TITULACIÓN FAGOλ

Para la titulación de una solución de fago λ se utilizará una técnica de recuento directo denominada doble capa de agar (Doble Agar Layer: DAL), que permitirá determinar el número de viriones (o de unidades formadoras de placas de lisis(UFP) presentes en la solución original de fagos.Por la técnica DAL se detectan unidades fágicas por aparición de placas de lisis o zonas de ausencia de crecimiento celular.En el caso del fago λ, la cepa receptora será E.coli LE392 que presenta receptores específicos de superficie para este fago. Para incrementar la adsorción del fago a la célula hospedadora, se inoculará la cepa de LE392 en el medio NZY enriquecido con cationes divalentes (Mg++ y Ca++) y con maltosa con objeto de favorecer los procesos de adsorción viral (por inducción celular de las proteínas reconocidas por el virus).

Protocolo.

Se realiza un preinóculo de 12 horas en medio TSB de la cepa E.coli LE392.

Se toma un inóculo del 1% y se pasa a un nuevo matraz conteniendo medio NZY. Y otro inóculo del 1% se pasa a un matraz con medio NZY al cual se le añade maltosa 2% y sulfato magnésico 10mM para favorecer la adsorción fágica. Se deja crecer 3 horas hasta que adquiera fase de crecimiento exponencial.

A partir de una solución stock de fago λ, se realizan diluciones seriadas utilizando la solución SM.

Se mezclan 200µl del cultivo bacteriano con 100µl de la dilución que se considere oportuna. Se deja incubar las bacterias con los fagos 20 minutos.

Se toma un tubo de polipropileno (10ml) y se le añade 5ml de medio licuado NZY que se usará como cobertera (agar al 0.6%) y que está a 45º.

Pasados los 20 minutos de incubación bacteria-fago (adsorción), se añaden estos 300µl al tubo conteniendo 5ml de medio NZY (0.6%). Se invierte el tubo varias veces.

Se vierte el contenido del tubo en una placa que contiene la capa de soporte (medio NZY con 1.5% de agar) y se extiende cubriendo toda la superficie.

Se deja incubar 24horas a 37º.

Para la determinación del número de unidades formadoras de placas de lisis, se emplea la siguiente fórmula: Título viral nº halos de lisis x factor de dilución (UFP/ml) Volumen inoculado

200µl LE392+

100µldilución fago

Soluciónde fagos

10-2 10-3 10-4 10-5

NZY+maltosa 2%+Sulfato magnésico 10

mM

LE392TSB

1% 37º agitación 3hNZY

200µl LE392(suplementos)+

100µldilución fago)

Incubar 20 min

4mlNZY+ mezclaBacteria-fago

Mezclar y verter

Incubar a 37º 24 horas