edellä harmaaksi

värittämiäni DNA-jaksoja kutsutaan kirjassamme geenimerkeiksi.

Tässä haulikkomenetelmän vaiheet vielä lyhyenä luettelona:

1. DNA:n eristäminen

2. DNA-näytteen monistaminen PCR:llä

3. Näyte jaetaan moneen eri koeputkeen

4. Pilkotaan restriktioentsyymillä (jokaiseen putkeen erilaista

restriktioentsyymiä)

5. Yksi putki elektroforeesiin

6. Yksi raita erilleen, monistetaan PCR:llä. Monistetun raidan

emäsjärjestys selvitetään Sanger-menetelmällä ja valmistetaan

emäsjärjestystä vastaava geenikoetin.

7. Jokaisesta putkesta perustetaan genominen geenikirjasto

8. Geenikirjastoista otetaan leimat nailonkelmuille

9. Kelmut kestävöidään ja niitä huljutetaan kohdassa 7 tehtyä

geenikoetinta sisältävässä liemessä

10. Katsotaan, missä pesäkkeissä geenikoetin osoittautui

toimivaksi

11. Nyt näistä pesäkkeistä irroitetaan koettimella löytämämme

DNA-jakso. Tämä pannaan PCR:ään ja Sangeriin kohdan 6

mukaisella tavalla

12. Toistetaan vaiheet 6, 7, 8, 9, 10 ja 11 niin monta kierrosta,

että koko genomin emäsjärjestys on selvillä.

Vertailussa genomiset ja cDNA-geenikirjastot

Genomisten eli bakteerikasvatukseen perustuvien geenikirjastojen etuna on, että

niissä ovat mukana myös geenien väliset nonsense-DNA-jaksot (nämä kattavat

peräti 97 % DNA:sta), geenien rakenneosissa lymyilevät intronit sekä geenien

säätelyosat (promoottorit, enhanserit ja silenserit). Vaikkapa homeobox-geenejä

tutkittaessa kiinnostuksen kohteena saattavat olla juuri säätelyosat.

Silloin, kun geenikirjasto tuotetaan käänteiskopioijaentsyymin avulla pelkistä

lähetti-RNA-molekyyleistä, tuloksena on kopioita vain geenien rakenneosista.

Säätelyosien lisäksi näistä puuttuvat geenien rakenneosan sisälle jäävät

intronijaksot. cDNA-geenikirjastoissa ei siis esiinny introneita eikä edellä mainittuja

geenien säätelyyn osallistuvia DNA-jaksoja. Juu!

9.11. Green Fluorescent Protein eli GFP

Monia solubiologisia ilmiöitä voidaan nykyisin seurata reaaliaikaisesti uusien

molekyylitasolle yltävien värjäysmenetelmien avulla. Usein värjäysmenetelmissä

hyödynnetään sinivihreää valoa hohtavaa proteiinia, jota eräät meduusat ja

kampamaneetit tuottavat. Proteiini tuntee nimen Green Fluorescent Protein

(=GFP).

GFP:tä koodaava geeni onnistuttiin eristämään. Tutkijat myös tarkoituksellisesti

mutatoivat geeniä niin, että geenituotteina saatiin lukuisia erilaisia

värimuunnoksia. Nykyisin tuotetaan esimerkiksi punaista, keltaista, vihreätä tai

sinistä valoa hohtavia GFP-proteiineja.

GFP-geenin eri versioita voidaan yhdistää muiden geenien jatkoksi. Kun

”isäntänä” toimivan geenin promoottoriosa päräyttää RNA-polymeraasin liikkeelle,

syntyy lähetti-RNA-molekyylejä, joiden alussa on ”isäntägeenin” koodaaman

proteiinin rakenneohje, mutta sen mukana myös GFP-proteiinia koodaava RNA-

ketju (Kuva 68). Näin jokainen yhdistelmägeenin perusteella rakennettu proteiini

saa kylkeensä näkyvää valoa hohtavan ”lampun”.

Proteiinien avaruusrakenne, ja samalla proteiinin toimintatapa, häiriintyy helposti

ylimääräisten lisukkeiden vaikutuksesta. Jotta GFP-osa ei häiritsisi

”isäntäproteiinin” toimintaa, liitetään ”isäntägeenin” ja GFP-geenijakson väliin lyhyt

ylimääräinen nukleotidiketju. Tarkoitukseen valitaan sellainen emäsjärjestys, jonka

vanhastaan tiedetään koodaavan suoraa, siimamaisen muodon saavaa

aminohappoketjua. Näin GFP kulkee proteiinin lisukkeena, mutta turvallisen

etäisyyden päässä, vähän niin kuin ilmapallo narussaan.

Tämä välike ”isäntäproteiinia” ja GFP-osaa koodaavan geenijakson välillä on

suomeksi linkkeri eli yhdistäjä (Kuva 68). Virallisesti sen nimi englanniksi on

”flexible polypeptide linker region” (flexible = taipuisa, polypeptide = lyhyt

aminohappoketju, linker = yhdistäjä, region = alue).

Itsevalaisevia reseptoreita

Kuva 68. GFP-yhdistelmägeeni. ”Isäntägeenin” promoottoriosan (musta) ja rakenneosan (vihreä) jatkoksi on liitetty linkkeriosa (punainen) ja GFP-osa (sininen). RNA-polymeraasi kopioi promoottorin perässä olevan DNA-jakson yhdeksi pitkäksi mRNA-molekyyliksi.

”Isäntägeenin”promoottoriosa GFP-osa

”Isäntägeenin” rakenneosa Linkkeriosa

GFP-yhdistelmägeeni

Esimerkiksi valkosoluihin kuuluvat dendrosyytit ja T-solut telakoituvat kiinni

toisiinsa silloin, kun dendrosyytit esittelevät T-soluille vierasantigeenejä.

Telakoituminen tapahtuu solukelmulla olevien reseptoriproteiinien avulla.

Dendrosyytin pinnalla on MHC-reseptoreita ja B7-apureseptoreita. T-solun

pinnalla on CD28-apureseptoreita sekä vierasantigeenien tunnistamiseen

erikoistuneita T-solureseptoreita (kuva 69).

Esittelyn alkaessa solut asettavat solukelmunsa vastakkain, ne ikään kuin antavat

toisilleen muiskauksen. Paikkaan, missä solukelmut koskettavat toisiaan, kertyy

tuolloin runsaasti kummankin solutyypin apureseptoreita B7 ja CD28.

Apureseptoreillaan solut ”paiskaavat kättä” telakoituen kiinni toisiinsa.

Kun telakoituminen on tapahtunut, apureseptorit alkavat siirtyä ”muiskauskohdan”

reunamille. Nyt ”muiskauksen” keskiosaan alkaa vuorostaan kerääntyä MHC- ja T-

solureseptoreita. Kun ne nyt kohtaavat toisensa, on vuorossa varsinainen

antigeenien esittely. Tätäkin siis tapahtuu laajalla alueella dendrosyytin ja T-solun

solukelmulla lukuisien MHC- / T-solureseptoriparien kesken (kuva 70).

Kuva 69. Dendrosyytti ja T-solu telakoituvat toisiinsa solukelmulla olevien reseptorien avulla. Ensin yhtyvät toisiinsa B7- ja CD28-, vasta tämän jälkeen MHC- ja T-solureseptorit.

T-soluDendro-syytti

MHC T-solu-reseptori

B7 CD28

Jos yhdistelmä-DNA-tekniikalla (kuva 68) liitetään esimerkiksi Dendrosyytin B7-

reseptoreihin punainen GFP-proteiini ja MHC-reseptoreihin vihreä, voidaan

reseptorien sijaintia ja liikehdintää solukelmulla seurata värien leikkinä

reaaliaikaisesti valomikroskoopilla (kuva 70).

Itsevalaisevia transkriptiofaktoreita

Samanlaisella yhdistelmä-DNA-tekniikalla voidaan tuottaa valoa hohtavia

transkriptiofaktoreita. Jos tutkimuksen kohteena ovat vaikkapa alkionkehitystä

ohjaavat transkriptiofaktorit, valon syttyminen solulimassa paljastaa, missä

alkionkehityksen vaiheessa solut kyseisiä TF:iä tuottavat. Kun valotäplät siirtyvät

solulimasta tumaan, on se merkki transkriptiofaktoreiden aktivoitumisesta ja siitä,

että ne kiinnittyvät omien kohdegeeniensä säätelyosiin.

Tilaa luovuudelle!

Lopputilanne: B7-apureseptorit laidoilla (vihreä), MHC-reseptorit keskellä (punainen).

Lähtötilanne: B7-apureseptorit keskellä (vihreä), MHC-reseptorit laidoilla (punainen).

Kuva 70. B7- ja MHC-reseptorien liikkuminen dendrosyytin solukelmulla (vertaa kuvaan 69). Kuvassa on se alue solukelmusta, jonka kohdalta dendrosyytti telakoituu T-solun kanssa.

Välivaihe: B7- ja MHC-reseptorit vaihtavat paikkaa.

a) GFP-geenikoettimia

GFP:n rakennetta koodaavassa geenissä on kaksi peräkkäin sijaitsevaa osaa.

Toinen osa koodaa aminohappoketjua, joka muodostaa lampunvarjostinta

muistuttavan lieriömäisen rakenteen. Toinen osa koodaa pienempää sauvamaista

rakennetta, jota kutsutaan kromoforiksi. Valmiissa GFP:ssä kromoforiosa työntyy

”varjostinosan” sisään. GFP tuottaa luminenssia (valoa) vain, kun mainitut osat

ovat sisäkkäin (Kuvan 71 yläosa).

Eräs tutkijaryhmä sai ajatuksen katkaista GFP-geeni kahtia juuri ”varjostin-” ja

kromoforiosan välistä. Näin voitiin valmistaa kahdenlaisia GFP-geenejä: sellaisia,

joissa oli pelkän ”varjostimen” rakenneohje sekä sellaisia, joissa oli pelkän

kromoforin rakenneohje. Näitä kumpaakin geeniä sitten kloonattiin (=monistettiin)

erikseen. Kun geenit istutettiin bakteereihin, kumpaakin osaproteiinia voitiin

tuottaa suuria määriä (Kuvan 71 keskiosa).

Kun epäsymmetrisellä PCR-menetelmällä monistetaan jotakin DNA-juostetta,

voidaan PCR pysäyttää yksijuosteiseen vaiheeseen ja kemiallisesti kiinnittää

jokaisen juosteen 5´-päähän GFP:n varjostinproteiini. Kiinnittämisessä yleisimmin

käytetty kemiallinen ”välike” on eräs B-ryhmän vitamiini biotiini (englanniksi

välikkeen lisääminen onkin nimeltään biotinylation). Näin saadaan ”GFP-

hatutettuja” geenikoettimia, joita voidaan kestävöidä geenisiruihin.

Jos halutaan selvittää, täsmääkö jonkin DNA-näytteen emäsjärjestys edellä

mainittuihin geenikoettimiin, voidaan näytejuosteiden 3´-päät puolestaan leimata

GFP:n kromoforiosilla. Jos emäsjärjestykset täsmäävät, näytejuosteet pariutuvat

geenisirulla olevien koettimien kanssa. Tällöin DNA-juosteiden 3´ja 5´-päät

asettuvat sirulla kohdakkain, kromoforit löytävät ”varjostimensa” ja GFP:t alkavat

tuottaa valoa, näppärää (kuvan 71 alaosa)!

”Varjostinosa” KromoforiosaGFP

GFP-geeni

3´ 5´5´3´

3´ 5´5´ 3´

Kuva 71. GFP:n geeni koodaa kromoforiosaa ja ”varjostinosaa”. Geeni voidaan katkaista, jolloin saadaan erillinen geeni kummallekin osalle. Geenejä voidaan kloonata (=monistaa) ja tuottaa niiden avulla asianomaisia proteiineja. Proteiineilla voidaan leimata esimerkiksi DNA:n yksöisjuosteita. Kun juosteet pariutuvat, GFP alkaa tuottaa valoa.

”Varjostin”geeni Kromoforigeeni

Leimataan mikrosirulla olevien geenikoettimien ja tutkittavassa näytteessä olevienDNA-juosteiden vastakkaiset päät GFP:n eri osilla.

Luminesenssi

Tutkittava DNA-näyte

Mikrosirulla oleva geenikoetin

b) GFP-transkriptiofaktoreita

Monet transkriptiofaktorit ovat dimeerejä. Tämä tarkoittaa sitä, että ne kiinnittyvät

geenien säätelyosiin aina parina, vähän niin kuin vasemman- ja oikeankäden

hansikas, kun pannaan kädet ristiin.

Jos nyt valmistetaan GFP-yhdistelmägeenejä, jotka koodaavat tällaisia

transkriptiofaktoreita, voidaan vasemmanpuoleista osaa koodaavan geenin

jatkoksi liittää pelkän ”varjostinosan” rakenneohje ja oikeanpuoleista osaa

koodaavan geenin jatkoksi pelkän kromoforiosan rakenneohje.

Kun nämä geenit toimivat, syntyy kahdenlaisia GFP-transkriptiofaktoreita: osassa

on mukana ”varjostin-” ja osassa kromoforiosa. Kyseiset transkriptiofaktorit

sytyttävät ja sammuttavat valonsa sitä mukaa, kuin ne aktivoituvat eli kiinnittyvät

pareina kohdegeeniensä säätelyosiin tai irtautuvat niistä.

GFP:stä Nobel-palkinto

GFP-rekombinanttigeenit ovat rajusti helpottaneet solubiologisten ilmiöiden

tutkimusta. Merkittävyydessä menetelmää on verrattu jopa mikroskoopin

keksimiseen. GFP-väreillä on tutkittu synapsien syntyä hermosoluissa,

aivosolujen vaurioitumista rappeuttavissa aivosairauksissa, haiman insuliinia

tuottavien beta-solujen toimintaa ja syöpäsolujen leviämistä elimistössä. GFP

paljastaa milloin ja missä jokin geeni alkaa toimia sekä sen, minne geenin

koodaamat proteiinit siirtyvät valmistumisensa jälkeen. GFP-

rekombinanttitekniikan kehittäjät (Osamu Shimomura, Martin Chalfie ja Roger

Tsien) saivat työstään kemian Nobel-palkinnon vuonna 2008.

9.12 RNA-interferenssi eli RNAi (interfere = puuttua asioiden kulkuun)

Kuva 71. GFP:n geeni koodaa kromoforiosaa ja ”varjostinosaa”. Geeni voidaan katkaista, jolloin saadaan erillinen geeni kummallekin osalle. Geenejä voidaan kloonata (=monistaa) ja tuottaa niiden avulla asianomaisia proteiineja. Proteiineilla voidaan leimata esimerkiksi DNA:n yksöisjuosteita. Kun juosteet pariutuvat, GFP alkaa tuottaa valoa.

Kaksijuosteiset RNA-virukset (dsRNA-virukset) ovat viruksia, joiden genomi

muodostuu kahdesta toisiinsa sitoutuneesta RNA-juosteesta. Kun virus tunkeutuu

isäntäsoluunsa, viruksen proteiinikotelo hajoaa. Sen jälkeen viruksen omat RNA-

polymeraasit alkavat valmistaa kopioita alkuperäisestä virusgenomista. Genomin

perusteella valmistuu myös yksijuosteisia mRNA-molekyylejä. Niiden perusteella

isäntäsolun ribosomit alkavat valmistaa virukselle ominaisia proteiineja. Yksi

kuuluisimmista dsRNA-viruksista on mahatautia aiheuttava rotavirus.

Evoluution kuluessa kehittyi soluihin jo varhain kyky havaita virusinfektiot juuri

kaksijuosteisten RNA-molekyylien perusteella. Solulimassa olevat Dicer-nimiset

proteiinit tarttuvat dsRNA-molekyyleihin ja katkovat ne 22 nukleotidin mittaisiksi

jaksoiksi. Sen jälkeen RISC-proteiini (=RNA Induced Silencing) hajottaa pilkkeet

yksijuosteiseksi RNA:ksi. RISC rakentuu useammasta pienemmästä proteiinista

modulaarisesti samaan tapaan kuin vaikkapa B-valkosolujen tuottamat vasta-

aineet.

RISC-proteiinin kuljettaa mukanaan viruksen yksijuosteisia RNA-jaksoja. Tällöin

sellaiset solussa olevat mRNA-molekyylit, joissa on virus-RNA-jaksolle

vastakkainen emäsjärjestys, pariutuvat sen kanssa ja niiden translaatio

proteiineiksi pysähtyy. Näin virusproteiinien tuotanto loppuu, eikä virus pysty

lisääntymään (kuva 72).

2b. Dicer alkaa katkoa viruksen dsRNA:ta lyhyemmiksi pilkkeiksi.

1. Viruksen dsRNA-genomi saapuu soluun.

Dicer

2a. dsRNA:n perusteella alkaa valmistua lähetti-RNA-molekyylejä.

3. RISC halkaisee pilkkeet yksijuosteisiksi RNA-molekyyleiksi ja alkaa kuljettaa niitä mukanaan.

4. RISC tarttuu sellaisiin lähetti-RNA-juosteisiin, joissa on RISCiin kiinnittyneelle RNA-juosteenlle vastakkainen emäsjakso.

5. Isäntäsolun ribosomit eivät voi lukea viruksesta peräisin olevia lähetti-RNA-molekyylejä, jolloin viruksen toiminta estyy.

Virusgenomin tuottamia lähetti-RNA-molekyylejä

RISC

Kuva 72. RNA-interferenssin toimintaperiaate. Dicer ja RISC ovat proteiineja, jotka vaimentavat virusgenomin toiminnan.

RNAi:hin perustuvat hoitomuodot

Kaksijuosteisia RNA-molekyylejä voidaan valmistaa myös tarkoituksellisesti.

Tällaisen RNA-molekyylin mallina voidaan käyttää vaikkapa syöpägeeniksi

mutatoitunutta DNA-jaksoa. Kun kyseinen kaksijuosteinen RNA-molekyyli

viedään potilaan soluihin viruksen mukana, RISC estää nyt virus-RNA:n ohella

myös syöpägeenin proteiinituotannon. Siksi, vaikka itse syöpägeeni säilyykin

solun genomissa, solu kuitenkin lakkaa toimimasta syöpäsolun tapaan.

RNAi:tä voidaan käyttää myös retrovirusten vaimentamiseen. Retroviruksien

genomi on yksijuosteinen RNA-molekyyli, jonka virus muuttaa

käänteistranskriptaasin avulla kaksijuosteiseksi DNA:ksi. Kaksijuosteinen DNA

asettuu sitten isäntäsolun geenien joukkoon.

Jos valmistetaan kaksijuosteisia RNA-molekyylejä, joissa on virusgenomille

ominaisia 22 nukleotidin mittaisia emäsjärjestyksiä, Dicer ja RISC estävät viruksen

lisääntymisen. Esimerkiksi HIV on retrovirus.

RNAi tuotti löytäjilleen (Andrew Fire ja Craig C. Mello) lääketieteen Nobel-

palkinnon vuonna 2006.