NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TẾ BÀO GỐC

TỪ TỦY XƯƠNG ĐIỀU TRỊ BỆNH LÝ XƯƠNG

Huỳnh Duy ThảoBm Mô – Phôi – Di truyềnthao_huynhduy@pnt.edu.vn

NỘI DUNG

ĐẶT VẤN ĐỀ1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU2

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3

KẾT QUẢ4

HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO5

ĐẶT VẤN ĐỀ

+ Mô xương => tự lành vết thương [1]

+ Với những khuyết hỗng xương lớn => mô không thể tự chữa lành nếu không có sự can thiệp [2]

+ Vật liệu ghép thay xương:

– Ghép xương tự thân: “tiêu chuẩn vàng” [3]

– Ghép xương đồng loại

– Ghép xương dị loại

=> Những loại mô ghép trên có một số “hạn chế”

ĐẶT VẤN ĐỀ

+ Xương tự thân => Hạn chế số lượng, gây tổn thương

+ Xương ghép đồng loại => Hạn chế số lượng, “nguy cơ” truyền nhiễm bệnh: HIV, HBV, HCV, VDRL …

+ Xương dị loại => Dồi giàu nhưng nguy cơ truyền

nhiễm những “protein lạ” không kiểm soát được, yếu

tố tâm linh …

=> NHU CẦU TÌM NGUỒN THAY THẾ

ĐẶT VẤN ĐỀ

MẮC QUÁ VẬY TRỜI

VẬT LIỆU GHÉP THAYXƯƠNG

– Kim loại (Titanium, Vitallium, Aluminium …)

– Calcium photphate (TCP và HA)

– Thủy tinh sinh học (gốm sứ)– Polymer tổng hợp

(Polyhydroxyethyl methacrylate, Polythylen ...)

?

ĐÁP ỨNG NHU CẦU THỰC TẾ

KHÔNG CÓ XƯƠNG GHÉP

Đ t o m t m nh ghép thay ể ạ ộ ảx ng hi u qu c n có:ươ ệ ả ầ - T bào (nguyên bào x ng)ế ươ - Giá th (khung x ng)ể ươ

ĐẶT VẤN ĐỀ

TẾ BÀO GỐC

TỰ ĐỔI MỚI

BIỆT HÓA

TẾ BÀO KHÁC

TẾ BÀO MỠ

TẾ BÀO XƯƠNG

NGUỒN

TẾ BÀO

RĂNG

MẠCH MÁU

GAN

TỦY XƯƠNG

NGUỒN THU NHẬN TẾ BÀO GỐC TRƯỞNG THÀNH

NÃO

DA

TUYẾN TIÊU HÓA

MÔ CƠ

MÁU NGOẠI VI

MÔ CƠ TIM

TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ

MÔ MỠ

THẦN KINH TIM

MẠCH MÁU

THẬN

CƠ

TỦY XƯƠNGMÁU NGOẠI VI

XƯƠNG

MỠ

SỤN

TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ

MẢNH GHÉP

NUÔI CẤY (IN VITRO)

CẤY GHÉP

VẤN ĐỀ TỒN TẠI ?

=> TẾ BÀO PHÂN TÁN

ĐẶT VẤN ĐỀ

Giá thể - Porites lutea

Porites lutea - Đã được sử dụng để ghép thay xương - Làm giá thể để nuôi cấy tế bào

ĐẶT VẤN ĐỀ

CÔNG NGHỆ MÔ XƯƠNG

XƯƠNG GHÉP NHÂN TẠO

Tế bào gốc trung mô (nguyên bào xương)

MẢNH GHÉP THAY XƯƠNG

CÔNG NGHỆ MÔ XƯƠNG

San hô Porites lutea

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

TẠO MẢNH GHÉP THAY XƯƠNG VỚI SỰ KẾT HỢP CỦA:

- San hô (Porites lutea)

- Tế bào gốc trung mô từ tủy xương

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

• Thiết kế nghiên cứu : Thí nghiệm thực nghiệm - mô tả

• Đối tượng nghiên cứu : - Tủy xương người thu nhận trong điều kiện phòng mổ

- Porites lutea: Phòng thí nghiệm Vật liệu Sinh học

Bộ môn Mô – Phôi Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch

QUY TRÌNH NGHIÊN CỨUPhân lập và nuôi cấy tế bào gốc trung mô

Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành nguyên bào xương

Chuyển tế bào gốc trung mô lên giá thể san hô

Tạo ra mảnh ghép

PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỦY XƯƠNG NGƯỜI

Tủy xương

Tủy xương

Ficoll-paque

Tế bào đơn nhân

Nuôi trong DMEM/F12, 10% FBS, kháng sinh, ủ ở 370C, 5% CO2.

NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ

C(C). Tế bào sau 1 tuần nuôi cấy, đạt được mật độ cấy chuyền (10X)

A(A). Tế bào sau 3 ngày

nuôi cấy (10X)

B(B). Tế bào sau 5

ngày nuôi cấy (10X)

ĐỊNH DANH TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ

ĐẶC TÍNH BÁM DÍNH

Hình thái tế bào gốc thu nhận từ tủy xương trong quá trình nuôi cấy in vitro. (A). Tế bào sau 7 ngày nuôi cấy được chụp dưới kính hiển vi đảo ngược (20X). (B). Tế bào sau 7 ngày nuôi cấy (20X được nhuộm Giemsa và chụp hình dưới kính hiển vi đảo ngược.

A B

TIỀM NĂNG BIỆT HÓA

Biệt hóa mỡ(nhuộm Oli Red O)

Biệt hóa xương(nhuộm Alkaline phosphatase)

Biệt hóa sụn(nhuộm Alcian Blue)

Tế bào gốc(tủy xương)

Biệt hóa in vitro

TIỀM NĂNG BIỆT HÓA TẠO XƯƠNG

TIỀM NĂNG BIỆT HÓA TẠO MỠ

TIỀM NĂNG BIỆT HÓA TẠO MỠ

TIỀM NĂNG BIỆT HÓA TẠO SỤN

Nhuộm Alcian Blue để xác định chất nền sụn

BIỂU HIỆN MARKER BỀ MẶT

Tế bào gốc(tủy xương)

Flow Cytometry

ĐÁNH GIÁ BỘ NST ĐỒ CỦA TẾ BÀO SAU NUÔI CẤY

(A). Bộ nhiễm sắc thể đồ tế bào gốc trung mô trước khi biệt hóa.

(B). Bộ nhiễm sắc thể đồ của nguyên bào xương.

San hô Porites lutea

San hô Porites lutea

TẠO MẢNH GHÉP

Tế bào gốc(tủy xương)

Chuyển tế bào lên san hô

ĐÁNH GIÁ:- Đặc tính bám dính- Tiềm năng biệt hóa- Khả năng tăng trưởng

Nhuộm Alkaline phosphatase

Nhuộm Giemsa Nhuộm H&E

Bám dính Tăng trưởngBiệt hóa

Control

A

C D

B

ĐÁNH GIÁ MẢNH GHÉP TRÊN MÔ HÌNH THỎ

A B C

NUÔI CẤY IN VITRO

B

ĐÁNH GIÁ CFU-Fs

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG

A

C D

B

TIỀM NĂNG BIỆT HÓA TẠO XƯƠNG

Nhuộm Alkaline phosphatase

Nhuộm Von kossa Nhuộm Alirazin Red

A CB

ĐÁNH GIÁ CẤU TRÚC MẢNH GHÉP

Nhuộm Giemsa Nhuộm H-SG Nhuộm H-SG

A CB

ĐÁNH GIÁ CẤU TRÚC MẢNH GHÉP

Nhuộm Alkaline phosphatase Chụp SEM bề mặt

K T QU NGHIÊN C UẾ Ả Ứ

PHẪU THUẬT GHÉP MẢNH GHÉP XƯƠNG CÔNG NGHỆ

A

E F

C

D

B

A B C

E F G

D

H

MẢNH GHÉP TỒN TẠI 1 THÁNG

A B C

D E F

MẢNH GHÉP TỒN TẠI 3 THÁNG

A B C

D E F

MẢNH GHÉP TỒN TẠI 6 THÁNG

K T QU NGHIÊN C UẾ Ả ỨTRÊN LÂM SÀNG

THỬ NGHIỆM MẢNH GHÉP TRÊN HOẠI TỬ CHỎM XƯƠNG ĐÙI

Bệnh nhân bị hoại tử vô trùng chỏm xương đùi 2 bên ARCO 2

KẾT QUẢ GHÉP TRÊN BỆNH LÝ THOÁI HÓA CHỎM XƯƠNG ĐÙI

Phẫu thuật ghép mảnh ghép san hô có mang MSC tự thân

02 tháng sau ghép, biểu hiện trên lâm sàng bình thường

SAU PHẪU THUẬT SAU 2 THÁNG GHÉP

SO SÁNH KẾT QUẢ GHÉP

THỬ NGHIỆM MẢNH GHÉP TRÊN MẤT ĐOẠN XƯƠNG

06 tuần sau ghép, biểu hiện trên lâm sàng bình thường

THỬ NGHIỆM MẢNH GHÉP TRÊN MẤT ĐOẠN XƯƠNG

04 tháng sau ghép, biểu hiện trên lâm sàng bình thường

THỬ NGHIỆM MẢNH GHÉP TRÊN MẤT ĐOẠN XƯƠNG

03 tháng sau ghép, biểu hiện trên lâm sàng bình thường

GHÉP XƯƠNG KÉO DÀI CHI

GHÉP XƯƠNG KÉO DÀI CHI

CÂU CHUYỆN CỦA BẠN TÔI

KẾT LUẬN• Ghép mảnh ghép từ san hô và MSC tự thân là một

phương thức điều trị đầy tiềm năng cho các

trường hợp tổn thương xương.

• Tiệm cận với công nghệ mô trên thế giới.

• Cần triển khai và nghiên cứu sâu để trở thành một

phương thức điều trị hiệu quả cho người bệnh