ELISA

Daniel Goicochea

Universidad Nacional Mayor de San MarcosFacultad de Ciencias BiológicasEscuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología

Fundamento

• Se basa en la reacción Ag-Ab específico

• Marcaje con enzima indicadora (unida a un Ag o Ab) que produce productos coloreados

• La diferencia principal entre las técnicas de RIA y ELISA es que la primera utiliza como marcador un isótopo y la segunda la actividad de un enzima

• Anteriormente se empleaban isótopos radioactivos, que suponía mayor riesgo y costo en el laboratorio.

ELISA

Métodos de ELISA

ELISA Directo• Ag inmobilizados y detectados por

Ab primarios conjugados con enzimas. Es muy importante la especificidad del Ab primario.

• PROS: mínimo procedimiento, evita reactividad cruzada al no usar un Ab secundario

• CONS: requiere marcado de todos los Ab primarios – alto costo, no todos los Ab son adecuados para ser marcados

ELISA Indirecto

• Los Ab primarios no están marcados, son detectados por Ab secundarios conjugados con enzimas.

• PROS: Se puede usar una gran cantidad de Ab secundarios para diferentes ensayos, los Ab primarios mantienen máxima inmunoreactividad

• CONS: Puede ocurrir cross-reactivity

ELISA No competitivo (Sandwich)

• Ag capturado por Ab y detectado por Ab diferentes. Ambos Ab deben ser elegidos con cuidado para prevenir la reactividad cruzada o competencia por sitios de unión.

• PROS: Sensibilidad, alta especificidad, el Ag no necesita haber sido purificado antes de usar

• CONS: Los Ag deben tener al menos dos lugares de unión a Ab

ELISA Competitivo

• EL Ag de la muestra y el Ag purificado inmobilizado compiten por la unión (captura) del Ab.

• PROS: crude or impure samples may be used, high reproducibility.

• CONS: lower overall sensitivity and specificity.

Directo No competitivo

Directo

Diseño para cuantificación de Antígeno

• Método «Sándwich» o ELISA de captura• El Ag debe ser capaz de ser reconocido por

dos moléculas de Ab, simultáneamente: Uso de Ab policlonal o de dos Ab monoclonales (que reconocen distintos epítopos)

Miotoxina de Bothrops asper

Toxina tetánica

Diseño para cuantificación de anticuerpo

• Método indirecto: unión de Ag a fase sólida y unión de Ab de la muestra. Detección por conjugado.

• Riesgo: cambio conformacional del Ag al unirse a fase sólida

IgE sérica (alergias)

Enzimas y substratos• Principales enzimas: peroxidasa de rábano y

fosfatasa alcalina de mucosa intestinal bovina.• Pueden unirse a Ab sin alterarlos ni perder su

capacidad catalítica.• Catalizan reacciones que producen productos

coloreados solubles o precipitables:– Solubles: cuantificación por espectofotrometría, o en

el caso de fluorogénicos que se pueden detectar a bajas concentraciones

– Pp: técnicas de localización cuantitativa (WB, EIT, etc.)

Resultados• Positivo:– Presencia de anticuerpos (empleado en detección

de enfermedades) o antígenos• Falso positivo:– Producción de Ab en una persona que estuvo

enferma, pero ya se curó– Inespecificidad Ag-Ab

• Falso negativo:– Producción en bajas cantidades de Ab, puede

pasar desapercibido

Muestra: 256 adultos del Distrito de Cauday, CajamarcaDetección de anti-Toxocara IgG por dot-ELISA, usando antígenos TES (T. canis larvae excretory-secretory Ag)

Positivos Negativos

Toxocara dot-ELISA 53.1% (136) 46.9%

Las muestras de suero recibieron antígenos de Ascaris suum y disminuyó los resultados positivosLas muestras negativas siempre se mantuvieron negativas

Positivos Negativos

Toxocara dot-ELISA 44.92% (115) 55.08%

HIV ELISA detection

• The most popular ELISA involves an indirect method in which HIV antigen is attached to a well of a 96-well microtiter plate. Antibody in the sample is allowed to react with the antigen-coated solid support

• El método de ELISA descrito detecta antígenos solubles en la orina de los pacientes detectado por un Ab monoclonal para confirmar casos de pacientes con Legionella pneumophila serogroup 1 (L.pn 1).

• Especificidad del ensayo: 100%• Detección de antígeno en la orina: 77%