Upload
alvaro-del-rio-valdivieso
View
101
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
DETERMINACIÓ IL-6 EN TEIXIT COLÒNIC DE PACIENTS
AMB MALALTIA DE CROHN
Pol Pons EstebanellÁlvaro del Río Valdivieso
Curs 2015/2016Tècniques d’assaig immunoenzimàtic
ÍNDEX1. Introducció .....................................................................................
.................................... 2 2. Fonament de la
tècnica ................................................................................................... 3
3. Material específic i reactius necessaris ....................................................................... 4
4. Fases de l’ELISA ............................................................................................................... 5
5. Disseny i condicions del primer assaig ........................................................................ 7
6. Interferències i problemes que es poden plantejar .................................................. 12
7. Fonts d’informació ............................................................................................................ 13
1
1. INTRODUCCIÓ
Malaltia de Crohn
Citocina que es vol determinar: IL-6
Quin interès té la IL-6?
2Figura 2: Protein data bank in Europe
IL-6 d’humà (Homo Sapiens)
Figura 1: Part de l’aparell digestiu que es pot veure afectat per la malaltia de
Crohn
2. FONAMENT DE LA TÈCNICA
3
ELISA sandwich
Sistema Estreptavidina-biotina
Color ∞ [Ag]
Figura 3: Interacció estreptavidina-
biotina
Figura 4: Esquema ELISA proposat
3. MATERIAL I REACTIUS NECESSARIS
4
Producte Tipus Quantitat i [ ] Casa Referència Preu (€)
Ac de captura
Ac anti-IL-6 policlonal de
conill0,2 mL i 500 - - -
IL-6 estàndard
Estàndard IL-6 humana 1 mL i 2 - - -
Ac de detecció
Ac anti-IL-6 monoclonal
de ratolí biotinitzat
0,2 mL i 500 - - -
Estreptavidina-enzim
Estreptavidina-HRP 0,25 mL i - - -
Taula 1: Productes utilitzats per a l’ELISA proposat
4. FASES DE L’ELISA
5
Fase I: Adsorció a la fase
sòlida(Sensibilització de
la placa)
Fase II: Bloqueig
llocs actius
Fase III:Rentat + addició
estàndard i mostres
4. FASES DE L’ELISA
6
Fase IV: Addició anticòs
biotinitzat
Fase V: Addició
estreptavidina-HRP
Fase VI: Addició substrat
+cromogen
Fase VII: Finalització reacció
5. DISSENY I CONDICIONS DEL PRIMER ASSAIG
7
BgBgSt 1
St 2
St 3
St 4
St 5
St 6
St 7
M1d1
M2d1
M3d1
M1d2
M2d2
M3d2
M4d1
M5d1
M6d1
M5d2
M6d2
M6d2
Llegenda:- Bg = Background- St = Estàndard- = Mostra- = Dilució- Blanc
Figura 5: Esquema de
placa proposat
Anticòs de captura:
5. DISSENY I CONDICIONS DEL PRIMER ASSAIG
• =
• Preparem 6 mL de 5
60 L
Rang acceptable μg/mL:
2 8
5
𝟏𝟏𝟎𝟎
8
9
Mostra:
5. DISSENY I CONDICIONS DEL PRIMER ASSAIG
• Segons bibliografía =
• La [ ] més freqüent = 54,1 Serà la
• Per tant, es prepara per dilució 1/3 de
54,1 18,0 333 μL
10
𝟐 ·𝟏𝟎𝟔 𝐩𝐠𝐦𝐋 𝟐𝟎𝟎𝟎𝟎 𝐩𝐠
𝐦𝐋 𝟐𝟎𝟎 𝐩𝐠𝐦𝐋 St 1
5. DISSENY I CONDICIONS DEL PRIMER ASSAIG
200 100 50 25 12,5 6,25 3,13
500 μL
500 μL 500 μL 500 μL 500 μL 500 μL
1/100 1/10010 μL 10 μL
Estàndards, 1mL:
Figura 6: Dilucions seriades
11
Anticòs de detecció:
5. DISSENY I CONDICIONS DEL PRIMER ASSAIG
• =
Rang acceptable μg/mL:
0,125 0,250
0,200
𝟏𝟐𝟓𝟎𝟎
• Preparem 6 mL de 0,200
2,4 L
6. INTERFERÈNCIES I PROBLEMES
• Falta d’informació en quant a IL-6 en teixit colònic en comparació al sèrum.
• Tractament de mostra.
• Problemes al treballar amb concentracions baixes.
• Errors associats a dilucions.
• Menor especificitat i caracterització del Ac policlonal.
12
7. FONTS D’INFORMACIÓ• Thermofisher.com. (2016). HRP-Conjugated Streptavidin - Thermo Fisher Scientific. [online] Available at: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/N100 [Accessed 14 Mar. 2016].• Thermofisher.com. (2016). IL-6 Antibody Monoclonal, Biotin conjugate (505E23C7) (AHC0469). [online] Available at: https://www.thermofisher.com/order/genome-database/antibody/IL-6-Antibody-clone-505E23C7-Monoclonal/AHC0469 [Accessed 14 Mar. 2016].• Thermofisher.com. (2016). IL-6 Antibody Polyclonal (PA1-26811). [online] Available at: https://www.thermofisher.com/order/genome-database/antibody/IL-6-Antibody Polyclonal/PA1-26811 [Accessed 14 Mar. 2016].• Sigmaaldrich.com. (2016). Interleukin-6, human (hIL-6) recombinant (E. coli) | Sigma-Aldrich. [online] Available at: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/11138600001?lang=en®ion=US [Accessed 14 Mar. 2016].
13
7. FONTS D’INFORMACIÓ• IL-6 signaling in autoimmunity, chronic inflammation and inflammation-associated cancer. (2011). Cytokine & Growth Factor Reviews, 22(2), pp.83-89.• Increased production of tumour necrosis factor-alpha interleukin-1 beta, and interleukin-6 by morphologically normal intestinal biopsies from patients with Crohn's disease. (1996). Gut, 39(5), pp.684-689.•Significance of interleukin-6 in patients with inflammatory bowel disease. - PubMed - NCBI. [online] Ncbi.nlm.nih.gov. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2007457.•Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease. - PubMed - NCBI. [online] Ncbi.nlm.nih.gov. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21821036.• IL-6 in autoimmune disease and chronic inflammatory proliferative disease. - PubMed - NCBI. [online] Ncbi.nlm.nih.gov. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12220549. 14