Embed Size (px)
Citation preview
1
2
A MICROTESTER GYAKORLATI ALKALMAZÁSA
Dr. Szakmár KatalinBudapest, 2012. február 15.
3
Minőség ellenőrzés• Élelmiszerek• Víz• Felületek• Levegő
Mikroba-pusztulási és szaporodásgátlási vizsgálatok• Fertőtlenítőszerek hatékonyságának vizsgálata• Antibiotikumok szaporodásgátló hatásának vizsgálata• Tartósítószerek hatékonyságának vizsgálata
Fermentációs iparok• Táptalaj optimalizálás
Környezetvédelem• Baktériumok aktivitásának vizsgálata
A MICROTESTER ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉGEI
4
Tejipari alkalmazások: • Nyerstej összcsíraszámának (mezofil aerob és fakultatív
anaerob baktériumszám) meghatározása• Nyerstej Enterobaktérium számának meghatározása
A kétféle meghatározás – redox görbék eltérő alakja miatt – egyszerre, egy táptalaj
alkalmazásával elvégezhető
MINŐSÉG-ELLENŐRZÉSÉLELMISZEREK
ENTEROBAKTÉRIUM ÉS ÖSSZCSÍRASZÁM EGYIDEJŰ MEGHATÁROZÁSA
Nyerstej, 1/2 TSB (T=30 °C)
-400-300-200-100
0100200300400500
0 5 10 15 20 25
t (h)
Eh
(m
V)
0. hig. 1. hig. 2. hig. 3. hig. 4. hig
5. hig 6. hig 7. hig.
ENTEROBAKTÉRIUM ÉS ÖSSZCSÍRASZÁM EGYIDEJŰ MEGHATÁROZÁSA
Nyerstej belső kalibrációs görbe(1/2 TSB, T=30 °C)
y = 2,6486x + 1,34
R2 = 0,9895
0
5
10
15
20
0 1 2 3 4 5 6 7
hígítás
TT
D (
h)
Összcsira Enterobacter
MPNEnterob.=2,3x102/ml
MPNÖsszcsíra=2,3x106/ml
MÓDSZEREK IDŐIGÉNYÉNEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA
MintaLemezöntés MicroTester
lgN Időigény (h) lg MPN Időigény (h)1. 5,18 5,36
2. 5,06 5,36
3. 4,93 72 4,36 184. 6,35 6,36
5. 6,79 6,36
8
Microtester Mini készülék alkalmazása:• A készülék a termelőhöz kihelyezhető• Kezelése viszonylag egyszerű• Az adatok a tejbegyűjtés időpontjában leolvashatók
NYERSTEJ VIZSGÁLATA KÖZVETLENÜL A TEJTERMELŐNÉL
MICROTESTER MINI KÉSZÜLÉK
10
A MÓDSZER IDŐIGÉNYE
Nyerstej összcsíra kalibrációs görbéje(1/2 TSB, 30 °C)
y = -1,5014x + 15,413
R2 = 0,9596
0
2
4
6
8
10
12
14
1 2 3 4 5 6 7 8 9
lgN /ml tej
TT
D (
h)
11
SALMONELLA KIMUTATÁSA
Salmonella, tej, sajt, RVS
y = -1.524x + 15.3
y = -1.400x + 12.4
y = -2.268x + 19.8
0
5
10
15
20
0 2 4 6 8 10
lgN (cfu/cell)
TT
D (
h)
sajt tej RVS
12
AZ RVS SZELEKTIVITÁSA
Mikroba RVSTTD (h)
RVS + 10% tejTTD (h)
TSBTTD (h)
Klebsiella oxytoca - - 6,5
Escherichia coli - - 1,6
Citrobacter freundii - - 2,5
Proteus vulgaris - - 14
13
KÜLÖNBÖZŐ SALMONELLÁKKALIBRÁCIÓS GÖRBÉI
Salmonella
y = -3.512x + 25.6
y = -4.604x + 35.8
y = -1.512x + 13.8
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8
lgN (cfu/cella)
TT
D (
h)
Salmonella Tiphymurium Salmonella Enteritidis Salmonella Abony
• MicroTester készülékkel a Salmonellák RVS tápoldatban kimutathatók.
• Elődúsítás nem szükséges.• A zavaró mikroflóra az RVS-ben nem szaporodik.• Élelmiszerek (tej, sajt, stb.) a tápoldathoz adása a
kimutatási időt csökkenti, de a szelektivitást nem befolyásolja.
• A Salmonella jelenlétének igazolása a MicroTesterrel végzett mérés után, a gyanús mintákból PCR-al elvégezhető.
SALMONELLA KIMUTATÁSA
LISTERIÁK KIMUTATÁSA
Listeriák redox görbéi (1/2 Fraser, 37 °C)
-400
-300
-200
-100
0
100
200
300
400
500
0 5 10 15 20 25
t (h)
Eh
(m
V)
L. monocytogenes L. innocua L. ivanovi
16
EGYESÍTETT KALIBRÁCIÓS GÖRBE 1/2 FRASERBEN TEJJEL ÉS TEJ NÉLKÜL
Listeria monocytogenes TTD = -4.218.lgN + 36.99
R2 = 0.9798
0
5
10
1520
25
30
35
0 1 2 3 4 5
lgN (cfu/cella)
TT
D (
h)
1/2 Fraser 1/2 Fraser, tejjel
• Fraser levesben a listeriák jelenléte a szokásos módszernél gyorsabban kimutatható.
• A táptalaj szelektivitását a hozzáadott élelmiszer (tej) nem befolyásolja.
• A tejben leggyakoribb zavaró mikroba, az E. coli a tápoldatban nem szaporodik.
• A Listeria monocytogenes jelenléte csak további vizsgálatokkal (PCR) igazolható.
LISTERIA MONOCYTOGENES KIMUTATÁSA
Húsipari alkalmazások: • Nyershús összcsíraszámának (mezofil aerob és
fakultatív anaerob baktériumszám) meghatározása• Húskészítmények gyártásközi mikrobiológiai
minőségellenőrzése
MINŐSÉGELLENŐRZÉSÉLELMISZEREK
19
NYERSHÚS ÖSSZCSÍRASZÁMA
Nyershús
y = -3.15x + 19.456
R2 = 0.965
y = -2.9427x + 20.293
R2 = 0.9897
y = -2.6833x + 20.498
R2 = 0.9633
y = -3.6081x + 26.46
R2 = 0.9851
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7
lgN (cfu/cella)
TT
D (
h)
marha sertés csirke darálthús
20
2073/2005 EK RENDELET ELŐÍRÁSAI
Élelmiszer kategória Mikrobák n c m M
Hasított szarvasmarha, juh, kecske, ló Aerob mikrobaszám lgN=3,5 lgN=5,0
Hasított sertés Aerob mikrobaszám lgN=4,0 lgN=5,0
Darált hús Aerob mikrobaszám 5 2 5x105 5x106
Mechanikusan lefejtett hús Aerob mikrobaszám 5 2 5x105 5x106
KIMUTATÁSI IDŐK ÖSSZEHASONLÍTÁSA
Határértékek(2073/2005 EK) Kimutatási idők (h)
(N=cfu/g) Klasszikus MicrotesterlgN=3,5lgN=4,0 HúslgN=5 aerob mikrobaszámlgN=5,7lgN=6,7
72
10 9 6 5 2
HÚSKÉSZÍTMÉNYEK GYÁRTÁSKÖZI ELLENŐRZÉSE
Húspépy = -0,54x + 8,5
R2 = 0,9637
0
2
4
6
8
10
0 2 4 6 8 10 12 14
TTD (h)
lgN
(cf
u/c
ella
)
HÚSKÉSZÍTMÉNYEK GYÁRTÁSKÖZI ELLENŐRZÉSE
Virsli gyártásközi vizsgálati eredményeinek összehasonlítása
0
2
4
6
8
10
1 2 3 4 5 6
Minatvételi pont
lgN
(c
fu/g
)
Lemezöntés Microtester
KIMUTATÁSI IDŐK ÖSSZEHASONLÍTÁSA
Mikrobaszám Kimutatási idő (h)
(N=cfu/g) Lemezöntés Microtester
lgN=6,1lgN=7,6
lgN=6,8lgN=5,8lgN=7,6lgN=7,5
72
7 4 5 7 44
• Üdítőitalok penész- és élesztőgomba számának meghatározása:– Indirekt mérés (a szaporodás során képződő CO2-ot KOH
oldatban nyeletjük el és a KOH oldat redox-potenciál változását mérjük)
MINŐSÉGELLENŐRZÉSÜDÍTŐITALOK
INDIREKT MÉRŐCELLA
27
INDIREKT MÉRÉS REDOX-GÖRBÉI
Saccharomyces cerevisiae
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50
t (h)
Eh
(m
V)
lgN=4.1 lgN=3.1 lgN=2.1lgN=1.1 lgN=0.1 steril
28
PENÉSZ- ÉS ÉLESZTŐGOMBAKALIBRÁCIÓS GÖRBÉI
Aspergillus nigerTTD(h) = -7.569.lgN + 60.7
R2 = 0.9677
20
30
40
50
60
70
0 1 2 3 4 5
lgN (cfu/cella)
TTD
(h)
(detektációs kritérium: dE/dt=0.2 mV/min)
Saccharomyces cerevisiae(detektációs kritérium: dE/dt=0.2 mV/min) TTD(h) = -7.2048.lgN + 41.3
R2 = 0.9856
0
10
20
30
40
50
0 1 2 3 4 5
lgN (cfu/cella)
TT
D (
h)
• Ivóvíz mikrobiológiai szennyezettségének gyors kimutatása
• Ásványvíz mikrobiológiai gyártásközi minőségellenőrzése
• Kezelt víz (pl. ioncserélt víz, R.O. víz, stb.) gyors mikrobiológiai vizsgálata
• Fürdővizek mikrobiológiai állapotának gyors vizsgálata
• Szennyvizek gyors mikrobiológiai vizsgálata
MINŐSÉGELLENŐRZÉSVÍZ
KIMUTATÁSI IDŐK ÖSSZEHASONLÍTÁSAVÍZ
Határértékek
Kimutatási idők (h)
Klasszikus módszer
Microtester
(1000 ml)
Összcsíra 22 oC (100 cfu/ml) 37 oC (20 cfu/ml) 72
22 (1 ml)10 (1 ml)
154
Coliform (1/100 ml)Escherichia coli (1/100 ml) 24
10 (100 ml)11 (100 ml)
910
Ps. aeruginosa (1/100 ml)Enterococcus (1/100 ml) 48
20 (100 ml)14 (100 ml)
1812
31
ÁSVÁNYVÍZ VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI
Mikroba Egy sejt kimutatásához szükséges vizsgálati idő (h)
Escherichia coli 11
Citrobacter freundii 23
Pseudomonas aeruginosa 24
Enterococcus faecalis 15
32
ÜZEMI ELLENŐRZŐ VIZSGÁLATOK 1.TYLICZ (TÉTELMINŐSÍTŐ VIZSGÁLAT)
Egy membránon 3 x 250 ml-t szűrtünk, egy mérőcellába 4 membránt tettünk (egy mérőcellában egyszerre 12 palack minőségét ellenőriztük)
Palackok sorszáma 1-12. 13-24. 25-36. 37-48. 49-60. 61-72.
Laboratóriumi mérés eredménye
negatív negatív negatív negatív negatív negatív
Microtester mérés eredménye negatív negatív negatív negatív negatív negatív
33
ÜZEMI ELLENŐRZŐ VIZSGÁLATOK 2.(Zalaszentgrót, Hoffmanné & Tar-Géri, 2008)
Vizsgált mikroba
Összes mérés (db)
Egyezés a szabványos
vizsgálattal (%)
Fals pozitív eredmény
(%)
Fals negatív eredmény
(%)
Escherichia coli 942 99,89 0,11 0,00
Coliform 4674 99,87 0,00 0,13
Enterococcus 3000 99,93 0,00 0,07
Pseudomonas aeruginosa 3372 99,82 0,06 0,12
TERMÉSZETES FÜRDŐVÍZ
Velencei tó (Agárd strand)
y = -0.8416x + 11.565
R2 = 0.9871y = -0.299x + 4.7342
R2 = 0.9917
-1
0
1
2
3
0 5 10 15 20
TTD (h)
lgN
(c
fu/1
00
ml)
Enterococcus E.coli
35
VIZSGÁLATI EREDMÉNYEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA
Escherichia coli (Agárd strand)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
1 2 3
minta sorszáma
lgN
(cf
u/1
00 m
l)
Microtester
Plate (Szfv.)
OKI
36
Enterococcus (Agárd strand)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
1 2 3
minta sorszáma
lgN
(cf
u/1
00 m
l)
Microtester
Plate (Szfv.)
OKI
VIZSGÁLATI EREDMÉNYEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA
37
• Szennyvíz (Coliform: 10 cfu/ml)– Nagyobb mennyiség (100, 1000 ml) szűrésével a vizsgálati
idő lerövidíthető
• Szennyvíziszap mikrobiológiai ellenőrzése
TOVÁBBI LEHETŐSÉGEK
38
MÉRŐCELLA KÉT MEMBRÁNNAL
39
SZENNYVÍZ MÉRÉSI EREDMÉNYEI
Szennyvíz, coliformy = -1,1554x + 9,7
R2 = 0,9788
0
2
4
6
8
10
0 2 4 6 8
lgN
TT
D
• Felületek ellenőrzése (tamponos vizsgálattal)
• Levegő mikrobiológiai tisztaságának ellenőrzése (membránszűréssel)
MINŐSÉGELLENŐRZÉSHIGIÉNIAI VIZSGÁLATOK
41
TAMPONOS VIZSGÁLATKALIBRÁCIÓS GÖRBE FELVÉTELE
42
FELÜLETEK
Kalibrációs görbe felvétele
Kalibrációs görbe y = -0.2859x + 7.2672
R2 = 0.9574
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20 25
TTD (h)
lgM
PN
/cel
la
43
MIKROBASZÁM MEGHATÁROZÁSA
44
FELÜLETEK
Mérési eredmények összehasonlítása
Felületek összcsíraszáma
01234567
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Mintavételi pont
lgN
(cf
u/1
00 c
m2 )
Lemezöntés Microtester
• Fertőtlenítőszerek• Antibiotikumok• Tartósítószerek• Egyéb mikrobaszaporodást gátló anyagok
MIKROBA-PUSZTULÁSI ÉS SZAPORODÁSGÁTLÁSI VIZSGÁLATOK
Antibiotikumok
MIKROBA-PUSZTULÁSI ÉS SZAPORODÁSGÁTLÁSI VIZSGÁLATOK
ANTIBIOTIKUMOK
Doxycyclin y = 0.6571x + 0.4263
R2 = 0.9711
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
C (mg/ml)
lgTT
D
Amoxicillin y = 0.1759x - 0.0754
R2 = 0.9949
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 1 2 3 4 5 6 7
C (mg/ml)
lgT
TD
Enrofloxacin y = 48.348x + 0.2886
R2 = 0.9946
0.000.200.400.600.801.001.201.40
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025
C (mg/ml)
lgT
TD
• Talajba került vegyszerek talaj-mikroflóra aktivitását befolyásoló hatásának vizsgálata– Például antibiotikumok hatása különböző típusú talajok
mikrobiális aktivitására
KÖRNYEZETVÉDELEM – BAKTÉRIUMOK AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA
49
Doxycyclin, talajy = 8.8762x - 11.612
y = 6.5508x - 8.295
y = 4.4082x - 0.8414
y = 13.362x - 20.614
y = 2.0662x + 4.03590
5
10
15
20
25
2.0 2.5 3.0 3.5
lgc (mg/kg)
TT
D (
h)
T1 T2 T3 T4 T5
ANTIBIOTIKUM MIKROBA AKTIVITÁST CSÖKKENTŐ HATÁSA KÜLÖNBÖZŐ TALAJOKBAN
50
Talaj
AntibiotikumCo (mg/kg)
Doxycyclin Enrofloxacin LinkomycinT5
vulkanikus 9 57 15
T3 hordalék 18 - 57
T1 homok 52 35 19
T2 agyagos termőföld 70 47 41
T4 vályog 108 - 56
ANTIBIOTIKUMOK LEGKISEBB SZAPORODÁS-GÁTLÓ KONCENTRÁCIÓI
51
• Egyszerű mérési technika• Nem igényel speciális mérőcellákat• Nincs szükség szigorú hőmérséklet-szabályozásra
– 0,5 °C pontosságú laboratóriumi termosztátok alkalmasak– (Az impedimetriás technika 0,002 °C pontosságú szabályozást igényel)
• Nincs szükség speciális táptalajokra– Alkalmazhatóak a szabványos, illetve egyéb táptalajok– (Az impedimetriás technika speciális tápleveseket igényel)
A MICROTESTER ELŐNYEI 1.
52
• Nincs szükség a minta hígítására– 100-108 cfu/mérőcella tartományban a minta hígítás nélkül mérhető
• Alkalmas membránszűréssel koncentrált, illetve tamponos minták mikrobaszámának hígítás nélküli, közvetlen meghatározására– Egyetlen mérőcellába több membránszűrő is behelyezhető.– Egyetlen mérőcella eredménye akár több liter mintát reprezentálhat
• Ásványvizek tétel-minősítése• Vízügyi haváriák gyors kimutatása
• Direkt mérésnél eredmény általában néhány órán belül– Tenyésztéses vizsgálatok időigénye néhány nap
A MICROTESTER ELŐNYEI 2.
53
• Gyors és egyszerű módszer a szaporodás- és pusztulás-kinetikai, valamint táptalaj-optimalizálási vizsgálatokhoz
• A módszer kellően szelektív– Különös előnyt jelent, hogy a táptalaj szelektivitásán túl a redox-görbe
alakja is jellemző a szaporodó mikroba-csoportra.– Ezt a szelektivitást a PCR technikán kívül egyéb módszerek nem érik el
A MICROTESTER ELŐNYEI 3.
54
• A nagy mintamennyiségből kiinduló szelektív dúsítás révén a MicroTester kiválóan alkalmazható a PCR-technika elődúsító lépéseként– A célmikrobát tartalmazó mikrobacsoportra negatív mintát nem
érdemes PCR-ral tovább vizsgálni– A mikrobacsoportra pozitív dúsítás PCR-ral közvetlenül vizsgálható, a
mikrobaszám jelentősen meghaladja a 106/ml koncentrációt– Csak a pozitivitás esélyével bíró minták kerülnek PCR vizsgálatra, ami
jelentős megtakarítást eredményez• A minta-mennyiségre vonatkoztatott fajlagos vizsgálati
költség jelentősen alacsonyabb a tenyésztéses, valamint az impedimetriás gyorsmódszerek költségénél
A MICROTESTER ELŐNYEI 4.
