DNA İZOLASYONU

DNA İZOLASYONU

HAZIRLAYANÇEVİK GÜREL

DANIŞMANSERBÜLENT YİĞİT

DNA İZOLASYONU

Nükleik asitlerin izolasyonu çoğu moleküler biyoloji ve rekombinant DNA çalışmalarının ilk basamağıdır.

Örneğin moleküler biyolojide en çok kullanılan yöntem olan PCR için ilk basamak nükleik asitlerin izolasyanudur.

Nükleik asitlerin kalitesi ve saflığı PCR analizleri için en önemli faktörlerdir.

DNA İZOLASYONU

DNA İZOLASYON YÖNTEMLERİNDE BİRBİRİNİ İZLEYEN ÜÇ TEMEL AŞAMA BULUNMAKTADIR:

1. Hücrenin parçalanması (lizasyon) ile DNA’nın açığa çıkması.

2. DNA-protein kompleksinin ayrılması ve DNA’nın çözünür duruma getirilmesi.

3. DNA’nın basit enzimatik ve/veya kimyasal yöntemlerle, RNA ve diğer makromoleküllerden ayrılması.

HÜCRE LİZASYONU VE DNA’NIN SERBEST KALMASI

HÜCRE LİZASYONU VE DNA’NIN SERBEST KALMASI

EDTA’lı tüplere alınmış kandan 400 l başka bir tüpe alınır ve üzerine 1000 l TE (Tris EDTA) eklenir.

EDTA kanın pıhtılaşmasını engellerken, TE eritrositlerin parçalanmasından

sorumludur. 12000 rpm’de 1 dk santrifüj yapılır.

HÜCRE LİZASYONU VE DNA’NIN SERBEST KALMASI

Santrifüj işleminden sonra üst kısımda kalan süpernatant atılır.

Alt kısımda kalan hücrelere 80 l SDS (sodium dedocyl sulfate) eklenir.

SDS bir deterjan türevidir ve hücre zarındaki lipitleri eriterek hücredeki DNA’nın serbest kalması için kullanılır.

HÜCRE LİZASYONU VE DNA’NIN SERBEST KALMASI

SDS’nin eklenmesini takiben lizatın üzerine 90 l NaCl ve 10 l Proteinaz K konulur.

NaCI proteinler etrafındaki suları çekerek proteinlerin çökelmesini sağlar.

Proteinaz K ise hücre zarındaki ve sitoplazma içerisindeki proteinleri parçalar.

HÜCRE LİZASYONU VE DNA’NIN SERBEST KALMASI

Hazırlanan lizat 56 ºC’ye ayarlı su banyasonda yarım saat bekletilir.

Bunu işlemin amacı lizattaki hücrelerin çekirdek membranlarının parçanlamasını sağlamaktır.

DNA-PROTEİN KOMPLEKSİNİN AYRILMASI VE DNA’NIN

ÇÖZÜNÜR HALE GELMESİ

DNA-PROTEİN KOMPLEKSİNİN AYRILMASI VE DNA’NIN

ÇÖZÜNÜR HALE GELMESİ Lizatın üzerine 250 l Fenol, 250 l Etanol

eklenir ve 2500 rpm’de 2 dakika santrifüj yapılır. Süpernatant başka bir tüpe aktarılır.

Fenol DNA’ya bağlı olan proteinleri (histonları) degrede eder.

Etanol ise gradient farkı oluşturarak DNA’nın degrede olan proteinler ile birlikte dibe çökmesini engeller. Bazı durumlarda Etonol yerine izopropanol kullanılabilir.

DNA-PROTEİN KOMPLEKSİNİN AYRILMASI VE DNA’NIN

ÇÖZÜNÜR HALE GELMESİ Süpernatant üzerine 200 l EDTA eklenir. EDTA bir çok metal iyonunu bağlayabilen

bir maddedir. DNAaz’ın çalışması için gerekli Mg iyonlarını bağlayarak DNA’nın degrede olmasını engeller.

DNA’NIN RNA VE DİĞER MAKROMOLEKÜLLERDEN

AYRILMASI

DNA’NIN RNA VE DİĞER MAKROMOLEKÜLLERDEN

AYRILMASI Süpernatant üzerine 10 l RNaz H enzimi

ve 50 l %99’luk soğuk Etanol eklenir ve 11000 rpm de 1 dakika santrifüj yapılır.

RNaz H enzimi süpernatant içerisindeki RNA moleküllerini degrede eder.

Soğuk Etanol içerisinde DNA degrede olmuş ve ya olmamış RNA ve protein moleküllerinden çok daha hızlı dibe çöker.

DNA’NIN RNA VE DİĞER MAKROMOLEKÜLLERDEN

AYRILMASI Soğuk etanolün eklenmesiye DNA dibe

çöker. Böylece süpernatanttan ayrılarak pelet oluşturur.

Süpernatant dibe çok fazla yaklaşılmayarak mikropipet ile alınarak atılır.

DNA’NIN RNA VE DİĞER MAKROMOLEKÜLLERDEN

AYRILMASI Pelet kısımı steril bir ortama bırakılarak

etanolün uçması sağlanır. Böylece genomik DNA elde edilir.

SAFLAŞTIRILAN DNA’NIN KALİTE KONTROLÜ

DNA’NIN SPEKTROFOTOMETRE İLE SAFLIK DERECESİNİN

BELİRLENMESİ Nükelik asitler 260 nm’de maksimum

absorbans verir. Proteinler ise 280 nm’de maksimum absorbansa sahiptir.

Bu bilgiler göz önünde bulundurularak:Elde ettiğimiz peletin 260 nm’de ki absorbansı

alınır ve kaydedilir.Daha sonra peletin 280 nm’de ki absorbansı

alınır ve kaydedilir.

DNA’NIN SPEKTROFOTOMETRE İLE SAFLIK DERECESİNİN

BELİRLENMESİ Elde edilen değerlerden 260 nm’de ki değer, 280

nm’de ki değere bölünür. Sonuç;

Eğer 1,7-1,8 arasında ise elde saf DNA elde edilmiştir. Eğer 2 ise kabul edilebilir saflıkta DNA elde edilmiştir. Eğer 1 ise protein konteminasyonu vardır. Eğer 0,5 ile 1,7 arasında ise RNA kontaminasyonu

vardır.

DİĞER DNA İZOLASYON YÖNTEMLERİ

SİLİKA YÖNTEMİ

Bu yöntem belirli tuz konsantrasyonlarında DNA'nın silikaya bağlanması esasına dayanır.

Lizis ile hücreleri patlattıktan sonra ısı proteinaz K ve deterjanlar ile protein sindirilir.

DNA silika membranına bağlanır. Hızlı ve toksik madde içermediğinden güvenlidir. Fakat çok fazla tüp deiştirildiğinden

kontmainasyon riski fazladır.

MAGNETİK BONCUK YÖNTEMİ

DNA'nın magnetik boncuklara bağlanması esasına dayanır.

Tüm kan örneklerinden DNA izolasyonu otomatize sistem kullanılarak yapılır.

Bu sistemin izolasyon prensibi özel polimerlerle kaplı manyetik bilye teknolojisine dayanmaktadır.

Lökositlerden açığa çıkan DNA'nın bağlama tamponuyla manyetik bilyelere bağlanması sağlanır ve daha sonra proteinler,tuzlar ve alkolün uzaklaştırılmasından sonra DNA manyetik akı üzerinde bilyelerle sıvı faza alınır.

Bu sistem çok hızlıdır ve otomasyona uygundur. Artan test sayısı ve çeşitliliği tanı laboratuarlarında

otomatik DNA izolasyonu ihtiyacını gündeme getirmiş ve bu amaçla otomatize cihazlar geliştirilmiştir.

Otomatik DNA izolasyonu sistemlerinde genellikle bu yöntem kullanılmaktadır.

Ancak bu manyetik partiküller elüsyon basamağında yeterince uzaklaştırılmassa PCR amplifikasyon reaksiyonunu etkileyebilmekte ve yalancı negatif PCR sonuçlarına yol açabilmektedir.

FTA KAĞIDI

FTA kağıdı burgoyn tarafından DNA nın uzun süre saklanması için üretilmiştir.

içinde DNA'yı nükleaz ve bakterilerden koruyan kimyassallar vardır.

Kağıt üzerinde emdirilen kan veya tükrüğün kurutularak daha sonra yıkama işlemine dayanır.

Çok hızlı ve DNA'nın muhafazası ve izolasyonu için uygundur. Fakat RFLP için uygun değildir.

FENİL KLOROFORM YÖNTEMİ

Fenol ve kloroform proteinlerin sekonder yapısını parçalayarak onların denatüre olmasını ve solüsyonda presipitasyonunu sağlarlar.

Fenol ekstraksiyonu esnsında bu prespite olan proteinler bir araya toplanarak sıvı ve interfazda toplanırlar.

Bu solventlerin her biri tek başına bu fonksiyonu yerine getirebilse de ikisi birlikte daha etkili bir şekilde proteini uzaklaştırabilirler.

TEŞEKKÜRLER