Il sequenziamento esomico

di madre-padre-figlio nella diagnosi genetica

Anna De Grassi-- Dip. Bioscienze, Biotecnologie and Biofarmaceutica,

Università di Bari --

6°Convegno Nazionale Malattie Mitocondriali – Maggio 2016 Roma

IL GENOMA UMANO

Cas Kramer et. al, Leicester University (UK)

- circa 3G caratteri

- 130 volumi

- pagine stampate su entrambi i

lati (43,000 caratteri per pagina)

- Il genoma mitocondriale (16K

caratteri) occupa mezza facciata

Manuale identico per ogni cellula su “come si costruisce e si fa funzionare un essere umano”

E’ stato completato nel 2000 (dopo 10 anni di lavoro) al costo di 3,000M $

LA SEQUENZA NON E’ LA FUNZIONESequenza di 4 differenti caratteri, no spazi, no parole, no frasi

Esoni

(2%)

LA FUNZIONE DEGLI ESONI

DNA/Gene

Proteina

(sequenza di amino acidi)

ESOMA: 70M caratteri che codificano per ~30.000 proteine

Avere la sequenza di TUTTI gli ESONI significa avere la sequenza di TUTTE le PROTEINE

Ogni proteina ha un

ruolo nella cellula

Trascritto

IL SEQUENZIAMENTO ESOMICO

Costo di un esoma singolo a Marzo 2016

(ditta Novogene, 12G, 100X): 600$;

Tempo “crudo” richiesto: 21 giorni lavorativi

Esone

Cattura e

sequenziamento

Genoma

Oggi disponiamo dell’esoma di decine di

migliaia di persone diverse

Ognuno di noi (sano o malato) ha un esoma differente da quello di chiunque

altro (compreso quello di riferimento) per centinaia di migliaia di caratteri

Qual’è il carattere differente

(mutazione) che causa la patologia?

TROVARE le MUTAZIONI PATOLOGICHECome si fa a capire quale mutazione tra 100.000 “differenze” è patologica?

L’analisi del trio familiare serve a ridurre le dimensioni del pagliaio

1) I genitori sono geneticamente molto simili al figlio/a malato/a (meno mutazioni)

2) I genitori sono sani (combinazioni mutazionali presenti anche nei genitori non è

per definizione patologica)

Paziente Madre Padre

- mutazioni già note per essere patologica

- mutazioni non note ma in un gene associato a patologia

- mutazioni non note in geni non associati a patologie (“pagliaio”)

Genetic

diagnosis in

< 9-26%

patients

ESEMPIO

QUATTRO PAZIENTI

Pazienti affetti da sospetta patologia mitocondriale:

1) Patologia neurologica e muscolare

2) Difetti di uno o più complessi della catena respiratoria

3) (ridotta quantità di DNA mitocondriale)

Precedenti analisi del DNA con esito negativo:

1) nel DNA mitocondriale

2) nell’esoma del solo paziente

Istituto Besta, Milano (Valeria Tiranti)

Policlinico Gemelli, Roma (Serenella Servidei)

ANALISI dell’ESOMA DEL TRIO FAMILIARE

100.000

70M caratteri x 100 x 3

300

10.000

<10

+

290

Mutazioni rispetto al genoma di riferimento (100%)

Mutazioni rare nella popolazione umana (10%)

Mutazioni rimanenti dopo il confronto con i genitori (0.3%)

Mutazioni in porzioni cod. proteine e siti di splicing

+

Mutazioni in porzioni non codificanti

IL GENE PATOLOGICO PIU’ PROBABILE

TRIO A

GENE: CRAT - carnitina O-acetil trasferasi mitocondriale (non associato a patologia)

MUTAZIONI: due missenso in eterozigosi composita (non note)

TRIO B

GENE: TSFM – fattore di elongazione traduzionale mitocondriale (associato a patologia)

MUTAZIONI: una de novo sinonima (non nota)

TRIO C

GENE: SLC25A10 – trasportatore mitocondriale (non associato a patologia)

MUTAZIONI: codone di stop prematuro + intronica in eterozigosi composita (non note)

TRIO D

GENE: DNAJB5 – presunta “heat shock protein” (associato a patologia dominante*)

MUTAZIONI: una de novo intronica (non nota)

1) dimostrare che le mutazioni alterano l’attività o quantità della proteina

2) dimostrare che la proteina alterata è la causa della malattia

* Gonzaga-Jauregui et al., 2015, Cell Reports 12, 1169–1183

ESPERIMENTI PRELIMINARI - CRAT -

Acetil-CoA + Carnitina CoA + Acetil-Carnitina

minuti

Cellule controllo (100%) Cellule paziente (100%)

MARKER MITOCONDRI (Citrato sintasi)

CRAT

Cellule controllo (100%) Cellule paziente (10%)

minuti

Asso

rba

nza

minuti

Asso

rba

nza

minuti

carnitina carnitina

ESPERIMENTI PRELIMINARI - SLC25A10 -

β-ATPase

SLC25A10Proteina ridotta(western blot)

Trascritto ridotto o

con struttura alterata

Pzctrl PzctrlM

PCR su libreria cDNA RT-PCR su libreria cDNA

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

ctrl Pz

RINGRAZIAMENTI

- Valeria Tiranti

- Eleonora Lamantea

- Daniele Ghezzi

- Vito Porcelli

- Pasquale Scarcia

- Ciro Leonardo Pierri

- Luigi Palmieri

- Angelo Vozza

- Carlo Marobbio

- Giovanni Parisi

- Giuseppe Punzi

Serenella

Servidei

Per chi vuole sapere l’inizio della storia…

La logica dell’analisi del trio ed il confronto tra trio e

singolo esoma sono sulle “slides”del

5°Convegno Nazionale Malattie Mitocondriali

http://www.mitocon.it/?n=81