View
45
Download
3
Category
Tags:
Preview:
Citation preview
Kauno technologijos universiteto gimnazija
ARBATOS IR PIENO GRYBŲ UŽPILŲ PRITAIKYMAS ANTIBAKTERINIO ODOS
KREMO GAMYBAI
Darbą atliko: Karolina Zakarauskaitė
Darbo vadovė: dr. Vilma Petrikaitė
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas,
VU Biotechnologijos institutas
Darbo konsultantas: prof. Alvydas Pavilonis
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
2012 m.
1
TURINYS
SANTRUMPOS 3
ĮVADAS 4
1. TYRIMŲ APŽVALGA 5
2. EKSPERIMENTINĖ DALIS 6
2.1. Arbatinio ir pieno grybų užpilo antimikrobinio aktyvumo tyrimai
2.2. Antibakterinio kremo priešmikrobinio aktyvumo tyrimai
6-7
7-8
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS 9-12
IŠVADOS 13
LITERATŪROS SĄRAŠAS 14
PRIEDAS 15-16
2
SANTRUMPOS
S. aureus Staphylococcus aureus
E. coli Escherichia coli
B. subtilis Bacillus subtillis
K. pneumoniae Klebsiella pneumoniae
C. albicans Candida albicans
P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
P. mirabilis Proteus mirabilis
B. cereus
A. hydrophila
Bacillus cereus
Aeromonas hydrophila
3
1 pav. Arbatos grybo Kombucha užpilas
ĮVADAS
Darbo aktualumas
Kombucha arbata – tai juoda saldinta, arbatos grybe fermentuota arbata [3]. Arbatos
grybo tėvynė – Rytų Azija. Grybą sudaro arbatos
paviršiuje plūduriuojančios bakterijų
(Schizosaccharomyces pombe, Acetobacter xylinum ir
kt.) kolonijos (žr. 1 paveikslą). Pagrindinės
Kombucha arbatos sudedamosios dalys yra acto
rūgšties bakterijos ir gliukorono rūgštis [1,2]. Dėl
organinių rūgščių arbata įgyja saldžiarūgštį skonį.
Dažniausiai šis grybas platinamas tik iš rankų į
rankas, o kai kuriose šalyse, pvz. JAV, Norvegijoje
parduodamas interneto parduotuvėse ir vaistinėse.
Kombucha arbata naudojama liaudies medicinoje nuo įvairių negalavimų. Teigiama,
kad ji stiprina imuninę sistemą, naikina kai kurias kenksmingas bakterijas skrandyje ir
žarnyne, valo organizmą nuo toksinų. Netgi manoma, kad arbatos grybas užkerta kelią širdies
ir kraujagyslių, kasos, inkstų ir vėžiniams susirgimams. Kai kurie žmonės jį vadina
„stebuklinguoju grybu“ ar jaunystės eliksyru, stabdančiu senėjimą.
Vis dėlto, kyla klausimas, kiek šiose kalbose yra tiesos. Kurias bakterijas iš tiesų šis
grybas veikia, ir ar iš viso veikia? O galbūt šis grybas, ypač paplitęs tarp vyresnio amžiaus
žmonių, iš tiesų turi potencialią naudą ir gali būti naudojamas daug plačiau nei tik kaip
geriama arbata? Siekdami išsiaiškinti kilusius klausimus, nutarėme ištirti grybo užpilo
antimikrobines savybes ir pabandyti jį pritaikyti kaip konservantą arba kaip antimikrobinę
medžiagą kremo gamybai.
Darbo tikslas – sukurti antibakterinį kremą, panaudojant kaip antimikrobines
medžiagas arbatos grybą Kombucha ir pieno grybą.
Uždaviniai:
1. Ištirti pieno grybo antimikrobines savybes.
2. Ištirti arbatos grybo antimikrobines savybes ir jų priklausomybę nuo
fermentacijos laiko.
3. Pagaminti kremus su arbatos grybo skirtingomis koncentracijomis.
4. Įvertinti pagaminto kremo antimikrobines savybes.
4
1. TYRIMŲ APŽVALGA
Įrodyta, jog Kombucha arbata teigiamai veikia medžiagų apykaitą, gydo artritą,
skrandžio veiklos sutrikimus ir įvairias vėžio rūšis. Tyrimai rodo, jog Kombucha apsaugo
kepenis nuo kenksmingo paracetamolio poveikio [10]. 2000 metais atliktas tyrimas, kuriame
tirtas grybo poveikis Shigella sonnei, Escherichia coli, Aeromonas hydrophila, Yersinia
enterolitica, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae ir kt. bakterijoms. Įrodyta, jog
grybas antibakteriškai veikia B. cereus, E. coli, A. hydrophila, S. typhimurium [8].
Skirtingų Kombucha užpilų koncentracija skiriasi, priklausomai nuo to, kokia grybo
kultūra naudojama [8].
Pagrindinės organinės rūgšties Kombucha arbatoje – acto rūgšties – didžiausia
koncentracija pasiekiama penkioliktą fermentacijos dieną. Dar viena iš pagrindinių rūgščių
yra L-gliukorono rūgštis. Didžiausia jos koncentracija būna dvyliktą fermentacijos dieną.
Manoma, kad būtent dėl šios rūgšties Kombucha veikia detoksifikuojančiai [7]. Pieno ir
citrinų rūgščių fermentuotame arbatos tirpale yra labai maži kiekiai. Šių rūgščių daugiausia
būna trečią fermentacijos dieną.
Jokių azoto turinčių junginių nėra pridedama į arbatą prieš ją fermentuojant, tačiau
baltymų kiekis fermentacijos metu auga. Tai rodo, jog arbatinio grybo bakterijos ir raugas
išskiria papildomus baltymus [8]. Dėl šios priežasties arbatinis grybas greitai dauginasi, todėl
jį patogu naudoti pramonėje.
Pieno grybas yra bakterijų kolonija, kurio tėvynė – Azija. Jame fermentuojamas
pienas, kuris savo skoniu ir konsistencija po 24 valandų fermentacijos primena kefyrą. Šiam
grybui priskiriamas antibakterinės ir priešgrybelinės savybės. Įrodytas pieno grybo
priešuždegiminis poveikis granuliomos atveju [10].
5
2. EKSPERIMENTINĖ DALIS
1. Arbatos grybo užpilo gamyba
Arbatos grybą gavome iš Lietuvos gyventojų, kurie jį augino namuose, juodojoje
arbatoje. Tyrimams arbatos grybo užpilą gaminome pagal kitų mokslininkų straipsniuose
aprašytas ir jau išbandytas metodikas [2,4,5], jas pritaikius mūsų laboratorijos sąlygoms.
Į verdantį išgrynintą vandenį dedama 100 g/l cukraus, 3 paketėliai/l juodosios arbatos
ir virinama 3-5 min. Atvėsinama iki kambario temperatūros ir supilama į stiklinį indą. Į
paruoštą arbatą dedama 150 g arbatos grybo ir paliekama fermentuotis kambario
temperatūroje, pridengus marle. Taip paruoštas grybo užpilas laikomas iki tyrimų pabaigos,
po to iš jo atsisluoksniavusio naujo “grybo” sluoksnio gaminamas naujas užpilas.
2. Pieno grybo užpilo gamyba
Pieno grybą gavome iš Lietuvos gyventojų, auginančių jį namuose. Jis auginamas
piene, kuris keičiamas kiekvieną dieną, perkošiant pieną per sietelį, nuplaunant pieno grybą ir
vėl jį užpilant nauju pienu.
3. Arbatos ir pieno grybų užpildų antimikrobinių sąvybių tyrimas
Arbatos ir pieno grybo užpilų antimikrobinį aktyvumą in vitro tyrėme skirtingų
bakterijų ir grybelio kultūroms:
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Escherichia coli ATCC 25922
Klebsiella pneumoniae ATCC 33499
Proteus mirabilis ATCC 12459
Bacillus cereus ATCC 6633
Candida albicans ATCC 60193
Streptococcus epidermidis
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Šios bakterijų ir grybelių kultūros buvo auginamos 5 ml talpos mėgintuvėliuose ant
nuožulnaus triptozės sojos agaro. Kas 7 dienas jos buvo persėjamos į šviežią triptozės sojos
agarą, laikomos šaldytuve (2–8 ºC temperatūroje).
Antimikrobinis aktyvumas nustatytas standžioje terpėje (Mueller-Hinton broth II,
BBL, Cockeysville, JAV) cilindrų metodu.
Tyrimai vyko keliais etapais:
6
1. Etaloninių mikroorganizmų kultūrų paruošimas. Etaloninės bakterijų ir grybelio
C. albicans kultūros buvo auginamos 20–24 val. 35–37 ºC temperatūroje ant Miulerio-
Hintono agaro. Mikrobų suspensija gaminama iš išaugintų mikrobų kultūrų fiziologiniame
natrio chlorido (0,9 proc.) tirpale, standartizuojama McFarland standartiniu indikatoriumi,
kuris matuoja mėgintuvėlyje esančios suspensijos drumstumą. Mikrobų suspensija laikoma
standartizuota, kai indikatoriaus reikšmė lygi 0,5 (tai reiškia, kad 1 ml mikrobų suspensijos
yra 1,5 × 108 mikrobų ląstelių).
2. Tiriamųjų grybų užpilų paruošimas mikrobiologiniam tyrimui. Tyrimams
naudojami arbatos grybo užpilai buvo sterilizuojami, juos filtruojant per 0,2 µm porų
skersmens filtrus. Pieno grybo užpilas prieš filtravimą centrifūguojamas 20 min. esant
5000 aps./min. greičiu. Antimikrobinio aktyvumo tyrimų metu buvo atliekama užpilo
sterilumo kontrolė.
3. Terpių su mikroorganizmų kultūromis paruošimas. Standi Miulerio-Hintono terpė
išlydoma ir atvėsinama iki 50 °C temperatūros. Aseptinėmis sąlygomis atmatuojama 15 ml
terpės, sumaišoma su 1 ml paruoštos atitinkamos mikroorganizmų suspensijos ir perkeliama į
sterilią Petri lėkštelę. Sustingus terpei, ant jos paviršiaus aseptinėmis sąlygomis išdėliojami
maždaug vienodu atstumu vienas nuo kito 5 arba 6 sterilūs cilindrai, kurių vidinis diametras
yra 7 mm, o išorinis diametras – 8 mm.. Paliekama maždaug 15-20 min., kad cilindrai įsmigtų
į terpę apie 1-2 mm.
4. Grybų užpilų išpilstymas į cilindrus. Paruoštas tyrimams grybo užpilas sterilia
pipete perkeliamas į Petri lėkštelėse išdėliotus cilindrus po 0,1 ml. Petri lėkštelės dedamos į
termokamerą 1 arba 2 paroms.
Po 1 arba 2 dienų vertinamas mikrobų augimas ir lyginamas su kontrole.
Kontroliniame mėginyje į cilindrus užpilas nebuvo pilamas. Esant antimikrobiniam arbatos
veikimui, aplink cilindrus susidaro sterili (skaidri) zona, kurios skersmuo matuojamas
liniuote.
4. Kremo gamyba
Kremo gamybai naudojome hidrofilinį kremo pagrindą, gautą iš Lietuvos svekatos
mokslų universiteto Vaistų technologijos katedros prof. Jurgos Bernatonienės. Kremo
pagrindo stabilumas ištirtas kitų mokslininkų ir nustatyta, kad jis išlieka stabilus, į jį dedant
iki 20 proc. vandens arba vandeninio tirpalo.
Buvo gaminami penkių koncentracijų kremai: į pagrindą dedama 1 proc., 5 proc.,
10 proc., 15 proc. ir 20 proc. Kombucha užpilo, fermentuoto 8 dienas, arba pieno grybo
7
užpilo, fermentuoto parą. Gamybai naudojami grybų užpilai buvo sterilizuojami, juos
filtruojant per 0,2 µm porų skersmens filtrus. Porceliano grūstuvėje atsvertas kiekis kremo
pagrindo (5 g) piestele sukamaisiais judesiais maišomas su reikiamu kiekiu užpilo apie
10 min. Pagaminti kremai perkelti į tamsaus stiklo užsukamus buteliukus.
Kadangi į pagrindą įdėto užpilo pH yra rūgštinis, įvertinome pagamintų kremų
stabilumą centrifūgavimo metodu (3500 aps./min., centrifūgavimo trukmė – 5 min.).
Nustatyta, kad visi pagaminti kremai yra stabilūs.
5. Kremo antimikrobinių sąvybių tyrimas
Pagamintų kremų antimikrobinis aktyvumas nustatytas standžioje terpėje (Mueller-
Hinton broth II, BBL, Cockeysville, JAV) šulinėlių metodu. Metodika tokia pati, kaip ir
vertinant užpilų antimikrobinį aktyvumą, tik standžioje terpėje buvo aseptinėmis sąlygomis
išpjaustyti šulinėliai (7 mm diametro) ir į juos dedamas tiriamasis kremas.
8
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Prieš tiriant užpilų ir kremo antimikrobinį aktyvumą, buvo įvertintas galimas saldintos
juodosios arbatos (be grybo) poveikis mikroorganizmams (1 pav.).
Juodosios arbatos antibakterinės savybės
6
8
10
12
14
16
S. aur
eus
E. col
iK. p
neum
onia
e
B. sub
tilis
C. albi
cans
S. epi
derm
idis
P. aer
ugin
osa
P. mira
bilis
Ske
rsm
uo (
mm
)
1 pav. Juodosios arbatos poveikis tirtiems mikroorganizmams
Nustatyta, kad juodoji arbata turi antimikrobinį aktyvumą tik prieš S. epidermidis
(13,17 ± 1,47 mm), o kitų bakterjų ir grybelio C. albicans praktiškai neveikia (sterili zona
buvo tik cilindro skersmens, apie 8 mm).
Atlikus įvairaus fermentacijos laikotarpio grybo užpilo antimikrobinio aktyvumo
tyrimus, paaiškėjo, kad ilgėjant fermentacijos laikui, poveikis prieš mikrobus gerėja. Vieną
dieną fermentuotos arbatos aktyvumas prieš daugumą bakterijų ir grybelį buvo labai mažas
(sterilios zonos skersmuo buvo apie 8mm), aktyviausiai veikė B. subtilis ir S. epidermidis
(sterilios zonos buvo 13 ± 1,26 mm). Tuo tarpu po dešimties dienų fermentacijos arbata
mikroorganizmus veikia 1,5 karto (C. albicans), 2 kartus (B. subtilis, P. aeruginosa) ar net 3
kartus stipriau (kiti mikroorganizmai). Tokie rezultatai leidžia manyti, kad norint pritaikyti
grybo arbatą kaip antimikrobinę priemonę, tikslinga ją fermentuoti 7-10 dienų (2 pav.).
9
Kombucha antimikrobinės savybės
5
10
15
20
25
30
35
0 2 4 6 8 10
Fermentacijos laikas (dienos)
Ske
rsm
uo (
mm
)S. aureus
E. coli
K. pneumoniae
B. subtilis
C. albicans
S. epidermidis
P. aeruginosa
P. mirabilis
2 pav. Grybo užpilo antimikrobinio aktyvumo priklausomybė nuo fermentacijos laiko
Arbatinis grybas Kombucha stipriausiai veikia šias bakterijas: S. epidermidis,
S. aureus, B. subtilis, E. coli, K. pneumoniae. Jam atspariausi: grybelis C. albicans bei
bakterijos P. mirabilis ir P. aeruginosa. Gauti rezultatai kelių mikrobų atžvilgiu atitinka
literatūroje pateiktus antimikrobinių tyrimų rezultatus [8].
Gali būti, kad acto rūgštis – tai Kombucha antibakterinių savybių priežastis [4,5],
tačiau nustatyta, jog ir esant beveik neutraliam pH (apie 6), grybo užpilas pasižymi
antibakterinėmis savybėmis.
Atlikus kremo su įvairiomis Kombucha užpilo, fermentuoto 8 dienas,
koncentracijomis, antimikrobinio aktyvumo tyrimus prieš bakterijas ir grybelį, nustatėme, kad
kremas stipriausiai veikia S. aureus, S. epidermidis ir P. aeruginosa bakterijas. Antibakterinis
kremo poveikis prieš P. aeruginosa pasireiškė esant 10 proc. ir didesnėms koncentracijoms.
S. aureus kremas veikia nestipriai ir aktyvumas prieš šią bakteriją beveik nepriklauso nuo
koncentracijos. Aktyvumas prieš E. coli pasireiškia esant bent 10 proc. ir didesnėms kremo
koncentracijoms (3 pav.).
10
0
2
4
6
8
10
12
1 5 10 15 20
Užpilo koncentracija kreme (proc.)
Ske
rsm
uo
(mm
)
S. aureus
S. epidermidis
P. aeruginosa
E. coli
3 pav. Kombucha kremo antimikrobinio poveikio priklausomybė nuo užpilo
koncentracijos.
Ištyrus pieno grybo užpilo antibakterinį aktyvumą, nustatėme, kad jis stipriausiai
veikia bakteriją S. epidermidis, šiek tiek silpniau K. pneumoniae, S. aureus, E. coli ir
silpniausiai P. mirabilis:
0
5
10
15
20
S. aur
eus
K. pne
umon
iae
S. epi
derm
idis
P. mira
bilis
E. col
i
Ske
rsm
uo
(m
m)
4 pav. Pieno grybo antibakterinės savybės
11
Atsižvelgę į šiuos rezultatus sukūrėme antibakterinėmis savybėmis pasižymintį kremą:
0
1
2
3
4
10 20
Užpilo koncentracija kreme (proc.)
Ske
rsm
uo
(mm
)
E. coli
S. aureus
P. aeruginosa
5 pav. Pieno grybo kremo poveikio priklausomybė nuo užpilo
koncentracijos.
Atlikus kremo su įvairiomis pieno grybo užpilo, fermentuoto 1 parą,
koncentracijomis, antimikrobinio aktyvumo tyrimus prieš bakterijas ir grybelį, nustatėme, kad
kremas veikia S. aureus, E.coli ir P. aeruginosa bakterijas.
12
IŠVADOS
1. Arbatos ir pieno grybo užpilai pasižymi antimikrobinėmis savybėmis. Stipriausiai
arbatos grybo užpilas veikia S. aureus, S. epidermidis, B. subtilis, K. pneumoniae ir E.
coli bakterijas; labai mažai veikia P. mirabilis, P. aeruginosa, C. albicans. Pieno grybo
užpilas stipriausiai veikia bakteriją S. epidermidis.
2. Ilgėjant arbatos fermentacijos laikui iki 10 dienų, stiprėja antimikrobinės užpilo
savybės.
3. Kremas, sudėtyje turintis 10 proc. ir daugiau Kombucha arbatos arba pieno grybo
užpilo, veikia S. aureus, E. coli, ir P.aeruginosa bakterijas. Kremas su Kombucha
arbata veikia ir S. epidermidis. Abu kremai galėtų būti pritaikyti kaip antibakterinės
priemonės.
13
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Changes in content of organic acids and tea polyphenols during kombucha tea fermentation R. Jayabalan, S. Marimuthu, K. Swaminathan.
2. Blanc, P. J. (1996). Characterization of tea fungus metabolites. Biotechnology Letters, 18(2), 139–142
3. Chen, C., & Liu, B. Y. (2000). Changes in major components of tea fungus metabolites during prolonged fermentation. Journal of Applied Microbiology, 89, 834–839.
4. Greenwalt, C. J., Ledford, R. A., Steinkraus, K. H.: Determination and characterization of the antimicrobial activity of the fermented tea Kombucha. Lebensm. Wiss. Technol. 31 (1998),291–296.
5. Steinkraus, K. H., Shapiro, K. B., Hotchkiss, J. K., Mortlock, R. P.: Investigations into the antibiotic activity of tea fungus/Kombucha beverage. Acta Biotechnol. 16 (1996), 199–205.
6. Vijayaraghavan, R., Singh, M., Rao, P. V. L., Bhattacharya, R., Kumar, P., Sugendran, K., Kumar, O., Pant, S. C., & Singh, R. (2000). Subacute (90 days) oral toxicity studies of Kombucha Tea. Biomedical and Environmental Sciences, 13, 293–299.
7. Loncar, E. S., Petrovic, S. E., Malbasa, R. V., & Verac, R. M. (2000). Biosynthesis of glucuronic acid by means of tea fungus. Nahrung, 44, 138–139.
8. Sreeramulu, G., Zhu, Y., & Knol, W. (2000). Kombucha fermentation and its antimicrobial activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry,48, 2589–2594.)
9. Pauline, T., Dipti, P., Anju, B., Kavimani, S., Sharma, S. K., Kain, A. K.,Sarada, S. K. S.,Sairam, M., Ilavazhagan, G., Kumar, D., &Selvamurthy, W. (2001). Studies on toxicity; anti-stress and hepatoprotective properties of kombucha tea. Biomedical and Environmental Sciences, 14(3), 207–213.
10. Study of anti-inflammatory activity of Tibetanmushroom, a symbiotic culture of bacteria and fungi encapsulated into a polysaccharide matrix (2003) R.O Diniz, L.K Garla, J.M Schneedorf, J.C.T Carvalho. 49-52
14
PRIEDAS
1 pav. Cilindrų metodas antimikrobiniuose tyrimuose
2 pav. Sterilios zonos
15
3 pav. Šulinėlių metodas kremo
antimikrobiniuose tyrimuose
4 pav. Paruošti kremai
5 pav. Kremo antimikrobiniai tyrimai
16
Recommended