Thibault Vha Vhe Virus Et Marqueurs (1)

V.Thibault DU_janv.-09

Virus de l'hépatite A et EVirus et marqueurs diagnostiques

Vincent THIBAULTLaboratoire de Virologie

Groupe HospitalierPitié-Salpêtrière

Assistance Publique Hôpitaux de Paris


Hépatites virales

parentéral

non A, non BB1965 D

1977

A1972

féco-oral

mode de transmission préférentiel

F, G, TTV, autres…

C1990

E1991


Historique VHA “La Jaunisse” 1745 : Cockayne, hépatites épidémiques 1908 : McDonald, "notion de virus…"

Reproduction de la maladie 1942 : volontaires (Voegt, Havens), Paul 1943 ingestion feces/serum

Entité clinique : 17-18ème siècle - 1923 Blumer - 1947 McCallum (VHA "infectious"-VHB

"serum")

Visualisation : 1973 (Feinstone) Développement de la sérologie : épidémiologie 1979 : culture (Provost et Hilleman) 1981... : Clonage, Séquences nucléotidiques

1991…: Vaccination 2006 : Déclaration obligatoire


Virus de l'hépatite A


Virus de l’Hépatite A

ARN (+)

Vpg

Capside

27-32nm

• Famille : Picornaviridae (entérovirus type 72)

• Genre : hépatovirus• Taille 27-32 nm• Non enveloppé, • Structure icosaèdrique• ARN simple brin,

• polarité positive• lié de façon covalente à

une protéine Vpg


VP1VP3VP2VP4 2AProtéines de surface

immunogénicité

3D (POL)3C (PRO)2C2B1D1C1B 3A-B2A

P1 prot. Capside

Vpg2.5kDa

P2 P3

0 7478

1AAAA

Structurales Non structurales

IRESTraduction

3D (POL)3C (PRO)2C2BVP1VP3VP2

3A-B

VP4

2Apoly-

protéine2 227 AA

?

Liaison NTPHélicase

Vpg

Protéase

ARNPolymérase

RéplicationVP1VP3VP2VP4 2A

VP0

Maturation finale

X5 – X12


Cycle de multiplication du VHA en culture de cellules

P3

P2

P1

TraductionSynthèse

de la polyprotéine

+-

-

+

Réplication

Maturation

Libérationdu génome

Attachement

Relargage

Mem

bran

e ce

llulaire

Réticulum endoplasmique

Espace de Disse

Canaliculebiliaire

Empaquetage


VHA : physiopathologie

Absence d'effet cytopathique direct :cytolyse résultant du processus immun de défense de l'hôte,

médiation cellulairemédiation humorale


Agents Stabilité

ChaleurAutoclavage (121°C, 20')100°C60°Ctempérature ambiante

4°CCongelé

InactivationInactivationStable 1 heureStable 1 mois (selles, eaux, sols)Plusieurs jours sur surface sèche4 h. Sur les mainsStable plusieurs moisStable des mois ou années

Acide-base pH 1 : stable 5 h.PH 3-11 : stable au moins 30'

U.V. InactivationChimiques

Chlore, ozone,glutaraldéhyde, iode

Inactivation

Alcool 70° 3' : inactivation partielle

Propriétés Physiques du VHA


Variabilité génétique

Comparaison nucléotidique7 Génotypes : IA,B ; II; IIIA,B ; IV-VII

Homme : génotype I (90%), (III, II=VII)Singes : IV, V, VI

Sérotype uniqueNombre limité d'épitopes antigéniques VP1, VP3Tests immunologiquesVaccination (HM175, CR326)

virus inactivé cultivé sur MRC-5

3D (POL)3C (PRO)2C2B1D1C1B 3A-B2A

P1 prot. Capside

Vpg2.5kDa

P2 P3

0 7478

1AAAA

Structurales Non structurales


IV Nonhuman primate, Philippines V Nonhuman primate, KenyaVI Nonhuman primate, Indonesia

D'après Nainan et al. 2006Clin. Microb. Rev. ; 19:63-79

Génotypes et phylogénie

Phylogenetic analysis of 3,582 HAV isolatesin the VP1/P2B region (315-bp fragment).

VP1/P2AGénotypes : >15% variationsSous types : 7.5% variations


Répartition mondiale des génotypes

Génotypes infectant l'homme en noir , les singes en rouge. Souche PA21 (génotype IIIA), isolée d'un singe Panamanian Owl en vert.

Cristina J, Costa-Mattioli M. Virus Res. 2007 Aug;127(2):151-7.


VHA : épidémiologie

http://wwwn.cdc.gov/travel/image.ashx?i=255


Symptomes

Ictère

VHA : Paramètres Biologiques

Semaines

Ag foie

VHA Sang

VHA Selles

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 24

IgM

IgGprotection contre réinfection

Ac anti-VHA = hépatite A ancienne ou vaccinationIgM anti-VHA = hépatite aiguë A (clinique)


Marqueurs indirects (+++)(ELISA)

1- Sang : Marqueurs indirects IgM IgG

Génome viral (RT-PCR) 105 virions/mL sang

VHA : Marqueurs disponibles

3- Milieux : Génome viral (RT-PCR) Particules virales IEM

4- Foie : Ag viral à la surface des hépatocytes Génome viral : hybridation, RT-PCR

Marqueurs directs(plus spécialisé)

2- Selles : 109 virions/g selles Génome viral (RT-PCR) - épidémiologie Particules virales IEM - EIA

Salive : IgG (ELISA)Génome viral (RT-PCR)


IgM HAV uniquement à bon escient !

Alaska : test "réflexe" si Ig-VHA totales + Ig M HAV32 % de faux + (Castrodale CID 2005:41;e86)

Vaccination : 8 à 20 % d'IgM VHA + dans les 2 à 3 semaines suivant l'injection…

NE RECHERCHER L'IgM anti-VHA QU'EN CAS D'HEPATITE AIGUË

Roque Afonso et al. CID 2006:42 -887

82 %11 %1 %

Faux positifs


Diagnostic

Sérologie +++

IgM anti VHA : infection récente

IgG anti VHA : infection passée ou vaccination

IgM et IgG anti VHA

Diagnostic direct (-) [uniquement dans le cadre d'études]

Virémie : techniques sensibles (105 v./mL)

Recherche de virus dans les selles, prolongée, importante

(109v./mL), épidémiologie

Marqueurs biochimiques

Transaminases (ALAT, ASAT)BilirubinePhosphatase alcalineFacteurs de coagulation


Hépatite A : le vaccinvirus inactivé

AVAXIM 160U suspension injectable seringue préremplie Virus de l'hépatite A souche GBM cultivée sur cellules diploïdes humaines

MRC-5 , inactivé

HAVRIX 1 440 U Elisa/ml susp inj IM Ad en seringue HAVRIX 720 U Elisa/0,5 ml susp inj IM Enf/Nour en seringue

Souche HM 175 du virus de l'hépatite A cultivée sur cellules humaines diploïdes MRC5

Le schéma vaccinal habituel comprend 1 dose suivie d'un rappel (1 dose) 6 à 12 mois plus tard.

La persistance des anticorps anti-VHA après vaccination n'est actuellement pas connue . Les données disponibles suggèrent la persistance des anticorps anti-VHA à un niveau protecteur jusqu'à 10 ans (20 ans ?) après primo-immunisation.

Hepatitis A Vaccine versus Immune Globulin for Post-exposure ProphylaxisVictor et al. 2007 N Engl J Med 357;17


Difficultés diagnostiquesEn routine

·

Adresser prélèvementsau

Centre national de référence du VHA

Pr E DussaixLaboratoire de virologie

Hôpital Paul Brousse12-14 av Paul Vaillant Couturier

94804 Villejuif cedexTel : 01 45 59 37 21

http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste


Grippe aviaire ?

SRAS ?

Hépatite E ?Hépatite E ?


Historique VHE Découverte dépendante de la connaissance des virus des hépatites

1955 : Inde, hépatite chez des personnes immunisées contre le VHA, épidémie particulière. "NANBH"

Entité clinique 1980 - similitude avec l’hépatite A : Inde : prévalence de l’hépatite A importante Epidémie : autre virus des hépatites, contamination par l’eau

1983 : reproduction de l’hépatite non A-non B chez un volontaire immunisé contre VHA (Balayan), Hépatite à J36 J28-45, visualisation de particules virales > VHA (27-30nm) Reproduction de l’infection chez le singe (cynomolgus) Hépatite nonA-nonB à transmission entérique (ENANB)

1990 : Reyes et al. clonage et séquençage ➠ "VHE" 1991 : Tam et al. VHE 2000 : Panda et al. cDNA infectieux



VHE Virus non enveloppéSphérique (SRV)

Surface irrégulièreCapside 27-34 nm

Symétrie icosaédrique

ARN simple brinhélice droite

polarité +7,5kb

poly-A extrémité 3’

StabilitéAu laboratoire : instable(-70 à +8°C)

Décongélation/congélationTractus GI : stable (pH)

Famille : HepeviridaeGenre : Hepevirus


Organisation génomiqueNon structurales Structurales

28 5109 71245’ NC 3’NCPoly-A

ARN polarité + 7 200 nt

Protéinesimmunogènes DIAGNOSTIC

MeT Y Pro P X Hel RdRp

ORF3

ORF2

Génotypes 1-3

Hétérogénéité génétique Au moins 4 groupes majeurs (<20% hétérogénéité ORF2) subdivisés

en 24 sous groupes dont homologues animaux : Epitopes majeurs : parties C-ter de l’ORF3 et ORF2 Protection croisée entre différentes souches : un seul sérotype

Développement de tests sérologiques (performances équivalentes entre les différents types ?)

Vaccin : ORF 2 recombinante


Hétérogénéité génétique

Au moins 4 groupes majeurs (<20% hétérogénéité ORF2) subdivisés en 24 sous groupes dont homologues animaux :

I- Birmanie et certaines souches africaines et asiatiques

II- Mexique et certaines souches du Niger

III- Amérique, Italie, NZ, Autriche, Grèce, Argentine (+ souches porcines)

IV- Chine, Taiwan et Japon (plus sévère que III ?)

Epitopes majeurs : parties C-ter de l’ORF3 et ORF2 Connaissances limitées sur l’immunité contre les Ag natifs

Parties structurales variables

Grande homologie des parties non structurales

Protection croisée entre différentes souches : un seul sérotype Développement de tests sérologiques (performances équivalentes entre

les différents types ?)

Vaccin : ORF 2 recombinante


301 nt 5' end of ORF2 sequences from 275 HEV strains,

1 2

3

4

1a

1b

1c

1e1d

0.05

4d

4c

4b

4a

4e3f

3e3c

3d3b

3a

D'après Lu et al. Rev. Med. Virol. 2006;16:5-36

Inde, Népal, Birmanie, Japon, Espagne

Chine, Pakistan, Bengladesh

Chine, Inde, Nepal, Russie

Maroc, Algérie

Algérie, Namibie, Afrique C.

Mexico, Nigeria

US, Japon, Corée, NL + porc

Japon+ porc

NL (porc)Taiwan (porc)

France, UK, Japon, Espagne + porc

Espagne, UK, Grèce, NL, Japon + porc

Chine, Taiwan

Chine, TaiwanJapon, Vietnam

Chine (porc)

Inde (porc)

Génotype < 20% hétérogénéité ORF2


Similarités des souches humaines et

animalesBorgen et al. BMC Infectious Diseases

2008, 8:61

Genetic relatedness between HEV strains from human and non-human sources and from various countries.Minimal spanning trees of 81 sequences of 148 nucleotides HEV RNA showing genetic distances between genotype 3 HEVstrains from humans and animals. Dutch cases are marked with ID numbers inside the colored circles.



Culture et Modèles animaux

• Culture Difficile Culture primaire d’hépatocytes de macaques (cynomolgus) Cellules PLC/PRF/5 hépatocarcinome (Tanaka et al. J. Gen Virol. 2007)

Cellule embryonnaire

• Modèles animaux Primates : reproduction de la pathologie humaine Volontaires... VHE du porc, du poulet Présence d’Ac chez poulet, porc, rat, souris, mouton...


HEV – virémie- transmission

Matsubayashi K, et al. Transfusion. 2008 Jul;48(7):1368-75.

serum

salive

selle

IgG

IgM

Concentré de plaquettes à J0 Transfusé à un homme de 64 ans traité pour Lymphome non-Hodgkinien par GM autologue


Symptomes

Ictère

VHE : Paramètres Biologiques

Jours

VHE Sang

VHE Selles

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 200

IgM

IgG

Titre peu élevéprotection contre réinfection ?


Marqueurs non biologiques

circonstances de la maladie (voyage, autres causes, épidémie)

A adapter en fonction de la zone géographique ? (Sud versus Nord ?)

clinique : hépatite “classique”, absence de chronicité (chez

l'immunocompétent ! )

Absence de marqueurs biologiques : diagnostic d'exclusion

Absence des marqueurs des virus des autres hépatites (A, B, C, D)

Notions sérologiques pour d’autres virus (EBV, CMV, herpès)

Marqueurs sérologiques spécifiques

IgM anti-HEV

IgG anti-HEV (+++)

RT-PCR : détection du génome viral (sang, selles)

Stratégie Diagnostique


Spécificité et Sensibilité des ELISAs

Epidémie Indonésie, 82 symptomatiques; 174 asymptomatiques; 496 contrôles

Comparaison de 5 tests sérologiquesRéférence = RT-PCRConcordance IgM : 81%Concordance IgG : 85%

Myint et al. JCM, 2006, p. 1581–1583


Performance des tests

MicroplaqueAdaltis

MicroplaqueMP Diagnostics

941644545Total (n=50)544545Negatif (n=9)437239140Positif (n=41)

négatifpositifnégatifpositifnégatifpositif

Test rapideMP Diagnostics

IgM anti-HEV

anti-HEV IgG

97.810010082Test rapide

MP Diagnostics

98.595.799.588Microplaque

MP Diagnostics

98.810010090Microplaque

Adaltis

Spécificité%

Sensibilité%

VPN %

VPP%

J. IzopetComm. Pers. CVV 2008

Panels50 sérums ARN HEV (+), G3406 sérums IgG ARN HEV (-)


Stratégie DiagnostiqueSe donner les moyens de faire le diagnostic

--+Immunité ancienne

--+++Douteux

+-- ou +Probable

+++++Certain

RT-PCRIgMIgGDiagnostic

Diagnostic DirectRecherche du génome sur prélèvements sang et selles

Diagnostic IndirectRecherche de l'immunité antivirale

IgM anti VHEIgG anti VHe


Immunodépression, hépatite chronique et stratégie diagnostique

Kamar et al. American Journal of Transplantation 2008; 8: 1744–1748


VHE et vaccination

Risque cumulé d'un premier épisode d'hépatite E

Moyenne géométrique du taux d'anticorps anti-VHE

20 μg d'antigène rHEV (capside exprimée dans baculovirus) dans 0.5 ml de PBS sur 0.5 mg d'hydroxyde d'aluminum.3 injections

Shrestha,et al 2007 N Engl J Med 356;9

Efficacité : 95,5% après 3 doses


Adresser les prélèvementsau

Centre national de référence du VHE

Dr E NicandLaboratoire de biologie

HIA Val de GrâceTel : 01 40 51 40 00

http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste

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