Львів2013

Неінвазивна пренатальна ДНК-діагностика:

можливості та обмеженняМикитенко Д. О., Зукін В. Д.

Клініка репродуктивної медицини «НАДІЯ»

2

Історія питання

3

1998 – RhD ni (обгрунтування)Lo YMD, New Eng J Med, 339Faas B. H. Lancet, 352

2000 – Моногенна діагностикаSaito H Lancet, 350

2001 / 2002 – Діагностика статі плодаRijnders RJ, Obstet Gynecol, 2001, 98Costa JM, New Engl J Med, 2002, 346

2003 – 2007 – Маркери виділення плодової ДНК2003 – епігенетичні – Lui Y. Y..Clin Chem, 492006 – ins/del – Page-Christiaens G.C. Ann NY Acad Sci, 10752007 – SNP – Chow KCK, Clin Chem, 53

2008 – діагностика материнських мутаційLun FMF, Proc Natl, Acad Sci USA, 105

2008 – NIPD – NGSFan H. C. Proc Natl Acad Sci USA, 105Chiu PWK Proc Natl Acad Sci USA, 105

2006 –ануеплоідії епігенетичні маркериTong Y.K. Clin Chem. 52

2007 – анеуплоідії по РНКLo YMD, NatMed, 13

2009 – ануеплоідії – цифрова ПЛРChiu RWK. Trends Genet, 25

2010 – Епігенетично-генетичний підхід до д-ки анеуплоідійTong Y. K. Clin Chem, 56

2010 2013

1995 – відкриття cffDNAKazakov V.I. et al. Tsitologiia, 37(3)

1977 /79– Циркуляція клітин плода в крові вагітної1977 - Ciaranfi A Schweiz Med Wochenschr 1071979- Herzenberg L.A. Proc Natl Acad Sci USA 76(3)

1997 – відкриття cffDNALo YMD, Lancet, 350

1948 – cell-free DNAMandel P, Mйtals P: Les acides nuclйiques du sanguine chez l’homme.CR Acad Sci Paris, 142.

19701940 1990

4

1997: detection of cffDNA fragments in maternal plasma

Наукова основа неінвазивної ДНК-діагностики Cell Free Fetal DNA (cffDNA)

• Detection: starting week 4

• Fetal fraction: 2 – 40 %• Stability: < 2 hours• Characteristics:

- short fragments, 80 % < 200 bp- released from trophoblast cells

(placenta) by apoptosis / necrosis

* Lo et al., Lancet 1997; 350:485-7

5

Динаміка концентрації cffDNA при вагітності

6

Cell-free fetal nucleic acids for non-invasive prenatal diagnosis (Report of the UK expert working group) 2009

7

Неінвазивна ДНК-діагностика резус-фактору плода

Принцип: пошук послідовностей ДНК, характерних для гена RhD.

з 9 ембр. т. (Клініка «Надія»)

Недоліки: - Підтвердження виділення плодової ДНК- Псевдонегативний результат внаслідок

низької концентрації cffDNA (потребує повторного аналізу через 2 тижні)

- Тільки для одноплідних вагітностей- Можливість розходження генотипу та фенотипу (~1% для Європеоїдної раси).

8

Many RHD-positive Hybrid Alleles

Avent and Reid Blood (2000) 95:375

>50

9

Gene Conversion in RH Genes

Wagner et al BMC Genet 2001 2(1):10

10Wagner et al BMC Genet 2001 2(1):10

Additional RHD-Negative Alleles

RHD

RHCE

11

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

RHCE RHD

RhD-Negative Haplotyes in Africans

Stop codon37 bp insert

Singleton et al , Blood (2000) 95:12-18

D-positive

D-negativeRhD

D-negative(C)ces

D-negativeDeletion

66%

15%

18%

RHD observed in 24% RhD negative African Americans

?

12

Неінвазивна ДНК-діагностика статі плода

Принцип: пошук послідовностей ДНК, характерних для гена Y-хромосоми.

з 7 ембр. т. (Клініка «Надія»)

Недоліки: - Підтвердження виділення плодової ДНК- Псевдонегативний результат внаслідок низької концентрації cffDNA

(потребує повторного аналізу через 2 тижні)- Тільки для одноплідних вагітностей- Визначення тільки генетичної статі- Не виключає можливість наявності генної / хромосомної патології

- Синдром де ля Шапеля (ХХ-синдром чоловіків)- Синдром Нуан (Каріотип 46,XY, фенотип 46,ХО через мутацію PTPN11)- Синдром Сваєра (каріотип XY, Фенотип жіночий через мутацію DHH

(12), NR0B1 (Х), NR5A1 (9), SRY (Y), 9p24.3del )- Синдром тестикулярної фемінізації- Адреногенітальний синдром

13

Неінвазивна ДНК-діагностика моногенної патології

На даний час – виявлення тільки

батьківськх мутантних алелей, відмінних від

материнских

Носій:Мутантний алель виявлений у плазмі

Норма:Мутантний алель не виявлений

14

«Цифрова ПЛР»: аналіз розведенної ДНК у мікрореакторах

Prenatal Diagnosis 2013, 33, 555–562

Алель дикого типу Мутантний алель

Мати (клітини)

Бітько

Плазма, 1-а вагітність

Плазма, контроль

Негативних контроль

Плазма, 2-а вагітність

Актуальність

15Cell-free fetal nucleic acids for non-invasive prenatal diagnosis (Report of the UK expert working group) 2009

Неінвазивна ДНК-діагностика анеуплоїдій

16

Неінвазивна ДНК-діагностика анеуплоїдій

17

Сепарація клітин плода з крові вагітної

18

Компанія Тест Технологія Франшиза

MaterniT21® S-MPS

PrenaTest ® S-MPS

verifi® S-MPS

NIFTY test T-MPS PrenaScan (Чехія)

Harmony® T-MPS

Panorama® SNP

Неінвазивна діагностика шляхом NGS

1. S-MPS (shotgun massively parallel sequencing):• Секвенування всієї ДНК плазми з низьким покриттям (<1x);• Аналіз співвідношення кількості «рідів» за кожною хромосомою (13, 18, 21, X, Y) у змішаній

фракції ДНК.• Відносно проста біоінформатика;• Вимагає визначення вмісту cffDNA! • Висока собівартість одного тесту за рахунок зниження продуктивності секвенатору (оптимум

150 зразків / тиждень).

2. T-MPS (targeted shotgun massively parallel sequencing):• Секвенування локусів ДНК тільки певних хромосом.• Аналіз співвідношення кількості «рідів» за кожною хромосомою (13, 18, 21, X, Y) у змішаній

фракції ДНК.• Відносно проста біоінформатика;• Низкая себестоимость одного теста при большом потоке.• Вимагає визначення вмісту cffDNA! • Вимагає великого потоку пацієнтів (300 зразків / тиждень, не менш, ніж 90 зразків / запуск).

3. Методики на основі SNP:• Секвенуються вибіркові ділянки геному з нейтральними SNP;• Аналіз співвідношення генотипів за кожним SNP у змішаній фракції ДНК.• Розраховується ступінь ризику за кожною хромосомою;• Необхідна система збагачення SNP-вмісних ділянок та їх зчитування з високим перекриттям;• Складні статистичні алгоритми.• Бажане отримання зразку батьківської ДНК

Технології

Технології S-MPS & T-MPS

ДНК плаценти:~87% материнская

~13% плодная

Вільна ДНК плами крові вагітної

Еритроцити

Фрагмент ДНК плода

Тотальне секвенування ДНК

Підрахунок кількості зчитувань за хромосомами Детекція анеуплоідії

ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGTTCC ACCGTGTTTTCCGACCG

TTTCCGACCGAAATGGCTTGTTCCCACAGACCGTGAGCTCGATGCCGGCGAAGATGCCGGCGAAGCATTGT

TAATGCGACCTCGATGCCACAGACCGTGTTTCCCGA

AAGCATTGTTCCCACAG TGTTTTCCGACCGAAATCCGACCGAAATGGCTCCTGCCGGCGAAGCCTTGT

17 bp

66 bp

Довжина зчитувань (ріда): гарантована середня (454, Ion Torrent) чи стандартна (Illumina) довжина 1 зчитування.

Довші зчитування – легше зборка

Основний принцип NGS (shotgun sequencing)

Method – Bioinformatic Analysis of the Sequencing Data

Alignment of the fragments to the respective chromosome by comparison with a human reference genome in the public data base

Counting of the sequences per chromosome, calculation of percentage (e.g. % chromosome 21)

Sequencing and Alignment

Quantification

Example for a Bioinformatic Analysis

Data per sample (single read sequencing)

• About 14.8 million 36bp reads (cover about 8 % of the human genome)

• Thereof, 6.8 million reads fit to only one single position in the human reference genome (unique reads)

• Thereof, 5.7 million reads fit exactly without mismatch to the human reference genome (unique without mismatch)

• Thereof, about 70,000 belong to chromosome 21• %chr21 (euploid): 1.25 vs.

%chr21 (T21): 1.32 (= 73,000;

only 1.05 fold higher)

14.8 m

6.8 m5.7 m

70,00073,000

Method – Calculation of the z-score

z-score calculation:

z-score ≥ 3 T21 positive < 3 T21 negative

The z-score represents the distance between the value measured for a given sample and the median of the reference set in terms of the median absolute deviation (MAD)

z-score of 1 = exactly 1 deviation

z-score of 3 = 3 deviations

Example for a frequency distribution of z-scores

Representation of z-scores as dot plot

Representation of z-scores for a euploid reference set and a case of trisomy 21 as dot plot

28

Неінвазивна ДНК-даігностика за SNP (Natera)

Dhallan et al., 2007

Ринок неінвазивної ДНК-дагностики анеуплоідій

Данные на 27 февраля 2013

Метод: SNP S-MPS S-MPS T-MPS

30

• Технологічні платформи усіх компаній характеризуються однаковою ефективністю, мають подібні показники специфічності та чутливості.

• Усі компанії мають певні труднощі з детекцією анеуплоідій за 13 та статевими хромосомами.

Платформи NIPD

32

33

Залежність ефективності діагностики від концентрації плодової ДНК

Метод: S-MPS

Zimmerman et al., 2012

Метод: SNP

Залежність ефективності діагностики від концентрації плодової ДНК

Which group of pregnant women is the PrenaTest® suitable for?

Taking the legal and methodological facts into account for the PrenaTest® to be carried out, the pregnant woman must

• be in the 9th week of pregnancy or later

• have an increased risk for chromosomal aberrations, especially for trisomy 13, 18 or 21 in the unborn child

Risk factors (also inclusion criteria for the clinical study) are determined as follows:

35 years of age or older

Fetal ultrasonographic findings indicating an increased risk of aneuploidy

Increased risk for aneuploidy based on first trimester, sequential, or integrated screen, or quadruple screen

History of a prior pregnancy with a trisomy

Genetic predisposition for translocation trisomy

Other medical reasons (to be decided by responsible doctor and patient)

• Неможливість застосування у випадку багатоплідних вагітностей• Неможливість детекції збалансованих структурних хромосомних перебудов• Можливість фетоплацентарного розходження каріотипу (джерело cffDNA – клітини

трофобласту)• Неможливість детекції / кількісної характеритики мозаїцизму

Обмеження PrenaTest®

Додаткові умови ISPD, DGGG, GfH/GenDG , ACOG :

• Неінвазивна діагностика – метод високої точності, але не є діагностичним.• Необхідність консультації пацієнтки до та після проведення тесту фахівцем,

компетентним у питаннях неінвазивної діагностики.• До пацієнтки мають буди доведені усі шляхи дослідження аномалій та каріотипу плода,

ризики, можливості та обмеження інвазивної та неінвазивної процедур• У випадку «позитивного результату» - медико-генетичне консультування та дослідження

каріотипу плода (інвазивний метод)• У випадку «негативного результату» - УЗД-моніторинг з метою виключення вад розвитку

1:10

29:1 1:1100

NIPT positive NIPT negative

1:100

3:1 1:11.000

NIPT negativeNIPT positive

1:270

1:1 1:13.000

NIPT positive

positive:Confirmation of the result by

invasive diagnosis

negative:Substantial reduction of the risk, most likely no invasive

diagnosis required

Risk after FTS:

Adjusted risk after NIPT:

NIPT negative

Model for the implementation of NIPT into the prenatal risk assessment of trisomy 21

Having an increased risk for fetal trisomy 21 after conventional first trimester screening (FTS), NIPT can help to decide for or against invasive diagnostic methods:

modified from Benn et al., Ultrasound Obstet Gynecol 2012; 39: 127-130

6000 pregnancies at 1:19 risk for fetal trisomy 21

300 trisomy 21 5700 euploid

295 NIPT + 2 no result 3 NIPT - 17 NIPT + 5637 NIPT -46 no result

amniocentesis297 + 63

1-2 miscarriages (1:200)

low risk, probably abandon AC

3 + 5637

NIPT as Secondary Screening Test After Positive FTS Has the Potential to Decrease Procedure Related Fetal Losses: a Model

Courtesy of Glenn E. Palomaki, Women & Infants Hospital, Alpert Medical School of Brown University, Providence, RI, USA

direct AC in 6000 pregnancies

30 miscarriages (1:200)

„…yet be considered diagnostic. However, offering MPSS testing to women already at high risk for Down syndrome can reduce procedure-related losses by up

96%, while maintaining high detection. Confirmation by invasive testing is still needed…“

„… trisomy 21 among high risk pregnancies. If referrals for amniocentesis chorionic villus sampling were based on the sequencing

results, about 98% of the invasive diagnostic procedures could be avoided…“

NIPT as Secondary Screening Test After Positive FTS

As advanced or secondary screening test for pregnancies at increased risk after FTS, NIPT has the potential to

substantially reduce the number of invasive prenatal procedures

avoid procedure related fetal losses

Chiu et al. 2011 BMJ Palomaki et al. 2011 Genetics in Medicine

Facts about the PrenaTest®

• The only NIPT for fetal trisomies 21, 18 and 13 available in Europe, which is in accordance with the IVD Directive of the EU

NGS based aneuploidy tests for trisomy are covered by the In-Vitro Diagnostics Directive 98/79/EG* of the European Union and the respective national laws.

The Software is CE-marked and monitored by a Notified Body

The Legal Manufacturer must ensure the application of a full quality assurance system (EN ISO 13485)

Right now, PrenaTest® is the only test in accordance with these regulatory requirements.

Therefore, PrenaTest® is the only lawfully marketable NIPT in Europe.

2 Nicolaides, Prenat Diagn 2011; 31:7-15

Клінічні випробування LifeCodexx

Результати LifeCodexx

Висновки• Неінвазивна пренатальна ДНК-діагностика є

високочутливим методом, що в майбутньому стане альтернативою інвазивним, однак характеризується певними обмеженнями, що мають враховуватись при інтерпретації результатів.

• Перспективи:– Розширення кількості хромосом, що аналізуються, та

детекція материнських мутантних алелей у плода.– Здешевлення діагностики у випадку запровадження

обов’язкового медичного страхування та покриття ним зазначених процедур

44

Дякуємо за увагу

45

(044) 537 7 597 info@ivf.com.ua www.ivf.com.uaКлініка репродуктивної медицини «НАДІЯ»