Andrea Dardis, PhDAOU “Santa Maria della Misericordia”

Udine, 27 maggio 2014

Dal sospetto alla diagnosi: il supporto del laboratorio

Mucopolisaccaridosi (MPS)

�Rappresentano un gruppo di patologie rare (Inc 1:25.000 nati vivi)

� Deficit di 1 degli 11 enzimi lisosomialideputati alla degradazione di mucopolisaccaridi

� Accumulo di mucopolisaccaridi(glicosaminoglicani –GAGs) nei lisosomi.

Glicosaminoglicani (GAGs)� Eteropolisaccaridi lineari ; componenti della matrice extracellulare, liquido sinoviale e i tessuti connettivi

�Ripetizioni di specifiche unità disaccaridiche

Acido uronico + Esosamina

GlicuronicoIduronico

GlucosaminaGalattosamina

Gruppi solfato in 4 o 6Acetilazione del gruppo amminico

Polianioni Carica negativa

Glicosaminoglicani più abbondanti

Keratan Sulfate

Degradati mediante la azione di enzimi lisosomiali che rimuovono in modo sequenziale i monosaccaridi e i solfati.

Mucopolisaccaridosi (MPS)Diffetto enzimatico GAGs

α-L-iduronidasi Hurler/Sheie MPS I DS; HS

Iduronato sulfatasi Hunter MPS II DS; HS

Eparan-N-sulfatasi Sanfilippo A MPS III A HS

A-N-Acetil-glucosaminidasi Sanfilippo B MPS III B HS

Acetil-CoA:α-glucosaminideacetiltransferasi

Sanfilippo C MPS III C HS

N-Acetilglucosamina-6-sulfatasi

Sanfilippo D MPS III D HS

N-Acatilgalattosamina-6-solfatasi

Morquio A MPS IV A KS; CS

β-Galattosidasi Morquio B MPS IV B KS

N-acetilgalattosamina-4-solfatasi (Arilsolfatasi B)

Maroteaux-Lamy MPS VI DS

β-Glucuronidasi Sly MPS VII DS; HS; CS

Ialuronidasi MPS IX Hyluronan

DS: dermatan solfato; HS: eparan solfato; KS: keratan solfato; CS: condroitin solfato

Diagnosi di laboratorio

misurazione dell’attività enzimatica nelle cellule del paziente

Biochimico

Molecolare Analisi di mutazioni del gene specifico

GAGs urinari Quantitativo (colorimetrico)

Qualitativo (elettroforesi, HPLC, Spettrometria di massa)

Test specifici

Test negativo non esclude MPS(MPS III)

Substrato specifico+

enzima

Cellule del paziente

Prodotto Fluorescente

(4-Metilumbelliferone)

Diagnosi biochimica

Leucociti

20-25 gg Coltura linfociti immortalizzatiColtura Fibroblasti

Risultati in giornata

Studi futuri

pH acido

Hunter, Sanfilippo IIIA, IIID, IVA, VI ≠ deficit multiplo di sulfatasi

Reference enzyme

DBS Non adatto a diagnosi definitiva

Diagnosi biochimica

Non sufficiente nei casi di pseudodeficienze

Condizione presente nella popolazione generale determinata da polimorfismi

αααα-L-iduronidasi (A300T)ββββ-Glucuronidasi (D152N)

Femmine con sospetta MPS II (raro)

ATTIVITA’ ENZIMATICA MOLTO BASSA NON ASSOCIATA A MALATTIA

Diagnosi molecolare

�Conferma diagnostica

�Approfondimento diagnostico

Correlazione fenotipo/genotipo

Consulenza genetica

prognosi

Portatori

Diagnosi prenatale

Diffetto enzimatico Locus Gene

α-L-iduronidasi Hurler/Sheie 4q16.3 IDUA

Iduronato sulfatasi Hunter Xq28 IDS

Eparan-N-sulfatasi Sanfilippo A 17q25.3 SGSH

A-N-Acetil-glucosaminidasi Sanfilippo B 17q21.1 NAGLU

Acetil-CoA:a-glucosaminideacetiltransferasi

Sanfilippo C 14q21 HGSNAT

N-Acetilglucosamina-6-sulfatasi

Sanfilippo D 12q14 GNS

N-Acatilgalattosamina-6-solfatasi

Morquio A 16q24.3 GALNS

β-Galattosidasi Morquio B 3p21.3 GLB1

N-acetilgalattosamina-4-solfatasi (Arilsolfatasi B)

Maroteaux-Lamy 5q11-13 ARSB

β-Glucuronidasi Sly 7q21.11 GUSB

Ialuronidasi 3p21 HYAL1

Diagnosi molecolare

�Spettro di mutazioni eterogeneo (private mutations)

Diagnosi molecolare

IDUAIDSSGSHNAGLUHGSNATGNSGALNSGLB1ARSBGUSBHYAL1

2074841371536423217179150543

gene Numero di mutazioni

La maggior parte puntiformi

�PCR +Sequenziamento degli esoni e delle zone introniche fiancheggianti

IDUAIDSSGSHNAGLUHGSNATGNSGALNSGLB1ARSBGUSBHYAL1

14986181414168123

gene Numero di esoni

�mRNA RT-PCR + sequenziamento

Conferma nei genitoriNuove mutazioni missenso Analisi funzionale

Diagnosi molecolare

Pseudogene, ricombinazione 13% di pazienti

Portatori o mutazioni de novo/ germline

1 6 8 9 142 10 1173 54 1312

5’ 3’

�MLPA

1-14

1-2 3-14 mRNA aberrante

mRNA normale

Correlazione fenotipo/genotipo

Diagnosi molecolare

�Non è possibile stabilire una correlazione fenotipo genotipo per la eterogeneità delle mutazioni

�Alcune considerazioni generali:

�MPS I: 2 mutazioni ricorrenti : p.Q70X; p.W402X associati al fenotipo clinico severe (Hurler)C.678-7A>G; p.R89Q associati al fenotipo lieve (Sheie).

�MPS IIIA: p.G122R; p.R206P; p.S298P; p.I322S; p.E369K associati al fenotipo lieve

�MPS IVA: p.T312S (ricorrenti in pazienti di origine British –Irish-effetto fondatore) associato al fenotipo lieve.

Diagnosi prenatale

E’ possibile quando c’è un paziente diagnosticato in famiglia

Autosomiche recessive: i genitori, entrambi portatori, hannouna probabilità ¼di avere un figlio affetto

Mamma (portatrice) Papa (portatore)

sano malatoportatore

Diagnosi prenatale

�X linked, Hunter �La diagnosi prenatale è indicata solo nei figli maschi che hanno una probabilità di ½ di essere affetti

Mamma (portatrice) Papa

sano affetto

X X X Y

X Y X Y

�Campione: Villo coriale (12^sett.) o amniociti (16^sett)

�Diagnosi biochimica: Analisi dell’ attività enzimatica

�Diagnosi molecolare: Analisi delle mutazioni presenti nella famiglia.

Solo utile in famiglie in cui le mutazioni sono state caratterizzate.Esclusione della contaminazione con DNA materno

Diagnosi prenatale