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Biotecnología aquí!
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La espectrometría de masas y sus aplicaciones a la biotecnología acuícola, agrícola y ambiental.
Virna Cedeño Escobar, Ph.D.
“un espectrometrista de masas es alguien queidentifica lo que es algo a través de destrozarlo con un martillo y analizar laspartes".
Espectrometría de masa de BiomoléculasComposición celular
Familias de biomoléculas• Oligonucleótidos (DNA, RNA)• Proteínas/péptidos• Lípidos• Oligosacáridos• Compuestos orgánicos pequeños (metabolitos, neurotransmisores)
Célula animal
• Altamente complejas: molecular numerosas de diferentes familias y varias propiedadesfísico químicas
Célula vegetal Célula bacteriana
La espectrometría de masas (MS)
LA ESPECTROMETRÍA DE MASA ES UNA
PODEROSA TÉCNICA MICROANALÍTICA QUE
PERMITE DETERMINAR CON GRAN
PRECISIÓN LA MASA DE MOLÉCULAS
Un espectrómetro de masa mide la relación masa/carga (m/z) de moléculas (y/o sus fragmentos) y átomos .
El proceso implica :
- La conversión de la muestra en iones de fase gaseosa. - Separación de los iones basados en su m/z- Detección de los iones de cada m/z
Espectrometría de masas
I. Fuente de ionesCreación de iones en fase
gaseosa
II. Analizador de masasSeparación de iones en
fase gaseosa de acuerdo a su relación masa/carga
(m/z)
III. DetectorDetección por mediciónmedición de frecuencias.
• Un espectrómetro de masas está siempre compuesto de 3 componentes.
Espectro de masas MS
M/z
Inte
nsity (
a.u
.)
M en a.m.u. o u. (químicos) oDalton Da (biólogos)
1u = 1Da = 1.660 540 × 10−27 kg
Peaks present
Gaussian profiles
z carga efectiva(no unit)q= z . e coulombs (e = 1.6 × 10−19 C)
M/z no unit
Flujo de trabajo para la MS
FWHM
Mass
Assignment
Apex
R =Mass
FWHM
Exactitud de masa: precisión
100%
50%
1005 104010201010995
(1000 Da)
1030990
m/z
observed mass - theoretical mass
theoretical massx106Mass accuracy (ppm) =
FUENTE DE IONES MALDI (Matrix-Assisted Laser desorption/ionization)
Analizador de masas : Time of fligh: TOF (tiempo de vuelo)
Láser(337nm)
Cámara
Microplaca
Zona de aceleraciónTOF1
Fuente de ionización 1
Fuente de iones 2
Zona de decaimientoTOF2
Detector
Selector de iones
Detector lineal
Espejos de iones(Reflectrón)
Pila de desaceleración
La espectrometría de masas: Maldi TOF-TOF
Espectrometría de masas
MS MS/MS or MS2
Flujo de trabajo MS MS: para determinación de estructura
MS spectrum
M/z
Inte
nsity (
a.u
.)
M1M2
M3
M4
Molecule of interest i.e. parent ion
or precursor ion
F+ Fragment ions or daughter ions
Ion selection
M/z
Inte
nsity (
a.u
.)
M1
MS2 spectrum
M/z
Inte
nsity (
a.u
.)
M1F1+
F2+F5+
F3+
F4+
Ion selection
m/z separation of fragment ions
Fragme
ntatio
n
Proteomics Classical Bottom-Up Proteins ID strategy
Enzymatic digestion MS (MALDI, ESI)Protein (M, IP)
M/z
Inte
nsity
f1+
Spot exision
10 kDa
100 kDa
25 kDa
50 kDa
Gel 2D
Isoelectric focusing (IP)
FragmentationMS/MS
M/z
Inte
nsity
Databank identification
"Peptide Mass Fingerprint PMF
Peptide Sequence TagPST
f2+
f3+
f4+
f5+
Parent ion
Databank identification
Imaging Mass Spectrometry
- Permite evaluar mezclas moleculares complejas en células, tejidos u otros tipos de muestracon una alta especificidad.
- Permite analizar una variedad de especies moleculares (amplio rango de masa, desdepequeños metabolitos a grandes moléculas tales como las proteínas).
- Localización simultánea de moléculas
- Detección de modificaciones post-traduccionales.
- Provee información cuantitativa relativa en un solo experimento.
- Las imágenes de IMS son únicas y se derivan de medidas moleculares directas sin depender de reactivos específicos de un blanco (ej anticuerpos)
- Permite mapear la distribución espacial con la exactitud de la masa y la especificidadquímica (MALDI TOF TOF).
Histología molecular: cortes con el criostato para MSI
Mass Imaging: MALDI TOF TOF
ESPECTROS DE MASAS OBTENIDOS A PARTIR DE ANÁLISIS DE BACTERIAS COMPLETAS
3999.0 6211.4 8423.8 10636.2 12848.6 15061.0
Mass (m/z)
1.4E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 250 - P1-concha 13-08-14; Run #35; Label P16
4420.5737(R221,S232)
6062.9219(R314,S215)
6620.2803(R358,S103)
6868.4863(R396,S73)
3999.0 5208.2 6417.4 7626.6 8835.8 10045.0
Mass (m/z)
1.1E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 250 - P1-concha 13-08-14; Run #33; Label P16
4413.8164(R391,S121)
4424.8374(R679,S101)
6059.7573(R323,S277)
6864.1338(R836,S51)
8407.1768(R650,S58)
3999.0 6211.4 8423.8 10636.2 12848.6 15061.0
Mass (m/z)
2.4E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 250 - P1-concha 13-08-14; Run #35; Label P20
8076.5391(R357,S1033)
6506.1621(R300,S537)
6642.3848(R337,S256)
6658.8638(R485,S156)
7278.8105(R295,S197)
8288.5840(R670,S87)
1999.0 3605.4 5211.8 6818.2 8424.6 10031.0
Mass (m/z)
9.1E+3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 250 - P1-concha 13-08-14; Run #19; Label M4
7370.0371(R479,S568)
6430.3003(R497,S439)
6268.0132(R391,S373)5174.8882(R323,S332)
4341.2739(R669,S123)5890.1665(R402,S320)
6687.2476(R797,S107)
7774.3242(R585,S215)
7652.6382(R649,S179)6796.9312(R484,S126) 9216.9277(R815,S143)
7168.2705(R685,S79)
6562.2339(R670,S75)9191.5742(R727,S81)
8060.9434(R722,S66)
ESPECTROS DE MASAS OBTENIDOS A PARTIR DE MUESTRAS DE TEJIDOS VEGETALES
1999.0 3605.4 5211.8 6818.2 8424.6 10031.0
Mass (m/z)
7342.7
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Final - Shots 250 - P1-concha 13-08-14; Run #18; Label M4
6428.7466(R481,S434)
6266.0112(R376,S403)
7368.4512(R530,S304)
5888.4160(R405,S296)4340.1709(R920,S130)
7772.2310(R559,S244)
5171.6875(R845,S157)
9214.1016(R871,S133)6685.6489(R425,S161)7650.4219(R610,S175)6795.6934(R857,S85)
7163.7559(R1166,S51)
9344.3887(R739,S84)6561.7158(R1021,S51)
8058.1855(R693,S67)
MALDI y MICROBIOLOGIAProteómica y metaproteómicaMetabolómica
Microorganismos
- Métodos basados en espectrometría de masas para monitorearnuevos aislados
- Identificaciones bacterianas de rutina. La velocidad de adquisiciónde datos y análisis (5 min/organismo) permite un alto rendimiento. Los patrones de masas son comparados a perfilesde miles de bacterias lo que permite la identificación de organismos a nivel de género, especies y algunas veces al nivel de subespecie.
- MS puede ser utilizada para estudiar y hacer seguimiento de proteínaspresentes en un microorganismo dado para un fenotipo en particular. Ej: un proteoma específico. Lactobacillus sakei CRL1756 investigaciónproteómica de la tolerancia a la sal.
Vertebrados- Estrés relacionado con las condiciones de cultivo- Calidad de peces: comprensión de los mecanismos
involucrados en el desarrollo de malformacionesesqueléticas de la columna vertebral.
- Efectos de la administración de probióticos en las dietas, con resultados interesantes al nivel de la inmunoestimulación.
- Estudios in vitro e in vivo sobre infecciones en pecescultivados
- Desarrollo de vacunas- Estudios toxicológicos para evaluar las expresiones de
proteínas inducidas por los químicos (contaminantesambientales que afectan el crecimiento, reproducción y salud de los animales.
- Descubrimiento de biomarcadores potenciales para el monitoreo y evaluación de riesgos.
Invertebrados
- Herramienta para comprendermejor los mecanismos de respuesta inmmune
- Estudiar los efectos de antibióticos sobre los patronesde expresión de proteínas en la hemolinfa.
- Identificación de organismoscentinelas como los bivalvos queson reservorios de muchoscontaminantes (proteómicatoxicológica)
Algas
- Estudio de la biología de las microalgas y su respuesta a señales ambientales para comprender los mecanismos que desencadenan el desarrollo de blooms algales peligrosos.
- Comprensión del metabolismo para tener aplicaciones biotecnológicas como es la producción de compuestos bioactivos y biocombustible así como su uso en bioremediación.
- Desarrollo de la tecnología de imágenes de masas con espectrometría de masa MALDI TOF TOF, in vitro sobre medios gelosados e in situ sobre cortes congelados, considerando biomarcadores peptídicos, lipidómicos y metabolómicos de bacterias asociadas a la concha negra Anadara tuberculosa.
- Caracterización metagenómica de la microbiota del trips del banano y alteración por microorganismos nativos de la filosfera o rizósfera.
- Caracterización de los simbiontes de trips de banano y análisis del efecto de la microbiota sobre la atracción de los insectos.
- Caracterización molecular genómica y proteómica/mass imaging del hongo de la sigatoka negra del banano.
- Caracterización metagenómica de suelos y aguas contaminados por cianuro derivado de actividades mineras y uso de bacterias degradadores caracterizadas molecularmente para la biodegradación.
- Caracterización de las asociaciones microbianas en las enfermedades de la fruta del cacao y control biológico mediante el uso de bacterias nativas
Proyectos en marcha Universidad Nacional de Tumbes – Incabiotec – Concepto Azul
- Control biológico de los nematodos de la raíz de la uva mediante el uso de bacterias y hongos nativos que afectan específicamente la microbiota de los nematodos.
- Caracterización de la bacteria patógena Pasteuria sp. del nematodo de la raíz de la uva.
- Uso de TALENs para la mutagénesis dirigida de genes de receptores al virus WSSV en el camarón.
- Uso de talens para la mutagenesis del gene suppresor de tumor p53 para la imortalizacion in vivo de hemocitos del camaron.
- Modelización de la salmonelosis del cuy y desarrollo de métodos de prevención basados en la domesticación de la microbiota y en el uso de vacunas ADN.
- Caracterización molecular (genómica, metagenómica, proteómica, metabolómica ) de la microbiota del camarón considerando microrganismos patógenos y benéficos a nivel de la microbiota del tracto digestivo y de la hemolinfa.
- Valorización biotecnológica de desechos de la concha abanico para la producción de hidrolizado incorporado en la dieta de camarón.
- Caracterización molecular y mass imaging de l sistema hormonal reproductivo del paiche y del robalo.
- Caracterización molecular de las mutaciones relacionadas a la fibrosis quística en Perú y caracterización metagenómica y metaproteómica de las infecciones bacterians pulmonares asociadas.
- Caracterización molecular, proteómica y lipidómica de thraustochytridosaislados de manglar y evaluados como aditivos alimenticios para larvas juveniles y reproductores de camarón.
