PREMIO Larghero 2012 DEPARTAMENTO DE CIRUGIA , DR JUAN SANGUINETTI

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PREMIO “PEDRO LARGHERO – ERNESTO BENEDEK” 2012

Estrategias de protección frente a la lesión por isquemia reperfusión hepática:

Preacondicionamiento isquémico,Preacondicionamiento farmacológico con Simvastatina,

Poscondondicionamiento isquémico.

Revisión de la literatura y experiencia de los autores

Dr. Juan Manuel Sanguinetti, Dr. Diego Muguruza, Dr. Manuel Sanguinetti, Dr. Juan Cossa, Dr. Fernando Bonilla

RESUMEN.

La falla hepática luego de cirugías de transplante hepático, resecciones hepáticas, shock

hemorrágico, entre otras situaciones, donde existen episodios de isquemia reperfusión (I/R),

continúa siendo un problema en la práctica clínica.

Aunque los mecanismos exactos involucrados en la patogénesis de la lesión hepática

por isquemia reperfusión no han sido del todo aclarados se describen como principales

responsables, la activación de las células de Kupffer, liberación de radicales libres de oxigeno,

liberación de citoquinas proinflamatorias incluido el factor de necrosis tumoral alfa (TNF a) y

acumulación de neutrófilos, entre otros, todos mecanismos con diferentes vías proinflamatorias

que provocan daño tisular.

Diferentes estrategias se han utilizado para prevenir la lesión por IR hepática, entre ellas;

el preacondicionamiento isquémico, el preacondicionamiento farmacológico con Simvastatina y

mas recientemente el poscondicionamiento, cuyos resultados son muy prometedores a nivel de

la bibliografía y también coinciden con los resultados de los autores. Si bien hacen falta más

estudios para descifrar sus mecanismos fisiopatológicos y valorar su eficacia a nivel clínico.

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ÍNDICE:

Introducción y objetivo de la presentación.

Fisiopatología de la lesión por isquemia reperfusión.

Fisiopatología de la lesión por isquemia-reperfusión Hepática.

Mecanismos de protección frente a la isquemia reperfusión hepática.

Preacondicionamiento isquémico.

Preacondicionamiento farmacológico.

Poscondicionamiento isquémico.

Otras estrategias.

Experiencia de los autores:

Preacondicionamiento isquémico en la isquemia hepática.

Preacondicionamiento isquémico en la isquemia reperfusión

hepática.

Preacondicionamiento farmacológico con Simvastatina.

Preacondicionamiento isquémico vs preacondicionamiento

farmacológico.

Poscondicionamiento isquémico hepático.

Experiencia a nivel nacional.

Conclusiones.

Bibliografía.

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INTRODUCCIÓN

La lesión producida por la isquemia en órganos de importancia (cerebro,

médula espinal, corazón, intestino, hígado, riñones) contribuye de manera

significativa a aumentar la morbilidad y la mortalidad de la población general en

todo el mundo.

Frente al déficit o ausencia total de sangre oxigenada, la respiración

celular se ve gravemente afectada, desarrollándose en pocos minutos (variando

esto según el órgano afectado) lesiones celulares graves que pueden tornarse

irreversibles.

La rápida reinstauración del aporte sanguíneo, pese a ser esencial

para la vida, conlleva sus propios riesgos pudiendo ocasionar la denominada

lesión por isquemia reperfusión.

El avance en diferentes técnicas quirúrgicas y el aumento del

conocimiento de los fenómenos que rodean a la isquemia tisular (con la

consiguiente muerte celular y afectación de las funciones), han motivado durante

las últimas décadas, el desarrollo de numerosos métodos de protección para

reducir el riesgo de estas complicaciones quirúrgicas, secundarias a la lesión por

isquemia así como a la lesión por reperfusión.

La falla hepática luego de cirugías de transplante hepático, resecciones

hepáticas, shock hemorrágicos, entre otras situaciones, donde existen episodios

de isquemia reperfusión (I/R), continúa siendo un problema en la practica clínica

(1,2).

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Aunque los mecanismos exactos involucrados en la patogénesis de la

lesión hepática por isquemia reperfusión no han sido del todo aclarados se

describen como principales responsables, la activación de las células de Kupffer,

liberación de radicales libres de oxigeno (4), liberación de citoquinas

proinflamatorias incluido el factor de necrosis tumoral alfa (TNF a) y acumulación

de neutrófilos (3), entre otros, todos mecanismos con diferentes vías

proinflamatorias que provocan daño tisular.

Los esfuerzos para atenuar las lesiones por I/R (isquemia reperfusión) se

han centrado en el bloqueo de los sucesos relacionados con el daño hepático

irreversible. Numerosas estrategias se han desarrollado con este fin, entre las

cuales se encuentran: agentes que reponen a los citoprotectores de origen

endotelial, (análogos de las prostaglandinas I2 (pgI2); inhibidores de agentes pro

inflamatorios, (antagonistas del factor activador de plaquetas (PAF); agentes que

inhiben los neutrófilos y sus mediadores, (agentes inmunosupresores como el

FK506 y la ciclosporina A); estrategias quirúrgicas como el

preacondicionamiento isquémico con el cual nuestro Departamento a

demostrado beneficios en trabajos previos (4, 6) también se han estudiado

sustancias como la melatonina (5,6,7,8) y se han valorado también a las

estatinas para la prevención de la lesión por I/R (12,13,14,15,16).

Actualmente existe un interés creciente en estudiar los beneficios de

diferentes estrategias de protección hepática entre estas; el

preacondicionamiento isquémico, el poscondicionamiento, el uso de estatinas

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(estudiados en nuestro Departamento) y otros fármacos como protectores de la

lesión por isquemia reperfusión (LIR) en diferentes órganos y sobre todo a nivel

hepático (4, 5, 6, 7,9,10,11).

El interés en estudiar estas estrategias para la prevención del daño en la

isquemia y reperfusión hepática, no obedece sólo a la inquietud personal de los

autores en este tema, sino también a la inquietud renovada de la cirugía

hepática en todos sus aspectos en nuestro medio.

Motiva también este trabajo las escasas publicaciones y bibliografía

hallada sobre la lesión isquemia reperfusión hepática y o estrategias para su

prevención en nuestro medio, ni a nivel experimental, salvo publicaciones de los

autores, ni a nivel clínico, siendo esta temática aun un problema frecuente a

nivel de la práctica médica y sobre todo quirúrgica. Problemática con las que el

cirujano convive, en las cirugías de coordinación y urgencias, cuando el flujo

hepático se ve afectado por diferentes mecanismos que mencionamos y

mencionaremos durante la exposición.

El objetivo de nuestro trabajo es describir los principales aspectos

fisiopatológicos existentes en la bibliografía sobre la LIR hepática y aportar la

experiencia de los autores en algunas de las estrategias existentes de

protección hepática frente a esta lesion a nivel experimental pero con proyección

clínica.

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FISIOPATOLOGÍA DE LA LESIÓN POR ISQUEMIA-

REPERFUSIÓN.

La lesión producida por la privación de riego sanguíneo a los diferentes

órganos depende de factores exógenos y endógenos, siendo la hipoxia y la

isquemia las causas más frecuentes de lesión y muerte celular (17, 18, 19).

Estas actúan afectando la respiración oxidativa ya que producen un

disbalance entre el aporte y las necesidades metabólicas de oxígeno, resultando

en un déficit absoluto o relativo, dependiendo del nivel energético celular previo

(17, 18, 19).

Existen diferencias en cuanto a las definiciones de hipoxia y de

isquemia. Mientras que en la hipoxia la producción de energía puede continuar

gracias a la glucólisis, en la isquemia se compromete la disponibilidad de los

sustratos metabólicos (aportados por el flujo sanguíneo) entre ellos la glucosa.

Es así que la isquemia produce lesión celular más rápidamente que la hipoxia.

(19)

Dependiendo de la alteración del aporte y las necesidades metabólicas,

estas células pueden adaptarse, sufrir una lesión reversible o morir (19).

Si la agresión perdura lo suficiente, independientemente de su causa, se

dispara una cascada de eventos bioquímicos que llevan a la muerte celular.

Estos fenómenos pueden ser tempranos o tardíos, ocurriendo en primer lugar un

agotamiento de las reservas de ATP (19).

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Es así que se produce una alteración de la polaridad de la membrana

celular con cambios en el flujo de iones a su través, provocando su

despolarización y una excesiva producción de glutamato. La pérdida precoz de

la permeabilidad selectiva de la membrana (que conduce finalmente a una lesión

franca de la misma) constituye un rasgo constante en todas las formas de lesión

celular (19).

El aumento intracelular de calcio a través de la membrana alterada, activa

diferentes enzimas como proteasas, fosfolipasas, ATPasas y endonucleasas,

determinando proteólisis, formación de radicales libres, peroxidación lipídica y

daño del ADN con el consecuente daño celular (19).

Sabemos que los mecanismos de daño celular se intrincan en varios

niveles hasta llegar a una cascada final común y muerte celular; existen algunas

diferencias en los mecanismos lesiónales que dependen del daño por hipoxia y

aquellos que dependen del daño por isquemia. (19)

Durante la hipoxia, se interrumpe la fosforilación oxidativa y el

metabolismo celular se mantiene gracias a la respiración anaerobia por la vía

glucolítica lo que resulta en una menor producción de ATP y en una acumulación

de ácido láctico y fosfatos inorgánicos disminuyendo el pH intracelular (19).

Posteriormente se afecta la bomba de sodio-potasio dependiente de ATP

localizada en la membrana plasmática, llevando a una acumulación intracelular

de sodio y salida de potasio lo que resulta en edema celular y dilatación del

retículo endoplásmico rugoso. El desprendimiento de los ribosomas y la

disociación de los polisomas disminuyen la síntesis proteica (19).

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Si la hipoxia se mantiene el citoesqueleto se dispersa y se pierden

estructuras como las microvellosidades, formándose vesículas en la superficie

celular. Además, se produce edema mitocondrial y celular debido a las

concentraciones aumentadas de agua, sodio y cloro y niveles de potasio

disminuidos en el espacio intracelular (19).

Estas lesiones son reversibles si se restablece el aporte de oxígeno (19).

Existen múltiples mecanismos patogénicos de daño celular durante un

episodio de isquemia celular. Entre estos se destacan: exocitotoxicidad,

sobrecarga de calcio intracelular, producción de óxido nítrico y formación de

radicales libres y eicosanoides, determinando los últimos un estado inflamatorio

(19). Estos mecanismos tienen varias vías de acción, las cuales pueden ser

secuenciales o paralelas.

La teoría de los aminoácidos excitatorios como mediadores del daño

celular postisquemia ha ganado aceptación (20). El glutamato es uno de los

principales aminoácidos presente en las diferentes células y han sido

identificados múltiples receptores. Estos receptores también pueden ser

activados por el N-metil-D-aspartato (NMDA) y el alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-

isoxazolepropionato (AMPA) (21). Los niveles extracelulares de estos

aminoácidos aumentan rápidamente luego de la isquemia (22).

Los canales activados dependientes del receptor de NMDA permiten el

influjo de calcio intracelular; los receptores de AMPA activados determinan

despolarización de la membrana celular facilitando la entrada de calcio,

aumentan el influjo de éste a través de los canales NMDA dependientes y abren

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los canales de calcio voltaje dependientes, determinando finalmente una

sobrecarga masiva de calcio (22).

A nivel intracelular, el calcio induce activación enzimática que determina

un estado de estrés oxidativo provocando daño irreversible con fragmentación

del ADN, oxidación de proteínas y lesión mitocondrial debida a la fragmentación

de los fosfolípidos de su pared por las fosfolipasas (19).

La activación de la fosfolipasas produce lipólisis de las membranas

celulares con formación de ácido araquidónico y activación de la cascada de

eicosanoides con la consiguiente producción de tromboxano y leucotrienos (19,

21, 22). Estos productos en la evolución agravan la isquemia celular por

alteración de la autorregulación vascular, disfunción de la microvasculatura y

leucotaxis (19, 21, 22).

Por otra parte, las consecuencias de la citotoxicidad debida a la liberación

de aminoácidos como el glutamato no parecen estar mediadas únicamente por

la entrada de calcio a la célula (19, 21, 22). La activación de los receptores

NMDA estimula la actividad de la óxido nítrico sintetasa, lo que lleva a una

sobreproducción de óxido nítrico, alterando todos los procesos fisiológicos

mediados por óxido nítrico (23).

En suma, en la isquemia se desencadenan numerosos eventos,

alterándose la permeabilidad de la membrana celular y la entrada de calcio

(entre otros) generándose un estado de estrés oxidativo que determina fallas en

los procesos metabólicos celulares resultando en daño y muerte celular (19).

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Una forma particular de lesión celular, es lo que se conoce como daño por

isquemia - reperfusión.

Es un fenómeno de acentuación del daño celular que se produce en un

órgano isquémico después del restablecimiento del flujo de sangre oxigenada,

pudiendo resultar en un daño aún mayor que el de la lesión isquémica aislada.

Por este mecanismo un número importante de células pueden llegar a la muerte

después de restablecido el flujo sanguíneo, dependiendo de la duración e

intensidad del proceso isquémico previo (19).

Durante la isquemia - reperfusión se agravan los cambios isquémicos

mencionados destacándose: formación de radicales libres de oxígeno;

promoción y expresión de productos génicos proinflamatorios (moléculas de

adhesión leucocitaria y citoquinas) y un desequilibrio entre las moléculas que

actúan a nivel endotelial como endotelina, tromboxano y óxido nítrico (19).

En la reperfusión, existe un aumento en la formación de radicales libres

por parte de las células parenquimatosas, endoteliales y leucocitos. Varias son

las vías de producción de estas especies reactivas del oxígeno. Por un lado, la

activación mediada por calcio de la fosfolipasa A2 genera ácido araquidónico,

quien es posteriormente metabolizado por la ciclooxigenasa y lipooxigenasa

para formar el anión superóxido. Por otra parte, la disminución en los depósitos

de energía durante la isquemia resulta en la acumulación de nucleótidos de

adenosina. El metabolismo de estos nucleótidos por la vía de la xantinooxidasa

es una fuente importante de radicales libres (19, 24, 25).

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La activación de la óxido nítrico sintetasa es otra fuente de producción de

radicales libres que lleva a la producción de óxido nítrico (25). Éste puede

reaccionar con el anión superóxido y formar peroxinitrato, que se descompone

en radicales hidroxilo, una de las especies reactivas del oxígeno más tóxicas

(25).

Los radicales libres alteran la permeabilidad de la membrana plasmática

al calcio luego de la reperfusión, llevando a una sobrecarga intracelular e

intramitocondrial de este ion. Esto aumenta la permeabilidad de la membrana

mitocondrial, con mayor formación de radicales libres y supresión de la

producción de ATP (25).

Durante la isquemia se observa una importante producción de citoquinas

con expresión aumentada de las moléculas de adhesión de las células

parenquimatosas y endoteliales. Esto favorece el reclutamiento de leucocitos

polimorfonucleares durante el proceso de reperfusión determinando un estado

inflamatorio que contribuye a empeorar la lesión isquémica celular (19).

Por último, otro de los fenómenos más notables durante la isquemia -

reperfusión son los cambios que se producen a nivel de la microvasculatura. Se

producen alteraciones en la microcirculación que dejan áreas de tejido no

perfundidas aún después del restablecimiento del flujo sanguíneo lo que se

conoce como fenómeno de no-reflujo (19).

Este fenómeno se debe a cambios que incluyen: aumento del volumen

celular por acumulación de líquido intracelular con estrechamiento de la luz

vascular; adherencia de los leucocitos al endotelio y formación de trombos de

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polimorfonucleares; agregación plaquetaria; y vasoconstricción debida al estado

de estrés oxidativo el cual lleva a un disbalance entre las moléculas

vasodilatadoras y vasoconstrictoras como la endotelina y el óxido nítrico (19).

Sin importar el mecanismo inicial de daño celular (ya sea hipoxia o

isquemia), una vez que se produce la disrupción de la membrana plasmática y

mitocondrial junto con la pérdida de integridad del citoesqueleto, nos

encontramos frente a una lesión irreversible (19).

Todos los procesos descritos previamente continúan su curso

aumentando aún más la formación de radicales libres y el influjo de calcio

intracelular, con pérdida de aminoácidos intracelulares. El pH intracelular

disminuido activa las hidrolasas ácidas favoreciendo la digestión de los

componentes celulares. Finalmente se produce la muerte celular (19).

Existen dos tipos de muerte celular bien diferenciados: la necrosis y la

apoptosis.

La necrosis hace referencia a un espectro de cambios morfológicos que

siguen a la muerte celular, derivados en gran parte de la digestión enzimática de

la célula y de la desnaturalización de sus proteínas (19).

Existen diferentes tipos de necrosis siendo la más frecuente la necrosis

por coagulación, caracterizada por la desnaturalización de las proteínas

citoplasmáticas, fragmentación de organelos celulares y tumefacción o edema

celular (19).

La apoptosis se produce cuando una célula muere debido a la activación

de un programa interno de autodestrucción o suicidio. Su característica más

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importante es la desestructuración organizada de los componentes celulares a

través de la activación coordinada y programada de acontecimientos internos

que se inicia por un grupo de productos génicos, cuyo objetivo es la eliminación

normal de células durante diferentes procesos fisiológicos. Así, las células se

eliminan con una mínima alteración del tejido que las rodea (19).

El mecanismo de la apoptosis presenta varios estadios clave. En primer

lugar existen varias vías de aproximación a la muerte celular; en segundo lugar

existe una fase de control en la que el umbral apoptótico está establecido por la

expresión y actividad relativas de diferentes factores reguladores positivos y

negativos, entre ellos la familia Bcl-2 de proteínas; en tercer lugar existe una

fase ejecutiva conservada que implica la activación de las caspasas cuya

función es la proteólisis terminal. En esta serie de eventos, uno de los

fenómenos más destacables es la hidrólisis de las proteínas, que implica la

activación de varios miembros de la familia de proteasas de la cisteina

denominadas caspasas (19).

La fragmentación inducida por las caspasas de las proteínas nucleares y

del citoesqueleto constituye la base de las alteraciones nucleares y

citoplasmáticas que se ven en las células apoptóticas (19).

Una de las características mas notables del proceso apoptótico es la

fragmentación organizada del ADN en grandes fragmentos (de 50 a 300

kilobases), a diferencia de la fragmentación al azar que ocurre durante la

necrosis (19).

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Morfológicamente se observan determinados cambios característicos:

constricción celular en el que se aprecia un citoplasma denso y organelos

agrupados; condensación y fragmentación de la cromatina, este último quizás el

rasgo más característico de la apoptosis; formación de vesículas

citoplasmáticas; y cuerpos apoptóticos (19).

Finalmente, los cuerpos apoptóticos son fagocitados por los macrófagos

por el mecanismo denominado fagocitosis mediada por receptores (19).

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FISIOPATOLOGÍA DE LA ISQUEMIA - REPERFUSIÓN HEPÁTICA

El proceso de isquemia-reperfusión hepática (IRH) representa una serie

de complejos eventos que ocurren durante el bloqueo transitorio del flujo de

sangre y oxigeno (isquemia) y el retorno del flujo (reperfusión), condicionando la

disfunción celular hepática (26, 27, 28, 29).

La isquemia-reperfusión (I-R) hepática es una causa importante de

morbimortalidad principalmente en 3 situaciones:

1. En caso de resecciones hepáticas mayores (acompañadas en muchas

circunstancias de una reducción completa del flujo sanguíneo mediante la

maniobra de Pringue (30, 31).

2. Durante el trasplante hepático, que se realiza en hígados que han

tenido un período variable de isquemia fría, con temperaturas entre 1–4°C (32,

33).

La lesión por I-R está estrechamente relacionada con el desarrollo de fallo

primario del injerto (esto ocurre en 5% o menos de los trasplantes) y con la

disfunción primaria de éste ( esto ocurre en el 10–30% de los casos) (34) debido

a lesión celular y de la matriz extracelular (35), lo que ocasiona una mayor

incidencia de rechazo inmunitario y favorece la pérdida del hígado trasplantado

(36, 37).

En el transplante hepático, el hígado puede sufrir tres tipos diferentes de

isquemia:

http://www.elsevier.es/es/revistas/cirugia-espa%C3%B1ola-36/fisiopatologia-lesion-hepatica-isquemia-reperfusion-13148779-revision-conjunto-2010#bib5%23bib5


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Fría, relacionada casi exclusivamente a la parte ablativa del trasplante

Tibia o caliente, característica de la cirugía del trauma, resección hepática

con clampeo del pediculo, shock hipovolémico.

Re-calentamineto, que ocurre durante la manipulación del hígado y la

confección de las anastomosis vasculares (38).

La injuria de las células hepáticas en cada uno de los tipos de isquemia

se detecta fundamentalmente luego de la reperfusión cuando el aporte de

oxigeno es restablecido.

3. Durante situaciones que se producen episodios que originan hipoxia

sistémica o bien aquellas que implican un bajo flujo sanguíneo, da como

resultado una insuficiente perfusión hepática.

Dentro de este grupo se pueden incluir las siguientes entidades: shock

séptico, hipovolémico o cardiogénico (39), en cirugía cardiovascular con

circulación extracorpórea (40), cirugía laparoscópica (41, 42) y en el síndrome

compartimental abdominal (43).

Los 2 tipos celulares más afectados por la lesión isquémica son: los

hepatocitos, con mayor sensibilidad a la isquemia caliente, y las células

endoteliales sinusoidales, mas sensibles a la isquemia fría, de tal forma que

después de 48h de preservación del hígado seguidas de reperfusión, el 40% de

las células endoteliales no son viables, esto ocasiona daño sinusoidal y las




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consiguientes alteraciones en la microcirculación, lo que da como resultado

lesión hepatocítica y disfunción del órgano (44).

Como consecuencia de la hipoxia, se produce alteración de la función de

la cadena respiratoria mitocondrial y existe disfunción de las enzimas

mitocondriales, por lo que se produce la inhibición del proceso de fosforilación

oxidativa con la subsiguiente reducción en la síntesis del ATP (45).

Esta reducción del ATP celular ocasiona alteraciones en el transporte de

iones a través de la membrana. La inhibición del ATP-asa Na+-K+ provoca la

entrada de sodio intracelular y se acumula en la célula, con el correspondiente

edema celular y muerte (46).

Además se produce un aumento en el calcio citosólico, lo que provoca la

activación de las fosfolipasas de la membrana celular y se produce la

degradación de los fosfolípidos y la disrupción de esta membrana (47). Por

tanto, la acumulación de calcio intracelular está estrechamente implicada en el

desarrollo de la lesión isquémica y se considera de crucial importancia en la

evolución a daño irreversible(48).

La lesión de las células del hígado, después de cualquier tipo de

isquemia, se produce fundamentalmente en el período de reperfusión, cuando

se restablece el aporte de oxigeno (O2) y elementos sanguíneos.






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Etapas lesionales en el daño hepático por reperfusión:

En la fisiopatología de la lesión por I-R está implicada una compleja red

de mecanismos intrahepáticos y extrahepáticos. Existen 2 fases distintas en la

lesión hepática por reperfusión:

1. Fase precoz o aguda: comprende las primeras 3 a 6 horas después de

la reperfusión; en esta fase se produce la activación de las células de Kupffer

(49, 50, 51) por acción de los componentes del sistema del complemento,

reclutamiento y activación de los linfocitos T CD4+ (52).

2. Fase tardía o subaguda: se caracteriza por infiltración masiva de

neutrófilos, y alcanza su máximo a las 18 – 24 horas de la reperfusión. Estos

neutrófilos activados liberan especies reactivas de O2 (ERO) y proteasas,

causantes ambos del estrés oxidativo y de la lesión hepatocelular (53, 54). El

secuestro de polimorfonucleares (PMN) en el hígado tras I-R es tan acusado que

la reducción aguda de su recuento periférico se ha propuesto como marcador

intraoperatorio precoz de la lesión por reperfusión del injerto hepático (55).

El reclutamiento de PMN se debe a una compleja serie de mecanismos

secundarios a la isquemia, tanto en el parénquima hepático como en sus vasos,

que alteran las características adherentes de los PMN. Entre estos cambios

pueden desempeñar un papel importante:



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a) La liberación de factores quimiotácticos tales como las ERO por parte

del endotelio o los hepatocitos (56), que perpetuarían de este modo el

quimiotactismo de células proinflamatorias.

b) La producción de mediadores inflamatorios tales como el factor de

necrosis tumoral (TNF)-alfa (3, 57, 58) la interleucina (IL)-1 (59) y el factor

activador plaquetario (60) por parte de las células de Kupffer o por los propios

hepatocitos (61).

c) Cambios en la expresión por parte de las células endoteliales de

antígenos de superficie tales como moléculas de adhesión intercelular y

complejo mayor de histocompatibilidad clase II (62).

d) Lesión del lecho microvascular, que crea fenómenos de «ausencia de

reflujo», y puede prolongar la situación de isquemia.

Mecanismos moleculares de la lesión por reperfusión. Lesión hepática

inducida por factor de necrosis tumoral α (TNF α).

La principal sustancia relacionada con el daño celular es el TNFα, potente

activador de la respuesta inflamatoria, inductor de la producción del anión

superóxido y de metabolitos tóxicos, generador de apoptosis de hepatocitos y

células endoteliales, activador de la adherencia leucocitaria al endotelio, entre

otras funciones.






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Luego de la I-R varias vías de señalización intracelulares son inducidas,

incluyendo el factor nuclear κ-B y la Jun N-terminal Kinase (JNK). Se ha

demostrado que al bloquear la producción hepática de ERO por sobreexpresión

de superóxido dismutasa-1 se puede prevenir casi por completo la activación de

la JNK hepática y la producción de la correspondiente lesión, lo que indica un

papel importante de las ERO en la activación de la JNK y la lesión por I-R (3,

63).

Recientes estudios que utilizan hígados perfundidos ex vivo indican que,

en las situaciones clínicas habitualmente asociadas a hiperproducción hepática

de TNF-α, el causante más probable de la liberación endógena de esta citocina

sería el cambio en el flujo sanguíneo a través del lecho vascular hepático, más

que la isquemia o reperfusión en sí mismas. Además, este incremento en el

TNF-α se ha visto asociado de hecho a una mejora transitoria en la función

hepática (64) e indicaría que la disfunción hepática secundaria a la reperfusión

se debería a mecanismos moleculares alternativos, probablemente la

generación de ERO. Por tanto, a pesar de la abundancia de resultados

experimentales al respecto, el verdadero papel del TNF-α en la lesión hepática

por I-R permanece aún por definirse.

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Especies reactivas de oxígeno en la lesión hepática por isquemia-

reperfusión.

Bajo condiciones de estrés oxidativo, la mitocondria es el principal lugar

de producción de grandes cantidades de superóxido. Este estrés puede

conducir, en su fase final, a la formación de poros de permeabilidad transitoria

mitocondrial y provocar rotura de la membrana mitocondrial y muerte celular (65)

El acúmulo de neutrófilos activados dentro del parénquima hepático causa

daño tisular a través de la producción de ERO y la liberación, por los gránulos

azurófilos, de proteasas, fundamentalmente elastasa y catepsina G.

En 1981, McCord propuso un mecanismo para explicar el rol del oxigeno

en la injuria por isquemia-reperfusión. La clave de este mecanismo es la

conversión de la xantino deshidrogenasa a xantino oxidasa, lo que genera el

radical superoxido (radical libre altamente reactivo), mediante la reducción del

oxigeno en la vía catabólica final del ATP a ADP. Los radicales libres formados

durante la reperfusión producen activación de células fagocitarias, liberación de

moléculas de adhesión y activación del sistema de complemento (66, 67, 68).

En mamíferos, el sistema xantina-oxidasa (XO) se considera una de las

mayores fuentes de generación de ERO tras lesión por I-R (69. 70) y es muy

abundante tanto en el hígado como en el intestino (71). Durante la fase hipóxica

de la I-R se acumula hipoxantina debido a la depleción del ATP, ya que

disminuye el nivel total de energía. En un proceso paralelo, la hipoxia activa las

enzimas proteolíticas que convierten a la xantina-deshidrogenasa en XO (72).



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Los crecientes niveles de XO oxidan la hipoxantina a urato una vez que se

recupera el flujo sanguíneo en la fase de reperfusión. En esta reacción

molecular, el O2 se transforma en radicales superóxidos (73).

Aunque la mayor parte de la XO se encuentra en las células endoteliales,

se ha comprobado la existencia de XO en otras zonas del organismo, lo que

contribuye a la formación de ERO en lugares distales al sitio inicial de la lesión

por I-R. La importancia del papel que desempeña la XO circulante se pone de

manifiesto por el efecto protector que ejercen los scavengers (barrenderos) de

los radicales libres, tales como la enzima superóxido dismutasa y la catalasa

(74).

Por último, se estima que los peroxisomas son causantes del 10–30% del

consumo de O2 total celular en el hígado y son importantes lugares de

producción de ERO. Tanto los sistemas productores de ERO (XO y sistema de

hidroxilación del citocromo P450) como los sistemas antioxidantes

(catalasa/enzima superóxido dismutasa) se localizan en los peroxisomas (75,

76), y estos orgánulos podrían desempeñar un papel significativo en la

modulación del estado redox de la célula (77).

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ESTRATEGIAS DE PROTECCIÓN FRENTE A LA ISQUEMIA

REPERFUSIÓN HEPÁTICA.

Nos centraremos y realizaremos una breve revisión de las estrategias

estudiadas por los autores:

• Preacondicionamiento isquémico hepático.

• Preacondicionamiento hepático con Simvastatina.

• Poscondicionamiento isquémico hepático.

• Otras estrategias.

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PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO (PI).

El PI es un fenómeno descrito en 1986 por Murry y cols. Se define como

el proceso en el cual se realiza la aplicación de episodios de isquemia

reperfusión breves y repetitivos antes de una isquemia reperfusión prolongada.

Posteriormente se describió que la protección obtenida frente a breves períodos

de isquemia – reperfusión era aplicable a diferentes órganos y tejidos además

del corazón; ellos son el músculo estriado, cerebro, intestino, pulmones, riñones

y el hígado (5 17, 78).

Existen alteraciones a nivel celular diferentes en la etapa de isquemia y

en la de reperfusión. Durante la fase de isquemia existen alteraciones del paso

de iones a través de las membranas plasmáticas y mitocondriales, alteración del

metabolismo celular, reducción del consumo de ATP, alteración de la vía de la

glucólisis, alteración en los mecanismos de reserva energética intracelular y

disrupciones en el mecanismo iónico, entre otros (8, 79, 80).

Tras la reperfusión se producen especies reactivas del oxígeno,

mantenimiento del potencial redox intracelular, activación leucocitaria y

producción de citoquinas.

Queda claro que las alteraciones en la etapa de isquemia no son las

mismas que se dan en la reperfusión (78).

El PI produce protección tanto en la etapa de isquemia como en la de

reperfusión. (79, 81, 82).

73


En nuestro Departamento hemos demostrado los beneficios del

preacondicionamiento isquémico como una estrategia de neuroprotección a nivel

medular en el clampeo aórtico prolongado y como protección de la isquemia

encefálica ante una oclusión de la arteria cerebral media (6, 83) y también a

nivel hepático (84).

Es bien conocido el efecto protector del preacondicionamiento isquémico

a nivel hepático luego de la etapa de reperfusión, sin embargo son escasos los

trabajos que demuestran sus beneficios durante la fase de isquemia. En uno de

nuestros trabajos pudimos apreciar el beneficio del PI en la disminución de las

lesiones hepatocíticas en la fase de isquemia (84).

Conocemos dos tipos de respuesta temporal al preacondicionamiento

isquémico: el preacondicionamiento rápido en el cual se induce una tolerancia

isquémica en minutos a horas luego de la isquemia subletal, y un

preacondicionamiento tardío, que se da a partir de las 24 - 48 hs y cuyos

mediadores y factores desencadenantes son los mismos.

El grado de protección hepatocítica por el preacondicionamiento rápido

puede depender entre otros, de la intensidad de la isquemia subletal, de la

intensidad de la injuria letal y del intervalo transcurrido entre ambas (8, 81, 85).

El PI disminuye la lesión hepática en la fase de isquemia mediante la

limitación al paso de iones a través de las membranas plasmáticas y

73


mitocondrial, reduciendo el metabolismo celular y el consumo de

adenosintrifosfato (ATP). Disminuye la utilización de la vía de la glucólisis,

aumenta la eficiencia en la transferencia de energía intracelular, disminuye la

producción de hidrogeniones y mantiene el equilibrio iónico durante periodos de

hipoxia prolongados. Todo esto permite al hepatocito cambiar hacia un fenotipo

tolerante a la hipoxia (5, 80, 86, 87).

Se desconoce exactamente el mecanismo molecular por el cual el

preacondicionamiento isquémico es efectivo, si bien se reconoce la importancia

de las proteínas de shock térmico como una de las responsables del inicio de

este fenómeno. Estas proteínas bajo situaciones de estrés, actuarían a nivel de

los ribosomas celulares, estimulando la síntesis de nuevas proteínas,

reemplazando las proteínas desnaturalizadas. Las proteínas de shock térmico

son fundamentales para el mantenimiento estructural de proteínas del

citoplasma y del citoesqueleto, teniendo funciones antioxidantes e inhibitorias de

la activación de las caspasas; por lo tanto previenen el desarrollo de la apoptosis

(5, 80, 88, 89, 90, 91).

Para el desencadenamiento del preacondicionamiento es necesaria la

generación de una señal que pueda ser trasladada a nivel intracelular

provocando cambios en la actividad proteica y enzimática. Los receptores de

adenosina son fundamentales en la transmisión de señales en estos fenómenos.

Es así que el efecto del preacondicionamiento isquémico puede bloquearse

mediante los antagonistas de los receptores de adenosina. De esta manera la

administración de adenosina o agonistas de los receptores de adenosina tipo1

73


es efectiva al provocar un efecto protector similar al del preacondicionamiento

isquémico (5, 18).

Luego de ocurrida la activación de los receptores, que es la señal que

inicia el efecto del preacondicionamiento, se sucederán cambios secundarios

producidos por mediadores, activándose la proteína G la cual inducirá la

proteinkinasa C (PKC). La PKC actúa en la fosforilación de proteínas. Estos

cambios producirán una disminución del metabolismo celular con disminución

del consumo de oxígeno y nutrientes celulares, manteniéndose así un mejor

equilibrio ácido base y una menor alteración iónica, mejorando así la tolerancia

frente a la hipoxia (5, 8, 81).

Entre otros fenómenos, la traslocación de isoformas específicas de la

PKC mitocondrial y de las membranas del sarcolema tendrían un papel

fundamental y serían en parte las responsables del fenómeno de

preacondicionamiento isquémico (86, 88, 92, 90).

Diferentes trabajos demuestran la importancia de la bradikinina, el oxido

nítrico y la angiotensina II. Otras moléculas que también se han relacionado con

el fenómeno del preacondicionamiento isquémico son el factor nuclear kB

(NFkB), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), la eritropoyetina

(Epo), la oxido nítrico sintetasa (NOS) y el factor inducible por hipoxia (HIF). Aún

no están del todo claro los mecanismos por el cual estas moléculas actúan (90).

73


PREACONDICIONAMIENTO FARMACOLÓGICO.

Los esfuerzos para atenuar las lesiones por I/R se han centrado en el

bloqueo de los sucesos relacionados con el daño hepático irreversible.

Numerosas estrategias se han desarrolado con este fin, entre las cuales se

encuentran: agentes que reponen a los citoprotectores de origen endotelial,

(análogos de las prostaglandinas I2 (pgI2); inhibidores de agentes pro

inflamatorios, (antagonistas del factor activador de plaquetas (PAF); agentes que

inhiben los neutrófilos y sus mediadores, (agentes inmunosupresores como el

FK506 y la ciclosporina A); estrategias quirúrgicas como el

preacondicionamiento isquémico con el cual nuestro Departamento ha

demostrado beneficios en trabajos previos (4) y otras sustancias como la

melatonina (5,6,7,8), la mayoría de los cuales tienen un costo elevado y

provocan serios efectos colaterales o aumentan notoriamente el tiempo

operatorio.

Actualmente existe un interés creciente en estudiar los beneficios de las

estatinas como protector de la lesión por isquemia reperfusión (LIR) en

diferentes órganos. Estudios previos indican que la simvastatina puede disminuir

la LIR en el encéfalo (12), el riñón (9), corazón (10) e hígado (11) pero los

trabajos aun son escasos en este ultimo órgano y sus mecanismos exactos de

protección aún no están del todo aclarados (9,10,11).

Las estatinas son una clase de compuestos que inhiben

competitivamente la 3-hidroxi 3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) reductasa,

73


el primer paso llevado a cabo en la biosíntesis de colesterol en el hígado y en

otros tejidos (12). Muchos de los beneficios de estas sustancias son debido a

sus efectos en el endotelio (13,14).

Es así que se ha encontrado que la simvastatina disminuye los niveles de

TNF alfa y de las transaminasas hepáticas durante la LIR en dicho órgano (9,

10, 11). Existen hipótesis que proponen que el efecto protector de la

simvastatina se debe a sus propiedades anti oxidantes (9, 10, 11).

Múltiples mecanismos se han estudiado en la LIR hepática, entre ellos la

activación de las células de Kupffer, liberación de radicales libres de oxigeno

(93), liberación de citoquinas proinflamatorias incluido el factor de necrosis

tumoral alfa (TNF a) (3), todos mecanismos con diferentes vías proinflamatorias

que provocan acumulación de neutrófilos, apoptosis celular y daño de los tejidos

(94). Los radicales libres producen lipoperoxidación de las membranas celulares

con el consiguiente daño celular. Este daño en las membranas destruye la

homeostasis de los hepatocitos con su posterior lesión y disfunción hepátocitica

(95). La LIR hepática produce daño tanto a nivel local como sistémico (96). A

nivel local altera la función endotelial existiendo una alteración de la

vasoregulación, infiltración del parénquima por células inflamatorias, alteración

de la permeabilidad vascular, con necrosis del tejido (97). Todo esto lleva a un

daño irreversible del hepatocito. Todas estas lesiones serian disminuidas por los

efectos antiinflamatorios celulares de la simvastatina, actuando entre otros

73


lugares a nivel endotelial, a nivel del TNF alfa y de los radicales libre (9, 10, 11,

12, 14).

Es conocido que el estrés oxidativo juega un rol fundamental induciendo

lesión tisular luego de un episodio de isquemia reperfusión, si bien sus

mecanismos aun no están del todo dilucidados. Los radicales libres y los

aniones superóxido están íntimamente asociados a este tipo de lesiones; la

mitocondria juega un papel importante en estas reacciones oxidativas (98, 99).

Existe también quimiotaxis y adhesión celular .Todos estos mecanismos llevan

al daño hepatocitito irreversible con apoptosis celular, necrosis y daño

parenquimatoso, que a nivel experimental se ha demostrado puden ser

disminuidos con la administración de estatinas si bien su mecanismo de acción

no esta del todo aclarado (9, 11, 13, 100,101, 102,103).

Las estatinas son poderosos hipolipemiantes que confieren una serie de

beneficios en la LIR dependenientes de la capacidad de estas sustancias de

preservar y mejorar la función endotelial. Esta propiedad es lograda a través de

un aumento en la producción de oxido nítrico y a la disminución de los

neutrófilos durante episodios de isquemia reperfusión disminuyendo así el daño

celular (13, 14, 15, 16, 103, 104, 105).

Las estatinas poseen además un efecto antioxidante y sobre diversas

especies reactivas del oxigeno, particularmente el anión superóxido, reactivos

presentes en las lesiones por isquemia reperfusión. Se han encontrado también

73


otros efectos anti inflamatorios y anti trombóticos que previenen la lesión celular

(13, 100).

También se ha descrito que reducen, por mecanismos no del todo

aclarados, la adhesión celular al bloquear la expresión de diferentes enzimas

(101). Inhiben la expresión de integrinas que son esenciales para la adhesión de

leucocitos, moléculas de adhesión intracelular, de monocitos y de interleuquinas

de origen endotelial, componentes fundamentales en los procesos inflamatorios

(11, 12, 94, 102, 103).

Por tanto estos efectos antiinflamatorios de las estatinas son

probablemente responsables de su efecto protector frente a la LIR junto con la

disminución del TNF alfa en los diferentes modelos de isquemia reperfusión

hepática en la rata (9,98, 94, 95).

73


POSCONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO.

Recientemente se demostró que el poscondicionamiento (PA), tiene un

efecto protector. El mismo consiste en la aplicación de un proceso gradual por

etapas o salvas de isquemia reperfusión, después de la realización de un

periodo de isquemia (106, 107, 108, 109, 110).

El poscondicionamiento se ha observado que reduce el tamaño del infarto

y la apoptosis en LIR en diferentes órganos (106, 107, 110).

La adenosina se ha implicado en la cardioprotección del

poscondicionamiento, como e-NOS, el óxido nítrico y la guanilato ciclasa (73,

106, 107, 108, 109, 110).

Otras rutas todavía no se han identificado. Muchas de las vías

involucradas en el preacondiconamiento isquémico, han sido identificadas

posteriormente en el poscondicionamiento isquémico (73, 104,105, 106, 107,

108, 109, 110).

La disminución de la apoptosis parece estar relacionada con la

disminución de la expresión de Fas (marcador de apoptosis) en la membrana de

los hepatocitos, dada por el PA (6, 73, 105)

Además de la importancia de la adenosina y el oxido nítrico, estaría

involucrada la apertura de canales K+ATP en la membrana mitocondrial y el

73


cierre del poro de transición que disminuye la permeabilidad de la misma. (6 73,

104, 105, 106, 107, 108, 109).

Las vías intracelulares de supervivencia mediadas por cinasas y

reguladas por señales extracelulares y Akt P13 también jugarían un rol en la

disminución de la LIR.

En trabajos previos fueron analizados los niveles de transaminasas

séricas, glucosa y γ glutamil transferasa (GGT) en el examen biliar, la

histopatología, la actividad apoptótica de hepatocitos mediada por la proteína

Fas (73, 104, 105, 106, 107, 108, 109).

En suma el poscondicionamiento isquémico es un fenómeno de

protección endógena, por el cual ciclos breves de reperfusión/isquemia

aplicados luego de un evento isquémico prolongado reducen el tamaño del

infarto (comprobado a nivel miocárdico) (79). Este "nuevo" mecanismo de

protección fue demostrado en perros, ratas y conejos (79, 81). Sin embargo, su

mecanismo intracelular no se conoce por completo. Algunos autores

demostraron que existe una atenuación de la producción de radicales libres

durante la reperfusión (79, 103) y la activación de señales intracelulares, a nivel

del miocito, algunas de las cuales son similares a las descriptas para el

precondicionamiento isquémico (8, 81). En este sentido, Tsang y colaboradores

(8) describieron que se produce la fosforilación de la enzima fosfatidilinositol-3-

cinasa (PI3K), de la Akt y de la óxido nítrico sintetasa en corazones sometidos a

73


un protocolo de poscondicionamiento isquémico. Si bien se ha estudiado este

fenómeno de miocardio y otros órganos, el estudio de esta estrategia a nivel

hepático es actualmente reciente y se necesitan más publicaciones para aclarar

de forma exacta su valor en la disminución de LIR a nivel hepático.

73


Otras estrategias de protección frente a la LIR hepática .

• Efecto de naloxona y piroxicam en la lesión por isquemia-

reperfusión hepática.

Estudios realizados con naloxona en modelos experimentales, han

proporcionado datos alentadores en base a los resultados obtenidos en el

fenómeno de isquemia reperfusión (112). La naloxona se conoce como un

antagonista de los receptores opiáceos, que modula la producción del anión

superóxido de los PMN y se ha estudiado en el tratamiento de las lesiones

isquémicas de corazón, riñón, intestino delgado, cerebro, hígado y en estudios

de choque hemorrágico (113, 114, 115). En trabajos previamente publicados por

nuestro grupo, se demostró la acción benéfica del piroxicam al ser administrado

de manera aislada durante el fenómeno de isquemia-reperfusión hepática y del

mismo modo, se observó efecto protector con naloxona durante la isquemia-

reperfusión en el intestino delgado, por lo que también se estudió la

administración conjunta de ambos fármacos esperando observar un efecto

sinérgico a nivel hepático (112).

En estos estudios mencionados, se aplicaron los fármacos en la fase

previa al evento isquémico, pero se desconoce si éste efecto se modifica al

aplicarlo en la fase de reperfusión, Existen escasos trabajos en la isquemia

reperfusión hepática aplicando estos fármacos, y sus mecanismos intrínsecos de

acción aun son desconocidos, si bien parecen ser prometedores en la

prevención de la LIR hepática.

73


EXPERIENCIA DE LOS AUTORES

PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO EN LA ISQUEMIA HEPÁTICA

En el año 2009 comenzamos a estudiar la lesion hepátocitica frente a la

isquemia hepática sin reperfusión en nuestro departamento, buscando como

estrategia de protección frente a la isquemia hepática al preacondicionamiento

isquémico, trabajo presentado en el congreso Argentino de Cirugía en el mismo

año, cuyo título es: ”VALOR DEL PREACONDICIONAMIENTO ISQUEMICO

HEPATICO EN LA PREVENCION DEL DAÑO POR ISQUEMIA EN RATAS.

Estudio prospectivo, aleatorizado y pareado.”

El objetivo del trabajo fue valorar la eficacia del preacondicionamiento

isquémico en la disminución de la lesión hepatocítica en la isquemia hepática

aguda, provocada en ratas al clampear el pedículo hepático, sin reperfusión.

Valoramos las primeras alteraciones existentes en el hepatocito y utilizamos

como criterio de juzgamiento las alteraciones histológicas encontradas en el

hepatocito tanto en el núcleo como en la morfología celular, comparando dos

modelos de clampeo diferentes.

Se diseñó un estudio experimental prospectivo, aleatorizado y pareado.

73


Se utilizaron 22 ratas machos, de la cepa wistar, de la misma edad y peso

(entre 300 y 350 gr), De manera aleatorizada, por protocolo marcado, se dividió

a los animales en dos grupos: A y B de acuerdo al lugar de clampeo.

A los animales del grupo A se les realizó una laparotomía mediana, se

identifico el pedículo hepático y sus ramas, se efectuó un preacondicionamiento

de 5 minutos de isquemia y 5 minutos de reperfusión de los lóbulos izquierdos

superiores (los que poseen una arteria hepática accesoria) mediante la

colocación de un clamp vascular en el pedículo izquierdo hepático. Se

clampearon tanto las ramas de la arteria hepática como las de la vena porta y

vía biliar. Luego se realizan noventa minutos de isquemia total del hígado

clampeando el pedículo hepático, ocluyendo tanto las ramas de la arteria

hepática como las de la vena porta y vía biliar, dejando excluido de este clampeo

el pedículo accesorio de los lóbulos izquierdos.

A los animales del grupo B se les realizó el mismo procedimiento pero en

el lóbulo lateral superior derecho.

En ambos grupos luego del preacondicionamiento de los lóbulos

seleccionados y del tiempo de isquemia total se procedió inmediatamente a

realizar la hepatectomía total y su procesamiento histológico.

Conservamos las piezas histológicas en formol al 10% para su posterior

análisis anatomopatológico. Se utilizó hematoxilina y eosina para teñir los

preparados, se seleccionaron los lóbulos medio izquierdo y lateral superior

73


derecho para hacer los estudios histológicos, tanto en los grupos A como B. De

estos lóbulos se seccionó el área central para realizar los cortes histológicos.

Dentro de cada preparado histológico siempre se realizó una vista

topográfica del preparado para cuantificar la homogeneidad del mismo.

Seleccionamos siempre el mismo cuadrante dentro de la lámina con el

preparado histológico y dentro de este cuadrante se seleccionó siempre como

reper una vena centrolobulillar al azar con aumento 10x.

Se midieron tres variables de lesión del hepatocito: alteración nuclear,

alteraciones citoplasmáticas y alteraciones de la histoarquitectura.

Los cambios valorados para el núcleo fueron la morfología alterada con

bordes irregulares y festoneados, aumento del tamaño y cromatina

desorganizada.

Los cambios valorados en el citoplasma fueron la vacuolización,

hiperclaridad y balonamiento.

Los cambios valorados en la histoarquitectura fue la desorganización peri

vena centrolobulillar.

73


FIGURA de: Anatomía Hepática de la Rata. (28)

LMI: lóbulo medio izquierdo.

LMD: Lóbulo medio derecho.

LLI: lóbulo lateral izquierdo.

LLDS: lóbulo lateral superior derecho.

LLDI: lóbulo lateral derecho inferior.

LCS: lóbulo caudado superior.

LCI: lóbulo caudado izquierdo.

73


Figura de; Variedades de la anatomía vascular del hígado de la rata. (28)

TC: Tronco Celíaco

ACE: Arteria Coronaria Estomáquica.

AHP: Arteria Hepática Principal

AHA: Arteria Hepática Accesoria

LLD: Rama arterial del lóbulo lateral derecho

LC: Rama arterial del lóbulo Caudado LM: Ramas arteriales para los lóbulos medios

LLI: Rama arterial para el lóbulo lateral izquierdo.

En cuanto a los resultados:

En el grupo A: en el lóbulo preacondicionado (lóbulo medio izquierdo) las

lesiones fueron leves tanto para la histoarquitectura, citoplasma y núcleo del

hepatocito.

En el lóbulo no preacondicionado (lateral superior derecho) las lesiones

fueron moderadas tanto para histoarquitectura, citoplasma y núcleo del

hepatocito.

73


En el Grupo B, el lóbulo preacondicionado (lateral superior derecho) las

lesiones fueron leves tanto para la histoarquitectura, citoplasma y núcleo del

hepatocito.

En el lóbulo no preacondicionado (lóbulo medio izquierdo) las lesiones

fueron moderadas tanto para la histoarquitectura, citoplasma y núcleo del

hepatocito.

Para el análisis estadístico los test utilizados fueron, para los datos

pareados la prueba de Wilcoxon, mientras que para la comparación entre los

distintos grupos se utilizó la prueba de Mann-Whitney, tomándose como valor de

p significativa menor 0,05.

Comparamos la lesión entre los lóbulos preacondicionados y los que no lo

estuvieron del mismo animal.

Para el grupo A (preacondicionado el lóbulo medio izquierdo), se vio que

existía menor lesión a nivel del núcleo y de la suma de las lesiones con una p

significativa menor a 0,05. Sin embargo no fue estadísticamente significativo

para las lesiones en la histoarquitectura.

Para el grupo B (preacondicionamiento del lóbulo lateral superior

derecho), se vio menor lesión a nivel del núcleo, citoplasma y en la suma de las

73


lesiones, con una p significativa menor a 0.05. Sin embargo no fue

estadísticamente significativo para las lesiones de la histoarquitectura.

Comparamos los lóbulos preacondicionados de cada grupo: el lóbulo

medio izquierdo (preacondicionado) del grupo A y el lóbulo lateral superior

derecho del grupo B (preacondicionado) no existiendo diferencia significativa

para ninguno de los tipos de lesión.

Propusimos una modificación en el modelo de clampeo hepático utilizado

en múltiples trabajos de preacondicionamiento isquémico. En estos trabajos se

realiza el preacondicionamiento de los lóbulos izquierdos, sin tomar en cuenta la

existencia de la arteria hepática accesoria, definida en los diferentes libros de

anatomía de animales de experimentación, que comunica la arteria coronaria

estomáquica con los lóbulos hepáticos izquierdos, por encima del sector donde

es anatómicamente posible clampear, la cual podría mantener la perfusión de

éstos lóbulos al clampear selectivamente su pedículo principal. En nuestro

modelo de clampeo nos aseguramos el clampeo total del lóbulo lateral superior

derecho hepático, donde no existe circulación accesoria que pueda mantener

cierta perfusión durante el clampeo de su pedículo principal (91, 116, 117).

Implementamos un modelo pareado, donde el propio animal de

experimentación es su control, teniendo lóbulos hepáticos preacondicionados y

lóbulos sin preacondicionar, ambos expuestos a una isquemia prolongada,

modelo poco utilizado en los trabajos publicados (5, 86, 87, 88, 116).

73


En nuestro trabajo estudiamos, describimos y comparamos los cambios a

nivel nuclear, a nivel del citoplasma y la histoarquitectura del hepatocito

sometido a preacondicionamiento con el que no es sometido a éste. Analizamos

estas alteraciones en un parénquima sin reperfundir, previo al síndrome de

reperfusión, dado que existe escasa bibliografía que analice en detalle los

primeros procesos del parénquima hepático en la fase de isquemia. Describimos

así los primeros efectos del preacondicionamiento isquémico sobre el

hepatocito. En ambos grupos de animales tanto A como B el control fueron los

lóbulos no preacondicionados del propio animal; destacamos esto ya que existen

pocos trabajos pareados donde el control sea el mismo animal de

experimentación, disminuyendo así las posibles variables interindividuales (116).

En cuanto a la conformación del preacondicionamiento no existe

consenso en el número de ciclos ni en el tiempo de duración de los mismos para

lograr una óptima protección del hepatocito. Mientras que algunos autores

proponen un único ciclo de preacondicionamiento, otros sugieren varios ciclos

cortos de preacondicionamiento. A la fecha, no se encuentran resultados

concluyentes al respecto (81, 89, 116).

Desarrollamos un trabajo prospectivo y pareado lo que potencia los

resultados de los tests estadísticos, disminuyendo posibles variables

interindividuales. Esto además, permite desarrollar un estudio experimental con

un menor número de animales.

73


En base a la bibliografía analizada decidimos realizar un

preacondicionamiento de 5 minutos de isquemia y 5 minutos de reperfusión (81,

86, 87, 89).

Realizamos 90 minutos de isquemia total hepática ya que es el modelo

utilizado en diferentes trabajos experimentales (87, 89, 116).

En todos los lóbulos preacondicionados, tanto del grupo A como del B, la

suma de las lesiones fue menor que en los lóbulos no tratados y existió una

diferencia significativa (p < 0.05). Para el grupo A además existió diferencia

significativa a nivel nuclear. O sea que las lesiones en los lóbulos

preacondicionados fueron menores que en los lóbulos control.

Para el grupo B existió diferencia significativa además de en la suma de

las lesiones a nivel nuclear y a nivel del citoplasma. O sea que existió menor

lesión en los lóbulos tratados, a nivel del núcleo, citoplasma y en la suma de las

lesiones.

No encontramos diferencia significativa en la comparación entre los

lóbulos preacondicionados del grupo A con los preacondicionados del grupo B,

por ende no pudimos demostrar que la arteria accesoria provoque alguna

alteración o tenga alguna importancia funcional en los modelos de

preacondicionamiento isquémico experimentales.

73


En nuestro trabajo pudimos apreciar el beneficio del PI en la disminución

de las lesiones hepatocíticas en la fase de isquemia.

En cuanto a las conclusiones; en base al análisis histológico de los

resultados podemos concluir que una serie de preacondicionamiento isquémico

de 5 minutos de isquemia, con 5 minutos de reperfusión, disminuye las lesiones

hepatocíticas luego de una isquemia hepática total de 90 minutos en la rata,

principalmente a nivel nuclear, durante la fase de isquemia sin reperfusión.

No encontramos diferencia significativa entre los dos modelos planteados;

en nuestro estudio la presencia de la arteria hepática accesoria en el grupo A no

demostró importancia funcional en el análisis estadístico cuando comparamos

los lóbulos preacondicionados del grupo A y B.

73


PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO HEPÁTICO EN LA ISQUEMIA

REPERFUSIÓN HEPÁTICA.

A continuación nuestro departamento decidió estudiar el valor del

preacondicionamiento isquémico en la isquemia con reperfusión hepática en el

trabajo titulado: “PREACONDICIONAMIENTO ISQUEMICO HEPATICO PARA

LA PREVENCION DEL DAÑO POR LESION ISQUEMIA REPERFUSION Y

COMPARACION DE MODELOS DE CLAMPLEO EN RATAS. Estudio

prospectivo, aleatorizado y pareado.” Presentado en el forum de investigación

del Congreso Uruguayo de Cirugía del año 2009.

El objetivo del trabajo fue valorar la eficacia del preacondicionamiento

isquémico en la disminución de la lesión hepatocítica en la isquemia reperfusión

hepática, provocada en ratas al clampear el pedículo hepático y reperfundirlo

por veinticuatro horas. Comparando dos modelos de clampleo hepático

diferentes.

Se diseñó un estudio experimental prospectivo, aleatorizado y pareado.

Se utilizaron 12 ratas machos, de la cepa wistar, de la misma edad y

peso (entre 300 y 350 gr).

De manera aleatorizada, por protocolo marcado, se dividió a los animales

en dos grupos: A y B de acuerdo al lugar de clampeo.

73


A los animales del grupo A se les realizó una laparotomía mediana, se

identificó el pedículo hepático y sus ramas, se efectuó un preacondicionamiento

de 5 minutos de isquemia y 5 minutos de reperfusión de los lóbulos izquierdos

superiores (los que poseen una arteria hepática accesoria) mediante la

colocación de un clamp vascular en el pedículo izquierdo hepático.

Se clampearon tanto las ramas de la arteria hepática como las de la vena

porta y vía biliar. Luego se realizan noventa minutos de isquemia total del hígado

clampeando el pedículo hepático, ocluyendo tanto las ramas de la arteria

hepática al igual que las de la vena porta y la vía biliar, dejando excluido de este

clampeo el pedículo accesorio de los lóbulos izquierdos. Posteriormente se

desclampeo el pedículo y se reperfundió el parénquima por 24hs.

A los animales del grupo B se les realizó el mismo procedimiento pero en

el lóbulo lateral superior derecho. Donde nos aseguramos la no existencia de

pedículo vascular accesorio.

Luego de las 24hs de sobrevida de los animales, se realizo una inducción

anestésica para realizar la hepatectomía total; las piezas se conservaron en

formol al 10%.

73


Se seleccionaron los lóbulos medio izquierdo y lateral superior derecho

para hacer los estudios histológicos, tanto en los grupos A como B. De estos

lóbulos se seccionó el área central para realizar los cortes histológicos.

Dentro de cada preparado histológico siempre se realizó una vista

topográfica para cuantificar la homogeneidad del mismo. De esta manera se

procedió a cuantificar el número de hepatocitos alterados. Se midieron 3

variables de lesión del hepatocito: alteración nuclear, alteraciones

citoplasmáticas y alteraciones de la histoarquitectura, utilizamos el escore

propuesto en trabajos previos.

Los cambios valorados para el núcleo fueron la morfología alterada con


desorganizada.

Los cambios valorados en el citoplasma fueron la vacuolización,

hiperclaridad y balonamiento.

Los cambios valorados en la histoarquitectura fue la desorganización peri

vena centrolobulillar.

En cuanto a los resultados:

El primer objetivo estadístico que se planteó fue valorar si existía menor

lesión significativa entre los lóbulos pre-acondicionados y los que no lo

estuvieron.

73


Para el grupo A, (preacondicionado el lóbulo medio izquierdo), se vio que

existía una diferencia significativa entre las lesiones, a nivel de la sumatoria de

las mismas, pero no para las lesiones a nivel individual, en la histoarquitectura,

el citoplasma, ni el núcleo.

O sea que el lóbulo medio izquierdo sufrió menor lesión a nivel del total de

las lesiones en comparación con el lóbulo lateral derecho (LLD no

preacondicionado). [Pruebas no paramétricas Prueba de los rangos con signo de

Wilcoxon].

Para el grupo B (preacondicionamiento del lóbulo lateral derecho), se vio

una diferencia significativa entre la lesión a nivel de la suma de las lesiones,

pero no para las lesiones a nivel individual. O sea que el lóbulo lateral derecho

(preacondicionado) sufrió menor lesión a nivel de la suma de las lesiones en

comparación con el lóbulo medio izquierdo (LMI).

Un segundo objetivo investigaba la posibilidad de que existiese diferencia

significativa entre el lóbulo medio izquierdo (preacondicionado) del grupo A y el

lóbulo lateral derecho (preacondicionado) del grupo B, que no posee pedículo

accesorio. Para este caso no existió diferencia significativa para ninguno de los

tipos de lesión, algo que se había visto en una publicación anterior y se repitió

en este trabajo. Se utilizo la prueba de Mann-Whitney en la estadística del

mismo.

73


Propusimos una modificación en el modelo de clampeo hepático utilizado

en múltiples trabajos de preacondicionamiento isquémico.

En nuestro modelo nos aseguramos el clampeo total del lóbulo lateral

superior derecho hepático, donde no existe circulación accesoria que pueda

mantener cierta perfusión durante el clampeo de su pedículo principal (17, 78,

80).

Implementamos un modelo pareado, donde el propio animal de

experimentación es su control, teniendo lóbulos hepáticos preacondicionados y

lóbulos sin preacondicionar, ambos expuestos a una isquemia prolongada,

modelo poco utilizado en los trabajos publicados (6, 80, 83, 116, 118).

En nuestro trabajo estudiamos, describimos y comparamos los cambios a

nivel nuclear, a nivel del citoplasma y la histoarquitectura del hepatocito

sometido a preacondicionamiento con el que no es sometido a éste.

Describimos así los primeros efectos del preacondicionamiento isquémico

sobre el hepatocito.

En ambos grupos de animales tanto A como B el control fueron los

lóbulos no preacondicionados del propio animal; destacamos esto ya que existen

pocos trabajos pareados donde el control sea el mismo animal de

experimentación, disminuyendo así las posibles variables interindividuales (116).

73


En cuanto a la conformación del preacondicionamiento no existe

consenso en el número de ciclos ni en el tiempo de duración de los mismos para

lograr una óptima protección del hepatocito. A la fecha, no se encuentran

resultados concluyentes al respecto (81, 89, 116).

Desarrollamos un trabajo prospectivo y pareado lo que potencia los

resultados de los tests estadísticos, disminuyendo posibles variables

interindividuales. Esto además, permite desarrollar un estudio experimental con

un menor número de animales.

Realizamos 90 minutos de isquemia total hepática ya que es el modelo

utilizado en diferentes trabajos experimentales (82, 116).

En base a la bibliografía analizada decidimos realizar un

preacondicionamiento de 5 minutos de isquemia y 5 minutos de reperfusión (81,

82, 92).

En cuanto a las conclusiones; en base al análisis histológico de los

resultados podemos concluir que una serie de preacondicionamiento isquémico

de 5 minutos de isquemia, con 5 minutos de reperfusión, disminuye las lesiones

hepatocíticas luego de una isquemia hepática total de 90 minutos con posterior

reperfusión de 24 horas en la rata, principalmente a nivel de la suma de las

lesiones histológicas. No encontrando diferencia significativa en las variables

histológicas estudiadas individualmente.

73


No encontramos diferencia significativa entre los dos modelos planteados,

en nuestro estudio la presencia de la arteria hepática accesoria en el grupo A no

demostró importancia funcional en el análisis estadístico cuando comparamos

los lóbulos preacondicionados del grupo A y B.

73


EFECTO DE LA SIMVASTATINA EN LA LESIÓN HEPATOCÍTICA POR

ISQUEMIA-REPERFUSIÓN.

En el año 2010 comenzamos a valorar el preacondicionamiento

farmacológico con Simvastatina para la prevención del daño por isquemia


Sabiendo que su uso para la protección de la lesion isquémica hepática

es discutida y existen escasos estudios en la bibliografía en este aspecto y

ninguno a nivel nacional.

El objetivo del trabajo fue valorar el eficacia de la simvastatina en la

disminución de la lesión hepatocítica en la isquemia reperfusión hepática,

provocada en ratas al clampear el pedículo hepático, con reperfusión de 24

horas.

Se utilizó como criterio de juzgamiento las alteraciones histológicas

encontradas en el hepatocito tanto en el núcleo como en la morfología celular,

valorando también las transaminasas hepáticas, Aspargina aminotransferasa

(AST/TGO) y Alanina aminotrasferasa (AST/TGP) como parámetros de lesión

hepátocitica.

Se diseñó un estudio experimental prospectivo, aleatorizado y ciego.

73


Se utilizaron veinte ratas de la cepa wistar de entre 300 a 350 g, las

cuales recibieron cuidado, analgesia, anestesia y sacrificio, adhiriéndonos a las

recomendaciones del código de protección animal utilizadas en el Laboratorio de

Cirugía Experimental.

La inducción anestésica se realizó con clorhidrato de ketamina (60

mg/kg) y clorhidrato de xilazina (7.5 mg/kg), por vía intramuscular.

De los 20 animales, de manera randomizada, a 10 de ellos se le

administró simvastatina conformando dos grupos:

Grupo A (control): se realizó una laparotomía mediana, identificación del

pedículo hepático y posterior clampeo de la arteria hepática, vena porta y vía

biliar por 30 minutos, mediante el uso de un clamp vascular atraumático con

posterior declampeo y reperfusión por 24 horas.

Grupo B (simvastatina): se realizó el mismo procedimiento que en el

grupo A, salvo que este grupo recibió 10 mg-kg de simvastatina por día disuelta

en 2 cc de suero fisiológico vía oral mediante sonda orogástrica, durante 3 días

previos a la cirugía.

Todos los animales tenían acceso libre a comida y agua, previo y

posterior a la cirugía.

73


A las 24 horas se sacrificó a los animales de los 2 grupos, se procedió a

la exéresis del hígado para su posterior estudio histológico y extracción de

sangre de la vena cava inferior para realizar enzimograma hepático, para estudio

de las variables TGO y TGP.

Se utilizó hematoxilina y eosina para teñir los preparados, se

seleccionaron los lóbulos hepáticos medios izquierdos para hacer los estudios

histológicos, tanto en el grupo A como en el B.

Conservamos las piezas histológicas en formol al 10 % para su posterior

análisis anatomopatológico.

De los lóbulos hepáticos estudiados se seccionó el área central para

realizar los cortes histológicos.

Seleccionamos siempre el mismo cuadrante dentro de la lámina con el

preparado histológico y dentro de este cuadrante se seleccionó siempre como

reper una vena centrolobulillar, así se procedió a cuantificar el número de

hepatocitos alterados.


alteraciones citoplasmáticas y alteraciones de la histoarquitectura.

Los cambios valorados fueron los mismos que para publicaciones

anteriores.

Se utilizo el mismo score histológico utilizado en trabajos anteriores.

73


En cuanto a los resultados pudimos apreciar:

En el Grupo A (control):

El estudio anatomopatológico demostró que el promedio de las lesiones

hepatocíticas para núcleo, citoplasma y citoarquitectura en este grupo fueron de

moderadas a severas.

En el Grupo B (simvastatina):

El estudio anatomopatológico demostró que el promedio de las lesiones

hepatocíticas para núcleo, citoplasma y citoarquitectura en este grupo fueron de

leves a moderadas.

En el análisis estadístico en las variables discretas como las relacionadas

a la histología: (histoarquitectura, núcleo y citoplasma); se utilizo el test de Mann

– Whitney.

Para las variables cuantitativas continuas TGP y TGO se utilizo el test de

T de Student para comparación de medias en muestras independientes. En

ambos casos se trabajo para un umbral de significación estadística, p = 0.05.

Se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre ambos

grupos:

73


Variable histoarquitectura, valor p = 0.002.

Variable núcleo, valor p = 0.001.

Variable citoplasma, valor p = 0.002.

Variable TGP:

El promedio de las lesiones fue menor para el grupo B (Simvastatina).

Encontrándose significancía estadística entre ambos grupos, valor p = 0.039.

Variable TGO:

El promedio de las lesiones fue menor para el grupo B (Simvastatina).

Encontrándose significancía estadística entre ambos grupos, valor p = 0.044.

Se utilizaron ratas de sexo masculino y de similar peso para

homogeneizar la muestra. Fueron aleatorizadas previa a la inclusión en cada

uno de los grupos para evitar el efecto laboratorio.

Valoramos el efecto de la simvastatina a las 24 horas de reperfusión

hepática, ya que según los diferentes estudios, en ese plazo la LIR se encuentra

establecida (3, 11 ,14 ,15).

Analizamos y describimos diferentes variables como la lesión a nivel del

núcleo, citoplasma e histoarquitectura, encontrando menor lesión en cada una

73


de ellas en el grupo tratado con simvastatina en comparación con el grupo sin

tratamiento, algo poco detallado en trabajos previos (9, 11, 12, 14, 98).

Sumamos a este análisis histológico el apoyo de un estudio humoral

como el enzimograma hepático valorando la TGO y TGP como parámetros de

lesión hepátocitica, encontrando también diferencias significativas a favor del

grupo tratado.

El interés de nuestro trabajo radica en que durante cirugías hepáticas es

frecuente el uso de la maniobra de Pringle, o sea el clampeo del pediculo

hepático y portal para evitar la perdida sanguínea, con el riesgo de LIR hepática

(16).

Concluimos que la administración de simvastatina vía oral por 3 días en

ratas, previo a una isquemia hepática de 30 minutos y reperfusión de 24 horas,

disminuye las lesiones hepatocíticas histopatológicas (a nivel nuclear,

citoplasmático e histoarquitectural) y los valores de TGO y TGP como expresión

de lesión hepátocitica.

73


POSCONDICINAMIENTO ISQUEMICO

En el año 2011, luego de haber estudiado la efecto preacondicionamiento

isquémico y de la simvastatina a nivel de la lesión por isquemia reperfusión

hepática a nivel experimental, nos propusimos estudiar el poscondicionamiento

isquémico como protector frente a la lesión por isquemia reperfusión hepática;

dado que existe poca bibliografía de su valor a nivel hepático y en publicaciones

existentes se proponen diferentes secuencias de salvas de isquemia, no

existiendo consenso en cual es la más efectiva de ellas .

El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto protector

postacondicionamiento utilizando una estrategia diferente, basada en diferentes

secuencias de reperfusión isquemia, comparándolas entre ellas. Trabajo

presentado en el forum de investigación del año 2011 del Congreso Argentino de

Cirugía.

Diseñamos un estudio experimental prospectivo, aleatorizado y pareado.

Se utilizaron 24 ratas machos, de la cepa wistar, de la misma edad y

peso (300-350 gr), las cuales recibieron cuidado, analgesia, anestesia y

sacrificio, adhiriéndonos a las recomendaciones del código de protección animal

utilizadas en el Laboratorio de Cirugía Experimental y la CHEA (Comisión

Honoraria de Experimentación Animal).

73


A todos los animales se les realizó laparotomía mediana, se identificó el

pedículo hepático y sus ramas y se efectuó 1 hora de isquemia clampeando la

arteria hepática la vena porta y la vía biliar.

De manera aleatorizada, por protocolo marcado, se dividió a los animales

en 4 grupos: A, B, C, D de acuerdo a la secuencia de postacondicionamiento

aplicada.

Al grupo A ( n 6) se le realizó 5 ciclos de isquemia reperfusión ( total 50

s); constando cada ciclo de 10 segundos, divididos estos en 5 segundos de

isquemia y 5 segundos de reperfusión.

Al grupo B (n 6) se le realizó 3 ciclos que fueron disminuyendo en forma

progresiva su tiempo de isquemia reperfusión; 20 segundos de isquemia, 20

segundos de reperfusión, 10 segundos de isquemia, 10 segundos de

reperfusión, 5 segundos de isquemia, 5 segundos de reperfusión (modelo

original propuesto por los autores en este trabajo).

Al grupo D (n 6) se les realizó un postacondicionamiento de; 3 ciclos de 1

minuto (total 3min); constando cada ciclo de 30 segundos de isquemia y 30

segundos de reperfusión.

73


En el grupo C (n 6), grupo control, no se llevó a cabo el post

acondicionamiento. Solo 1 hora de isquemia hepática y 24 horas de reperfusión.

Se reperfundieron los hígados de todos los grupos al declampear el

pediculo hepático por 24 horas.

Todos los animales tenían acceso libre a comida y agua, previo y

posterior a la cirugía.

A las 24 horas se sacrificó a los animales de todos los grupos, se

procedió a realizar una hepatectomía, para su posterior estudio histológico y

extracción de sangre de la vena cava inferior para realizar enzimograma

hepático, para estudio de las variables TGO y TGP.

Se utilizó hematoxilina y eosina para teñir los preparados, se

seleccionaron los lóbulos hepáticos medios izquierdos para hacer los estudios

histológicos.

Conservamos las piezas histológicas en formol al 10 % para su posterior

análisis anatomopatológico.


alteraciones citoplasmáticas y alteraciones de la histoarquitectura, al igual que

en los trabajos previos.

73


En el caso de las variables medidas con un score ordinal como ser

Histología, Citoplasma y Núcleo se realizó una distribución de frecuencias y un

contraste por test exacto de Fischer.

Para las variables continuas TGO y TGP el análisis para la media de cada

grupo fue realizado con el test de T para muestras independientes.

En todos los casos el umbral estadístico de significación fue de α = 0.05.

Gráfico de barras para la variable Histología (grado de lesión-frecuencia

relativa) según grupo en estudio:

73


Se observaron diferencias estadísticamente significativas para cada uno

de los grupos en estudio versus el grupo control:

A, p = 0.002

B y D, p = 0.036

Entre el grupo A y los restantes grupos, valor p = 0.030

No se establecieron diferencias para la variable histología entre los

grupos B y D, valor p = 0.727.

Gráfico de barras para la variable Citoplasma (grado de lesión-frecuencia

relativa) según grupo en estudio:

73


Respecto al grupo control, únicamente el grupo A presentó diferencias

significativas, p = 0.011. No siendo observadas dichas diferencias en el caso de

los grupos B y D, p = 0.065 (en ambos casos).

En el caso del grupo A versus los grupos B y D, no fueron observadas

diferencias estadísticamente significativas, p = 0.343. Tampoco fue establecida

una diferencia entre el grupo B y el D, p = 1.000

Gráfico de barras para la variable núcleo (lesión –frecuencia relativa)

según grupo en estudio.

Respecto al grupo control, se observaron diferencias estadísticamente

significativas de todos los grupos en estudio: grupo A, p = 0.018; grupo B, p =

0.043 y D, p = 0.036.

73


En el caso del grupo A versus los grupos B y D, no fueron observadas

diferencias estadísticamente significativas, respecto a B se obtuvo un p = 0.121

y con D se obtuvo un p = 0.284.

Tampoco fue establecida una diferencia entre el grupo B y el D, p = 0.500.

En el caso de la variable TGO, 2 grupos presentaron diferencias

estadísticamente significativas en relación al grupo control; grupo A: p = 0.002 y

grupo B: p = 0.012. Para el grupo D no fueron observadas diferencias;

p = 0.136.

Tampoco fueron observadas diferencias estadísticamente significativas

entre los grupos:

Grupo A vs. Grupo B; p = 0.797.

Grupo A vs. Grupo D; p = 0.382

Grupo B vs. Grupo D; p = 0.523

En el caso de la variable TGP, todos los grupos presentaron diferencias

estadísticamente significativas en relación al grupo control; grupo A: p = 0.001,

grupo B: p = 0.015 y grupo D: p = 0.034.

Nos propusimos trabajar en la fase tardía de la isquemia reperfusión,

donde conocemos que aun es un problema la aparición de lesión hepática a

nivel clínico (5, 73, 79, 80, 81, 86, 103, 104, 105, 110).

73


Comparamos diferentes secuencias de postacondicionamiento aceptadas

y estudiadas en publicaciones anteriores, valorando la histología y la lesión a

nivel humoral (106, 107, 108, 109, 110, 119).

Propusimos una secuencia de postacondicionamiento (grupo B), con un

declampeo progresivo, no comentada en publicaciones anteriores por otros

autores, comparando esta con las secuencias estudiadas por otros autores.

Analizamos y describimos diferentes variables como la lesión a nivel del

núcleo, citoplasma e histoarquitectura, algo poco detallado en trabajos previos

(4, 5, 84, 87, 97, 100, 105, 101, 106).

Encontramos diferencias significativas entre las diferentes series de

postacondicionamiento hepático.

Sumamos a este análisis histológico el apoyo de un estudio humoral

como el enzimograma hepático valorando la TGO y TGP como parámetros de

lesión hepátocitica.

Concluimos que luego de una hora de isquemia hepática y reperfusión de

24 horas en ratas.

73


1: Un postcondicionamiento con una secuencia de 5 segundos de

isquemia y 5 de reperfusión repetidos 5 veces, disminuye los daños histológicos

y a nivel del enzimograma hepático.

2: Un postcondicionamiento con una secuencia de declampeo progresivo

de 20 ,10 y 5 segundos respectivamente, disminuye los daños histologicos a

nivel nuclear e histoarquitectural y a nivel del enzimograma hepático.

3: Un postcondicionamiento con una secuencia de 30 segundos de

isquemia y 30 de reperfusion repetido 3 veces disminuye los daños solo a nivel

histoarquitectural y a nivel del enzimograma hepático solo disminuyendo el valor

de TGP.

73


PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO VS PREACONDICIONAMIENTO

FARMACOLOGICO CON SIMVASTATINA.

Durante el año 2010 luego de haber estudiado el valor de la simvastatina

y el preacondicionamiento isquémico en la lesion isquemia reperfusión hepática,

nos propusimos comparar estas dos estrategias de protección hepática.

Motivados por los resultados en trabajos anteriores y por encontrar

escasa bibliografía que compare estas dos estrategias. Trabajo presentado en el

congreso Uruguayo de Cirugía del año 2010.

El objetivo del trabajo fue comparar el efecto de la Simvastatina con el

del preacondicionamiento isquémico hepático mediante una lesión por isquemia


Diseñamos un estudio experimental prospectivo, aleatorizado y pareado.

Se utilizaron 24 ratas de la cepa wistar de entre 300 a 350 g.

De manera aleatoria se dividió a los animales en 3 grupos de 8 ratas cada uno

A, B y C.

Grupo A: Durante 3 días previos a la cirugía recibió 10 mg-kg de

simvastatina por día disuelta en 2 cc de suero fisiológico vía oral mediante sonda

orogástrica.

73


Se le realizó una laparotomía mediana, identificación del pedículo

hepático y posterior clampeo de la arteria hepática, vena porta y vía biliar por 30

minutos, usando un clamp vascular atraumático con posterior declampeo y

reperfusión por 24 horas (65,73, 106,107).

Grupo B: Durante 3 días previos a la cirugía recibió 2 cc de suero

fisiológico vía oral mediante sonda orogástrica. Se le realizó una laparotomía

mediana, identificación del pedículo hepático y posteriormente se realizó

preacondicionamiento de 5 minutos de isquemia y 5 minutos de reperfusión

hepática mediante la colocación de un clamp vascular en el pedículo hepático.

Luego provocamos treinta minutos de isquemia total del hígado de igual

manera que en el grupo A. Finalmente se le realizó una reperfusión de 24 horas.

Grupo C: Recibió 2 cc de suero fisiológico vía oral mediante sonda

orogástrica, durante 3 días previos a la cirugía. Se le realizó una laparotomía

mediana, identificación del pedículo hepático y posteriormente se realizó una

isquemia hepática de 30 minutos de igual manera que en grupo A y B.

Finalmente se le realizó una reperfusión de 24 horas. Todos los animales se

sacrificaron, se realizó la hepatectomia y extracción de sangre de la vena cava

inferior para realizar enzimograma hepático, para estudio de las variables TGO y

TGP.

Se seleccionaron los lóbulos hepáticos medios izquierdos para hacer los

estudios histológicos, en los 3 grupos.

73


Se midieron tres variables de lesión del hepatocito las mismas que se

midieron en trabajos anteriores: alteración nuclear (morfología alterada con


desorganizada), alteraciones citoplasmáticas (la vacuolización, hiperclaridad y

balonamiento), y alteraciones de la histoarquitectura (la desorganización

perivena centrolobulillar). Se utilizaron 2 criterios de juzgamiento; las

alteraciones histológicas encontradas en el hepatocito y también las

transaminasas hepáticas, Asparginaaminotransferasa (TGO) y

Alaninaaminotrasferasa (TGP) como parámetros de lesión hepatocítica. Cada

una de las variables histológicas (núcleo, citoplasma e histoarquitectura) fue

medida independientemente utilizando un score histológico, con lesiones leves,

moderadas y severas.

　

En cuanto a los resultados, respecto a las variables histológicas (Núcleo,

Citoplasma, Histoarquitectura):

En el Grupo A: las alteraciones nucleares fueron leves en 4 animales,

moderadas en 3 y severas solo en 1. Las alteraciones citoplasmáticas fueron

leves en 3 animales, moderadas en 4 y severas solo en 1. Las alteraciones

histoarquitecturales fueron leves en 5 animales y moderadas en 3, no hubo

lesiones severas.

73


En el Grupo B: Las alteraciones nucleares fueron leves para 2 animales,

moderadas en 3 y severa en 3. Las alteraciones citoplasmáticas fueron

moderadas en 5 y severas en 3 animales y no hubo lesiones leves. Las

alteraciones histoarquitecturales fueron leves en un animal, moderadas en 5 y

severas en 2.

Grupo C: Las alteraciones nucleares, citoplasmáticas e histoarquiturales

fueron moderadas en 1 animal, severa en 7 y no hubo lesiones leves, para cada

una de las variables.

Se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los 3

grupos valorados en relación a las lesiones del núcleo valor p = 0.009,

citoplasmáticas p = 0.006, histoarquitectura p = 0.001. Para variables discretas

relacionadas a alteraciones nucleares, citoplasmáticas e histoarquitectura se

utilizó test de Kruskal– Wallis. En todos los casos, se fijó un umbral de

significación estadística, α = 0.05.

En el caso de las variables cuantitativas continuas como TGP y TGO se

realizó análisis de varianzas (ANOVA). Para el análisis de estas variables (TGO

y TGP) se realizó un análisis estadístico que comparó el valor de las medias en

cada grupo.

Variable TGP:

Grupo A (Simvastatina): El valor de la media fue 159.8.

73


Grupo B (preacondicionamiento): El valor de la media fue 478.1.

Grupo C (control): El valor de la media fue 1136.5. Se observaron

diferencias estadísticamente significativas para los grupos en estudio p = 0.002.

Variable TGO:

Grupo A (Simvastatina): El valor de la media fue 626.5 .

Grupo B (preacondicionamiento): El valor de media fue 575.9.

Grupo C (control): El valor de la media fue media fue 1001.1.

Se observaron diferencias estadísticamente significativas para los grupos

en estudio, p = 0.008.

Estudiamos los beneficios del preacondicionamiento isquémico como una

estrategia de protección del hepatocítico frente episodios de isquemia

reperfusión .Así como los efectos protectores de las estatinas (simvastatina)

frente a la LIR hepática (4. 6, 83). Es así que nos propusimos comparar dos

formas de protección hepática frente a la LIR la quirúrgica (PI) y la farmacológica

(simvastatina). Seleccionamos la dosis de Simvastatina, el tiempo de PI y de

reperfusión en base a otras comunicaciones (4, 12, 14, 84, 86, 87, 89, 90, 93,

95, 99, 120).

Encontramos menor lesión histológica en cada una de ellas en el grupo

tratado con simvastatina que el tratado con PI y menor lesión en estos últimos

comparándolos con el grupo Control. Analizamos la TGO y TGP como

parámetros de lesión hepatocítica, encontrando también diferencias

73


significativas a favor del grupo de PI y Simvastatina con respecto al control.

Comparamos así dos estrategias de protección una quirúrgica (PI) y otra

farmacológica (Simvastatina) encontrando diferencias significativas entre ambas.

Las conclusiones fueron que luego de una LIR hepática de 30 minutos de

isquemia y 24 horas de reperfusión en ratas:

1: La administración en el preoperatorio de Simvastatina vía oral por 3

días, determinó una reducción significativa de la lesión morfoestructural y de los

parámetros humorales de lesión hepatocítica.

2: Un preacondicionamiento de 5 minutos de isquemia hepática y 5

minutos de reperfusión determinó una reducción significativa de la lesión

morfoestructural y de los parámetros humorales de lesión hepatocítica.

3: La administración en el preoperatorio de Simvastatina vía oral por 3

días, determinó una reducción de la lesión morfoestructural significativamente

mayor que el preacondicionamiento isquémico hepático.

EXPERIENCIA A NIVEL NACIONAL:

Se realizo búsqueda bibliográfica respecto del tema de la presentación a

nivel nacional; en la biblioteca de Facultad de Medicina y en la Biblioteca de la

Sociedad de Cirugía Uruguaya. Realizándose también búsqueda en internet.

No pudiendo encontrar publicaciones sobre el tema especifico tratado en

nuestro trabajo.

73


CONCLUSIONES

Existe un interés creciente en desarrollar y comprender los diferentes

mecanismos lesivos involucrados en la lesión por isquemia reperfusión hepática

(LIR), con la finalidad de generar y desarrollar diferentes estrategias de

protección hepática frente a esta lesión.

El preacondicionamiento isquémico es una de las estrategias más

novedosas para la protección frente a la LIR hepática, logrando sobre todo una

relación costo-beneficio adecuada para nuestro medio.

La aplicación del preacondicionamiento isquémico a nivel hepático

constituye una estrategia relativamente nueva, por lo que existen pocas

publicaciones, casi todas experimentales.

73


Nuestros resultados con esta estrategia son alentadores, y coinciden con

algunas de las publicaciones anteriores. Se trata de un método simple,

realizado por el cirujano, que no prolonga demasiado los tiempos quirúrgicos y

que además puede ser combinado con otros métodos para mejorar los

resultados.

Los beneficios de esta estrategia se basan en la protección frente a la

lesión por isquemia y además a la lesión por reperfusión.

Sus mecanismos de acción, son intrincados y complejos. Quedando hoy

en día por dilucidar varios de ellos.

En publicaciones recientes se ha valorado los beneficios de las estatinas

como protector de la lesión por isquemia reperfusión (LIR) hepática.

Comunicaciones previas indican que la Simvastatina podría disminuir la

LIR hepática en diferentes órganos incluido el hígado, no conociendo aun en

forma detallada los mecanismos por los cuales se produce dicho beneficio.

Nuestros resultados valorando la Simvastatina para la protección frente a

ésta lesión fueron alentadores, disminuyendo las lesiones a nivel

histoarquitectural y a nivel humoral disminuyendo los valores de las

transaminasas hepáticas, como marcadores de lesion hepátocitica. Lo que

alienta a continuar realizando nuevos estudios a nivel experimental con el fin de

seguir valorando el beneficio de la Simvastatina y otros fármacos

hepatoprotectores o sus combinaciones como estrategia de protección hepática.

73


Trabajos realizados en nuestro Departamento, han podido demostrar a

nivel experimental que el preacondicionamiento farmacológico con Simvastatina

a tenido mejores resultados que el preacondicionamiento isquémico en las

disminución de las lesiones hepatocíticas.

Al estudiar el valor del poscondicionamiento isquémico frente a la LIR

hepática, el mismo ha demostrado beneficios al disminuir las lesiones

hapatocíticas, coincidiendo con comunicaciones previas.

Si bien sabemos que sus mecanismos de protección comparte muchas de

las vías del preacondicionamiento isquémico, esto aun no esta del todo

aclarado. Y son necesarios nuevos estudios para definir el nivel de protección de

esta estrategia.

Nuestros resultados son optimistas para seguir desarrollando estrategias

de protección hepática, siendo fundamental su valor en la aplicación cínica, así

como en la realización de ensayos clínicos prospectivos aleatorizados que

definan el nivel de evidencia científica.

Todo esto genera un amplio campo de investigación, sobre todo con la

finalidad de lograr entender los mecanismos de acción del preacondicionamiento

isquémico, farmacológico y poscondicionamiento hepático. Nuestros objetivos

futuros están dirigidos a estudiar las alteraciones y modificaciones a nivel

73


molecular generadas por estas estrategias de protección. Se pretende continuar

además investigando sobre el preacondicionamiento isquémico y farmacológico

y también sobre el poscondicionamiento para esclarecer su rol en la prevención

de las complicaciones tardías.

BIBLIOGRFÍA

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