22-23.04.2016 • Київ

Порівняльна геномна гібридизація в пренатальній діагностиці

Микитенко Д. О.к.мед.н.

Клініка репродуктивної медицини «НАДІЯ»

22-23.04.2016 • Київ

Суть проблеми – ідентифікація генетичної аномаліїНе всі внутрішньоутробні патологічні стани (в т.ч. й генетично обумовлених) мають виражену ехографічну й біохімічну картину.

«М'які» УЗ-маркери (гіперехогенний кишківник, вертрикуломегалія, кісти судинних сплетінь, аномальна форма голови, гіперехогенний фокус у серці) можуть зустрічатись у плодів як з нормальним каріотипом, так і у випадку хромосомних аномалій.

Зміни біохімічних показників, які оцінюються під час проведення просівних досліджень І / ІІ триместру, можуть носити неспецифічний характер.

Даігностичний алгоритм передбачає проведення інвазивної процедури

22-23.04.2016 • Київ

Основні завдання пренатальної діагностики

- визначення прогнозу здоров'я майбутньої дитини; - інформування майбутніх батьків щодо ступеня ризику народження хворої дитини; - за наявності високого ступеня ризику спадкової та вродженої патології інформування щодо можливостей подальшого виношування вагітності або прийняття усвідомленого поінформованого рішення вагітної щодо переривання вагітності у відповідності до чинного законодавства; - забезпечення оптимального ведення вагітності та

ранньої діагностики внутрішньоутробної патології.

Ст 3.3.5 Наказ МОЗ N 641/84 від 31.12.2003

- вік жінки - до 18 та після 35 років; - наявність в сім'ї дитини (плода) з хромосомною хворобою або множинними вадами розвитку; - наявність у батьків хромосомної патології, хромосомної перебудови або генних мутацій (для яких картований ген); - моногенні хвороби, що раніше діагностовані у родині або у найближчих родичів (для яких картований ген); - виявлення ультразвукових маркерів хромосомних хвороб у плода; - позитивні результати біохімічного скринінгу у I або II

триместрі вагітності.

Ст 3.3.10

Показання для проведення інвазивної пренатальної діагностики

22-23.04.2016 • Київ

Частота виявлення хромосомної аномалії

Частота вад розвитку серцяХА загибель Значні ВР

Nuchal translucency: an ultrasound marker for fetal chromosomal abnormalitiesSao Paulo Med J/Rev Paul Med 2001; 119(1): 19-23

Мікроцефалія 30 - 66%

Аномалії задньої черепної ямки 33 - 44%

Аномальні форми черепа 27 - 81%

Патологія обличчя 40 - 45%

Кістозна гігрома шиї 68 -75%

Вади серця 29 - 56%

Дуоденальна атрезія 30 - 57%

Гіперехогенний кішкивник 20 - 66%

Аномалії китиць/стоп 37 - 42%

Патологія пуповини 40 - 44%

Затримка розвитку плода 19 - 39%

Частота виявлення хромосомних аномалій при різних ехографічних маркерах

Частота виявлення хромосомних аномалій в залежності від кількості УЗД-маркерів

К-ть маркерів

Частка плодів з хромосомною аномалією

1 маркер 2 %

2 маркера 11 %

3 маркера 32 %

4 маркера 52 %

5 маркеров 66 %

7 маркеров 69 %

≥ 8 92%

22-23.04.2016 • Київ

Частка здорових живонароджених

Проміжний висновок:

УЗД та біохімічні маркери – неспецифічні показники аномального розвитку

Інвазивна генетична діагностика

Результати каріотипування (2012-2015, «НАДІЯ»)(власні пацієнти + за скеруванням сторонніх ЛПУ)Показник Амніоцентез БВХ

Досліджень всього

1650 39

Аномалій каріотипу

99 9

Частка аномальних

6 % 23,1 %

Фактично: (залежно від вибірки)виявлення хромосомної аномалії – 1/16 (амн) ¼ (БВХ)

22-23.04.2016 • Київ

22-23.04.2016 • Київ

Обмеження каріотипуванняМлн п.о. Кількість генів

Геном 3 000 20 000

Хромосома (сер. значення)

150 1 000 – 2 000

Бенд (сер)400 бендів/геном

7,5 50-100

Профаза1 000 бендів/геном

3,0 25-50

Ліміт роздільної здатності 2,0 15-30

Каріотип дозволяє ідентифікувати:- Генетичну стать- Геномні мутації (відсутність чи наявність додаткової

хромосоми)- Хроосомні мутації (великі транслокації, інсепрції,

інверсії, делеції) >5-10 млн п.о.

Частота ідентифікації хромосомних аномалій у дітей з ВВР – від 3%

Обмеження FISHОбмеженість дослідження конкретним локусомКількість досліджуваних локусів обмежена кількістю флуорофорів

22-23.04.2016 • Київ

22-23.04.2016 • Київ

22.q11.2 deletion

Найбільш частий мікроделеційний синдром (1/4000-6000)Фенотипові прояви варіюють від асимтоматичного до несумісних з життям.93% випадків виникають de novo7% успадковуються 10-15% дітей уражених – мають затримку психомоторного розвитку

22-23.04.2016 • Київ

22.q11.2 deletion

22-23.04.2016 • Київ

Мікроделеції, ідентифіковані пренатально

22-23.04.2016 • Київ

Рекомендації:- У пацієнтів з аномаліями плода, які проходять інвазивну діагностику, рекомендується проведення aCGH. Це дослідження знімає

необхідність проведення каріотипування.- У пацієнтів з структурно нормальним плодом, які проходять інвазивну діагностику, може бути проведено або каріотпування, або aCGH.- Більшість аномалій, виявлених aCGH, не пов'язані з віком вагітної, тому проведення дослідження не має обмежуватись віком 35 років і

старше.- У випадках внутрішньоутробної загибелі плода в пізніх термінах вагітності чи мертво народження, рекомендується проведення aCGH-

дослідження через підвищені шанси ідентифікації генетичної аномалії- У випадках завмерлих вагітностей / мимовільних абортів І-ІІ триместру проведення aCGH не є рекомендованим через обмеженість даних

щодо клінічної ефективності виявлення мікроделецій.(однак багато лабораторій використовують aCGH через можливість проведення повногеномного аналізу на нежиттєздатному біологічному матеріалі)

- Має бути проведення медико-генетичне консультування пацієнтів стосовно переваг та обмеження методу з підписанням інформованої згоди.

- Має бути обговорено: - aCGH виявляє аномалії, що ідентифікуються каріотипуванням, та мікроструктурні аномалії, однак не досліджує

усю можливу генетичну патологію- Ідентифіковані aCGH можуть мати різний ступінь клінічного прояву. Прогнозування є неможливим.- Побічною знахідкою дослідження може бути споріднений шлюб чи виключення батьківства- Виявлені аномалії можуть мати сумнівну клінічну інтерпретацію. В таких випадках доцільним є аналіз батьківських

зразків- У випадку виявлення патології з пізньою маніфестацією здоров'я в період зрілого віку не буде порушеним.

Прогнозування на подальше є неможливим. Це також означає, що один з батьків може бути носієм захворювання.

ACOG COMMITTEE OPINION

22-23.04.2016 • Київ

Проект: пренатальне NGS-секвенування 1 000 плодів

22-23.04.2016 • Київ

Клінічний приклад 1Вагітна К, 1979 р.н.Вагітність ІІ, одноплідна, природня, пологів – 0.Просівне дослідження І триместру: КП 4,8 мм. β-ХГЧ – 0,312 МОМ, РАРР-А –0,201 МОМРозрахунок ризику Основний ризик трисомії 21 1: : 227 Основинй ризик трисомії 18 1: : 540 Основинй ризик трисомії 13 1: : 1 698 Переглянутий ризик трисомії 21 1: : 12 Переглянутий ризик трисомії 18 1: : 2 Переглянутий ризик трисомії 13 1: : 2

NIPT PrenaTest (LifeCodexx, GE)Ch13 0.4 (REF<3.9), Ch18 1.2 (REF<3.2), Ch21 2.0 (REF<3.0), ChX -3.1 (REF <-3.0), ChY 8.6 (REF>3.0)Анеуплоїдії досліджених хромосом не підтверджені

Амніоцентез (17т+2 дн)Нормальний чоловічий каріотип

УЗД 20+6Детальна оцінка побудови плода – б/о.Ознаки затримки розвитку плода.

Медико-генетична консультація 22т+2дн

Сімейний анамнез - рідний брат пацієнтки народився з непрохідністю кишківника та вадою нирок (?), помер в неонатальному періоді.Схильність до алергічних реакційЗі сторони чоловіка - в іншому шлюбі дитина померла від вади серця.Ризик передчасної загибелі плода: не вище 2,3%Ймовірність наявності мікроструктурних хромосомних аномалій плода: не вище 5,5%.Р-но: - ДНК-діагностика мікроструктурних хромосомних аномалій плода (чіп-порівняльна геномна гібридизація) (на кріоматеріалі).

22-23.04.2016 • Київ

Чіп-порівняльна геномна гібридизація

Встановлено делецію ділянки 16 хромосоми розміром близько 2,7 Mb в межах бенду 16q22.1.Клінічне значення регіону - вірогідно патогенне. Перекриття патогенного регіону за типом делеція - 38%. 16% делетованого регіону є поліморфізмом по типу делеції.Прогноз несприятливий

22-23.04.2016 • Київ

Гени Асоційована синдромальна патологія (MIM)

ctcf, rltpr, acd, pard6a, enkd1, c16orf86, gfod2, ranbp10, tsnaxip1, cenpt, thap11, nutf2, edc4, nrn1l, pskh1, ctrl, psmb10, lcat, slc12a4, dpep3, dpep2, dus2, karsp3, rnu6-359p, ddx28, nfatc3, rps12p27, esrp2, pla2g15, slc7a6, rnu6-1262p, slc7a6os, prmt7, rnu4-30p, smpd3, rpl35ap33, zfp90, rnu4-36p, cdh3, cdh1, rna5sp429, ftlp14, tango6, rnu6-898p, rps2p45, has3, chtf8, cirh1a, rnu6-22p, sntb2, vps4a, cog8, pdf, nip7, tmed6, terf2, cyb5b, nfat5, mir1538, nqo1, nob1, wwp2, mir140, clec18a, pdxdc2p, mir1972-2, pdpr, clec18c, exosc6, aars, rn7sl407p, rn7sl279p, ddx19b, ddx19a

lecithin:cholesterol acyltransferase deficiency (#245900), fish-eye disease; fed (#136120), hypotrichosis, congenital, with juvenile macular dystrophy; hjmd (#601553), macular dystrophy syndrome (#225280), gastric cancer, hereditary diffuse; hdgc (#137215), ovarian cancer (#167000), endometrial cancer (#608089), north american indian childhood cirrhosis; naic (#604901), congenital disorder of glycosylation, type iih; cdg2h (#611182), charcot-marie-tooth disease, axonal, type 2n; cmt2n (#613287)

10 пацієнтів – безсимптомне носійство22 – клінічні прояви різного ступеню

Ризик затримки психомоторного розвитку, поведінкових/психіатричних відхилень, огранічних порушень головного мозку до 63%

22-23.04.2016 • Київ

Карта генної взаємодіїПорушення процесів:

- міжклітинної сигнальної взаємодії;- адгезивних клітинних контактних взаємодій;- функціонування Е-кадгерин-сигнальних шляхів;- експресії молекул клітинної адгезії- Обміну ліпідів.

22-23.04.2016 • Київ

Клінічний приклад 2Вагітність 20 т.в.. Сурогатне материнство з використанням донорського ооциту.Сімейний анамнез не обтяжений.Амніоцентез – за наполяганням генетичних батьків (каріотипування + aCGH).46,XY. Нормальний чоловічий каріотип

aCGHкаріотип Мікроделеція 22q11.21 надмалого розміру.

Клінічна інтепретація мікроделеції ускладнена.

Перекриття між патогенним регіоном (за типом делеції) та встановленою мікроделецією - 0%.0% делетованого регіону відноситься до поліморфізму за типом делеції.

Прогноз сприятливий

С-м Ді-ДжорджиС-м Котячого ока

22-23.04.2016 • Київ

Клінічний приклад 3Множинні вади розвитку.Амніоцетез.

Каріотип

46,XY,t(1;11;7;13)(p21;q13.5;q32;q22)dn

aCGHarr 1p32.1p31.3(59,590,232-66,044,888)x1 6,5M

arr 7q21.11q21.12(85,783,827-86,862,945)x1 1,0 Marr 7q31.1(109,002,041-112,516,472)x1 3,5M

arr 11q22.3(103,604,143-104,193,985)x1 0,6 M

arr 13q14.3q21.2(50,998,797-60,541,017)x1 9,5 M

~20,5 млн п.о.

22-23.04.2016 • Київ

Клінічний приклад 3Каріотип при скеруванні: 46,XY,der(5)t(5;?)(p15.1;?)

Результуючий каріотип: 46,XY,der(5)t(5;7)(p14.3;p15.3) mat.arr 5pterp14.3(56,491-19,676,356)x1 mat,7pterp15,3(14,916-23,774,964)x3 mat,15q11.2(22,513,580-23,823,079)x3Незбалансований чоловічий каріотип з дериватною хромосомою 5, що утворилася внаслідок транслокації дистального фрагменту короткого плеча 7 хромосоми з точкою розриву p15.3 (внаслідок незбалансованого варіанту сегрегації хромосом через реципрокну транслокацію між 5 та 7 хромосомами матері), інтерстеціальною дуплікацією хромосоми 15 неідентифікованого походження.

arr 5pterp14.3(56,491-19,676,356)x1 19,6 Мarr 7pterp15,3(14,916-23,774,964)x3 23,8 Мarr 15q11.2(22,513,580-23,823,079)x3 1,3 М

22-23.04.2016 • Київ

Клінічний приклад 4 – ідентифікація маркерної хромосоми

Маркерна хромосома – ізохромосома 12р

Біопсія ворсин хоріону.47,XY,+mar

Синдром з тканевим мозаїцизмом (i12p) Палістера-Кіліана• Розумова відсталість,

судоми, грубі риси обличчя, нерівний ріст волосся, коротка шия та ніс

• Характерний нормальний каріотип лімфоцитів

Пренатально: діафрагмальна кила, потиличний набряк, гіпоплазія НК

В одній із лабораторій - маркер помилково ідентифікований як +21

В амніоцитах:mos47,XY,+i(12)(p10)[15]/46,XY[30]

22-23.04.2016 • Київ

Клінічний приклад 5 – ідентифікація маркерної хромосоми

Біопсія ворсин хоріону.47,XY,+mar

11q23.3-q25 (ter) x3

22q11.1-q11.21 x3Маркерна хромосома – похідна фрагментів хромосом11q та 22q

22-23.04.2016 • Київ

Показання до проведення діагностики aCGH

При нормальному каріотипі: При аномальному каріотипі:

Комірцевий простір > 3,5 мм Точна ідентифікація хромосомної аномалії

Вади розвитку

Порівняльна геномна гібридизація – метод ІІ (експертної) ланки генетичного аналізу

22-23.04.2016 • Київ

Діагностичний алгоритмКомбінований скринінг І / ІІ триместру

УЗД-ознаки хромосомних аномалій

Група високого ризику(>1/50)

Група середнього ризику

(1/50-1/1000)

Група низького ризику

(<1/1000)

Інвазивна генетична

діагностикаКаріотипМедико-генетичне

консультування

Високороздільний аналіз

(aCGH, NGS)

немає

NIPT

8% популяції7,6% Т21 *

2,3% популяції90,5% Т21 *

89,7% популяції1,9% Т21 *

наявні

позитивний8% випадків *

негативний

нормальний5-10% ризику мікроструктурних аномалій

аномальний

* - New approach for prenatal testingDr Greg Kesby and Dr Rob RobertsonАustralian Doctor. 13 June, 2013

22-23.04.2016 • Київ

Основний сучасний алгоритм Пренатальної Діагностики

Точна генетична діагностика

Прогноз здоров'я дитини

Планування сім’ї, оцінка повторного

ризику

Вибір методу профілактики

Преімплантаційна діагностика

Пренатальна діагностика

Медико-генетичне консультування

22-23.04.2016 • Київ

Дякую за увагуКлініка репродуктивної медицини

«НАДІЯ»www.ivf.com.ua

(044) 592 21 78