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2011
Pabla Ugalde Díaz
Orientadores
Luisa Barreira
João Varela
Mestrado em Aquacultura e Pescas
Faculdade de Ciências e Tecnologias
Universidade do Algarve, Portugal.
compañía]
[Seleccionar fecha]
Efectos de estrés abiótico en la producción de lípidos
en Chlorella sp. yTetraselmis chuii, importantes para
elaboración de biodiesel
MarBiotech CCMAR-Universidade do Algarve
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Agradecimientos
Dedico esta tesis a mi hija Emilia quien me ha acompañado en este camino,
siendo el motor fundamental de mi vida.
Agradezco al programa External Cooperation Window Lot 17, Chile, Erasmus
Mundus, quienes hicieron posible mi estadía y estudios en Portugal.
Agradezco a todos quienes me ayudaron a lograr realizar mi tesis de una u otra
manera, familia, amigos, colegas y profesores.
También agradezco a quienes no me ayudaron, ya que gracias a ellos descubrí la
fuerza interior que tengo cuando quiero lograr mis objetivos.
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Summary
Microalgae are a potential resource for biodiesel production and antioxidant
compounds. The lipids concentration increase in the late exponential phase,
but can also be induced by abiotic stress. In this work, the microalgae
Chlorella sp. and Tetraselmis chuii, were submitted to a light intensity
increase, nitrate limitation and iron limitation in the late exponential phase to
verify the effect of stress on lipid productivity. The results indicated a
significant increase of the lipid concentration in Chlorella sp. when was
submitted to a light intensity upshift. The other treatments did not induce a
significant increase in the lipids concentration. In T. chuii the lipid
concentration did not increase with any of the differents stress assay. The
lipid profile of both species under stress was analyzed. The main fatty acids in
Chlorella sp., were palmitic, palmitoleic and eicosapentaenoic acids. In T. chuii
palmitic, linoleic and oleic acids were predominant, the latter having great
importance for biodiesel production. The antioxidant activity of the microalgal
biomass was analyzed as a possible feedstock for the isolation of bioactive
compounds with neuroprotective activity. The bioactive compounds were
extracted by the nonpolar solvent hexane and the polar solvent
dichloromethane (DCM) from both microalgae species. The antioxidant activity
was determined by the free radical with DPPH assay, with which both Chlorella
sp. and T. chuii, showed significant differences in radical scavenging activity
(RSA) at 1-5 and 10 mg mL-1, with the hexane and DCM extract. The higher
RSA with hexane extract was 10 mg mL-1, and higher RSA at 5 and 10 mg mL-1,
with the DCM extract, in both species. We conclude that Chlorella sp. has a
higher lipid concentration than T. chuii, although both species contain fatty
acids ideal for biodiesel production. On the other hand both microalgae are
promising feedstocks containing bioactive compounds with antioxidant activity
although still are required further studies are required to identify the
compound responsible for the bioactivity.
Key word: microalgae,lipids, biodiesel, bioactive compounds
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Resumen
Las microalgas son un recurso potencial para producir biodiesel y obtener
compuestos antioxidantes. El aumento en la concentración de lípidos ocurre en
la fase exponencial tardía, aunque también puede ser inducida por estrés
abiótico. En este trabajo, Chlorella sp. y Tetraselmis chuii, fueron sometidas a
incremento en intensidad luminosa, limitación de nitratos y limitación de hierro,
en la fase exponencial tardía para verificar el efecto en la productividad
lipídica. Los resultados indicaron un aumento significativo de la concentración
de lípidos en Chlorella sp., aumentando la intensidad de luz. Los otros
tratamientos no tuvieron un efecto significativo en la concentración de lípidos.
En T. chuii no hubo diferencias significativas en la concentración de lípidos con
diferentes tipos de estrés. El perfil lipídico de ambas especies sometidas a
estrés fue analizado, siendo los ácidos grasos palmítico, palmitoleico y
eicosapentaenoico los principales en Chlorella sp., y en T. chuii los ácidos
palmítico, linoleico y oleico, este último de gran importancia para elaboración
de biodiesel. Fue analizada la actividad antioxidante de biomasa microalgal
como posible recurso de compuestos bioactivos con actividad neuroprotectora.
Los compuestos bioactivos fueron extraídos por el solvente apolar hexano y el
solvente polar diclorometano (DCM), en Chlorella sp., y T. chuii. La actividad
antioxidante fue determinada a través del ensayo de radicales libres DPPH,
siendo en ambas microalgas significativamente diferente la secuestración de
radicales libres (RSA) en las concentraciones de 1-5 y 10 mg mL-1, con el
extracto hexano y DCM. En ambas especies, una alta RSA tuvo la concentración
de 10 mg mL-1 con el extracto hexano y alta RSA en concentraciones de 5 y 10
mg mL-1 con DCM. Se puede concluir que Chlorella sp presenta una mayor
concentración de lípidos que T. chuii, aunque ambas especies poseen ácidos
grasos ideales para la elaboración de diesel y son promisorias en actividad
antioxidante, aunque faltan estudios para identificar la naturaleza de los
compuestos.
Palabras clave: microalgas, lípidos, biodiesel, compuestos bioactivos
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Indice
1. Introducción 11
1.1. Biodiesel como recurso energético 11
1.2. Biología de microalgas 18
1.2.1. La fotosíntesis. 19
1.2.2. Nutrientes en las microalgas 23
1.2.3. Lípidos a partir de microalgas 25
1.2.4. Actividad antioxidante en Microalgas 31
1.3. Producción de Microalgas a gran escala 35
1.3.1. Sistemas de cultivo 35
1.3.2. Obtención de biomasa microalgal 38
1.4. Biorefinería de microalgas para producción de Biodiesel 40
1.5. Especies de microalgas utilizadas en este estudio 44
1.5.1. Chlorella sp. 44
1.5.2. Tetraselmis chuii 45
1.6. Objetivos 46
1.6.1. Objetivos generales 46
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1.6.2. Objetivos específicos 46
2. Materiales y Métodos 48
2.1. Cultivo de cepas de microalgas y crecimiento celular 48
2.2. Curva de crecimiento 50
2.3. Determinación del peso seco en biomasa microalgal 53
2.4. Análisis de lípidos totales 53
2.4.1. Método Gravimétrico 53
2.4.2. Determinación de lípidos por fluorescencia 56
2.4.3. Evaluación del perfil lipídico 58
2.5. Estudio de inducción a la producción de lípidos por estrés
abiótico 61
2.5.1. Incremento en la intensidad luminosa 63
2.5.2. Depleción de la concentracion de Nitrato 63
2.5.3. Depleción de la concentración de Hierro 64
2.6. Evaluación de actividad antioxidante 65
2.6.1. Extracción de compuestos antioxidantes 65
2.6.2. Fase de Evaporación 65
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2.6.3. Actividad secuestradora de radicales libres (RSA) 66
2.7. Análisis Estadístico 67
3. Resultados 69
3.1. Cultivo de cepas de Clhorella sp. y Tetraselmis chuii 69
3.1.1. Crecimiento celular 69
3.2. Determinación de lípidos 70
3.2.1. Lípidos Totales 70
3.2.2. Análisis de lípidos a través de La técnica rojo de Nilo 72
3.2.3. Relación entre la concentración lipídica determinada por
el método gravimétrico y por fluorescencia (recta de
calibración) 75
3.3. Crecimiento celular en microalgas sometidas a estrés abiótico 77
3.3.1. Incremento en la intensidad de luz 77
3.3.2. Depleción de la concentración de Nitrato 79
3.3.3. Depleción de la concentración de Hierro 82
3.4. Estudio de la inducción a la producción de lípidos por estrés
abiótico 83
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3.4.1. Incremento en la intensidad de luz 83
3.4.2. Depleción de la concentración de Nitrato 84
3.4.3. Depleción de la concentración de Hierro 85
3.5. Efectos del estrés abiótico en la producción de lípidos en
Chlorella sp., y T.chuii 86
3.5.1. Determinación del porcentaje de lípidos totales con respecto
a la biomasa 87
3.6. Evaluación del Perfil Lipídico 89
3.7. Actividad antioxidante de microalgas Chlorella sp. y T. chuii 94
4. Discusión 96
4.1. Crecimiento celular y concentración de lípidos bajo
condiciones de estrés 96
4.2. Actividad Antioxidante de microalgas Chlorella sp. y
Tetraselmis chuii 105
5. Conclusión 108
6. Referencias 110
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Glosario
ANOVA - análisis de varianza
AD – Enfermedad de Alzheimer (Alzheimer disease)
ACh - Acetilcolina
AChE – Acetilcolinesterasa
ATP – Adenosina trifosfato
BHT – Butil hidroxitolueno
BHA – Butil hidoxianisol
CoA – Coenzima A
EE.UU. – Estados Unidos de Norteamérica
Fe – Solución de Hierro
FAME – Esteres metílicos de ácidos grasos (Fatty acid metil ester)
GHG – Gases invernadero (Green House Gas)
Mha – Millones de hectáreas
NADPH - Nicotinamida Adenina Dinucleótido fosfato oxidada
Nitrato – Solución de nitrato
PUFAs – Ácidos grasos poliinsaturados
Redox – propiedades óxido reducción
TAG – Triacilglicéridos
TFF – Filtración de flujo tangencial (Tangential flow filtration)
u.a. – unidades arbitrarias
µ - tasa de crecimiento específica
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1. Introducción
1.1. Biodiesel como recurso energético
La energía juega un importante rol en nuestras vidas, ya que muchas
actividades son realizadas gracias a algún recurso energético. Debido a tal
importancia, la energía es un factor vital en el desarrollo socioeconómico de la
población humana, siendo por este motivo, un buen estimador del estándar de
vida en los países (Demirbas & Demirbas, 2010). Los recursos energéticos
pueden ser almacenados, convertidos y amplificados para su uso en una
variedad de formas (combustibles líquidos, gas, electricidad, etc.); siendo una
constante preocupación para investigadores y políticos. (Demirbas & Demirbas,
2010).
Los recursos energéticos globales pueden ser clasificados en no
renovables y renovables. El primer grupo incluye combustibles fósiles (carbón,
petróleo, gas natural, alquitrán, aceite de esquisto y arenas de esquisto), y
material fisible en que el principal recurso de energía es el uranio y el torio.
Las fuentes de energía renovable incluyen, biomasa, agua, calor interno de la
Tierra, sol y viento (Gupta & Demirbas, 2010).
Actualmente, más del 70% de los requerimientos globales totales de
energía son satisfechos por combustibles fósiles, particularmente en
transporte, manufactura y calefacción domestica (Chisti, 2007; Gouveia &
Oliveira, 2009; Demirbas & Demirbas, 2010;). Esta dependencia daría lugar al
incremento de las emisiones de dióxido de carbono a la atmosfera a través de
los productos de la combustión, lo que podría incrementar el efecto de gases
invernadero (GHG) (EIA, 2011). Por otro lado, el limitado suministro de
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combustibles fósiles ha generado constantes fluctuaciones en su precio, y de
esta forma ha incrementado la necesidad de encontrar nuevas alternativas de
energía (Chisti, 2007; Fonseca, 2008; Hu et al, 2008).
En 1997, fue celebrado el Protocolo de Kyoto en el marco de la
Convención de las Naciones Unidas por el Cambio Climático (UNFCCC), el cual
reunió a 160 Estados miembros y países en vía de desarrollo. En la convención
acordaron algunas medidas para estabilizar los GHG y reducir en un 5,2% las
emisiones de gases invernadero, de acuerdo a las emisiones del año 1990. La
reducción debería llevarse a cabo desde el año 2008 hasta el año 2012. Algunas
de las medidas fueron las siguientes: 1) Reducción de las emisiones domesticas
de GHG en países industrializados; 2) Incrementar la investigación y desarrollo
de nuevas tecnologías, eficiencia energética y energía renovable; 3) Imponer
tasas por el uso de energía y emisión de GHG; entre otras (Gupta & Demirbas,
2010). De acuerdo a esto, nuevos recursos energéticos podrían ser una solución
viable para cumplir los requerimientos del Protocolo de Kyoto, y en este
sentido, muchos países han comenzado a demostrar gran interés sobre los
diferentes tipos de energías renovables.
Los biocombustibles son un tipo de energía renovable y una prometedora
solución alternativa para la disminución de la contaminación provocada por
combustibles de origen fósil. Algunos biocombustibles como el biodiesel y el
bioetanol tienen mejores propiedades que los combustibles fósiles porque son
biodegradables, no tóxicos, esencialmente libres de sulfuros y compuestos
aromáticos (Fonseca, 2008). Por esta razón, ha habido varios intentos de
producir biocombustibles de origen vegetal. Entre ellos podemos destacar la
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colza, soya, palma, girasol, coco, semillas de lino, algodón y jatrofa (Singh &
Singh, 2010). Pero estas materias primas, que son llamadas combustibles de
primera generación, tienen el problema de competir con la demanda alimentaria
de esos u otros vegetales cultivados en terrenos agrícolas (Wijffels &
Barbosa, 2010). Esta controversia se debe principalmente al riesgo de
aumentar excesivamente los precios de algunos alimentos, causando un impacto
en los mercados alimentarios globales y la escasa disponibilidad que pueden
provocar, especialmente en las regiones económicamente más vulnerables del
mundo. Por otro lado, la demanda por biocombustibles podría causar una
sustancial presión adicional en los recursos naturales, con potenciales daños al
medio ambiente (p.ej. degradación de terrenos arables) y eventualmente
consecuencias sociales (Wijffels & Barbosa, 2010). Una estimación hecha por
Brennan & Owende (2010); determinaron que sobre el 1% (14 millones de
hectáreas) de terrenos agrícolas disponibles en el mundo, podrían ser usados
para la producción de biocombustibles, aunque es suficiente sólo para cumplir
con el 1% de los requerimientos necesarios para el transporte mundial. Es
evidente que incrementar la producción cerca del 100% es inviable, debido a las
graves repercusiones en el suministro de alimentos y las grandes extensiones
de terreno requeridas para la producción.
Una evaluación a partir del Programa de las Naciones Unidas (UNEP) en
2010, estimó que la producción de energía renovable suministró alrededor de
un 16% del consumo mundial de energía en el año 2009, donde los
biocombustibles líquidos proporcionaron aproximadamente el 0,6% del
combustible mundialmente requerido (Figura 1.1). Dentro de estos
biocombustibles, el bioetanol es el más representativo y llegó a 86 billones de
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litros en el año 2010, en comparación a los 19 billones de litros de biodiesel
producidos en el mismo año (Figura 1.2). Estas estimaciones incluyen materiales
de desecho vegetal, es decir, los biocombustibles de segunda generación.
Los biocombustibles de segunda generación están orientados a la producción de
combustibles a partir de materiales de desecho vegetal tanto de plantas
utilizadas con fines energéticos como residuos agrícolas, además de residuos
de origen forestal y maderero (Fonseca, 2008). Estas materias primas tienen
la ventaja de no competir con los cultivos de vegetales para la producción de
alimentos y emiten menos gases de efecto invernadero que los combustibles
fósiles. Sin embargo, la tecnología para la conversión en la mayoría de los casos
no ha alcanzado la escala para la explotación comercial y además, es necesario
combustible fósil para convertir la materia prima en biocombustible (Demirbas
& Demirbas, 2010).
Figura 1.1. Energía Renovable global consumida en el año 2009 (Fuente: www.unep.org)
16%
Combustibles fósiles 81%
Renovables 16%
Nuclear 2,8%
Viento/solar/biomasa/geotérmica/Generación de energía 0,7%
Biocombustibles 0,6%
Biomasa/solar/agua caliente geotérmica/ Calefacción 1,5%
Energía Hidroeléctrica 3,4%
Biomasa tradicional 10%
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Las microalgas son consideradas como fuentes de combustibles de
tercera generación y una de las materias primas más prometedoras para la
obtención de biocombustibles (Chisti, 2007). La productividad de la conversión
de dióxido de carbono en carbonos ricos en lípidos, a través de organismos
fotosintetizadores acuáticos, es superior a las obtenidas por cultivos de
plantas oleaginosas terrestres (Stephenson et al., 2010). Por otra parte, las
algas tienen un rápido crecimiento, mayor que el de las plantas terrestres y
algunas pueden llegar a tener hasta el 50% de su peso en lípidos (Stephenson
et al., 2010).
Figura 1.2. Producción de Etanol y Biodiesel entre los años 2000–2010 (Fuente: www.unep.org)
0,8 1 1,4 1,9 2,4 3,76,6
1116 17 1917 19 21
2429 31
39
50
66
73
86
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Billones
de litros
Biodiesel
Etanol
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El rendimiento de lípidos por área de cultivo de microalgas podría ser
muy superior al rendimiento de los mejores cultivos de semillas oleaginosas
(Rodolfi et al., 2009). Se estima que 40 toneladas de lípidos por hectárea por
año, pueden ser producidas a base de diatomeas, que rinden entre 7 y 31 veces
más que el mejor rendimiento de aceite vegetal (aceite de palma), y 200 veces
superior a la planta de soya en tierras arables (Wijffels & Barbosa, 2010). La
Tabla 1.1, adaptada desde Chisti (2007), muestra la productividad de las
diferentes fuentes de lípidos para combustible en litros por hectárea. En el
caso de las microalgas, la eficiencia en la productividad de lípidos va desde 30
a 70% (peso seco), con un uso de terreno de 4,5 a 2 Mha respectivamente,
para satisfacer el 50% del requerimiento de combustible en el transporte de
EE.UU. Otras ventajas de las microalgas, en comparación a las plantas
superiores son: 1) las microalgas crecen en un medio acuático, pero necesitan
menos agua que los cultivos terrestres; 2) las microalgas pueden ser cultivadas
en agua dulce, agua salada o salobre en tierras no cultivables, y 3) no compiten
por los recursos con la agricultura convencional, además la producción de
biomasa de microalgas puede ser combinada con la bio-fijación directa de CO2
por las mismas microalgas (Rodolfi et al., 2009; Campbell et al., 2011).
La desventaja de las microalgas en la actualidad, es la baja productividad
de lípidos. De acuerdo con Wijffels & Barbosa (2010), si el biodiesel fuese
suministrado a través de microalgas, 9,25 millones de hectáreas (casi la
superficie de Portugal) sería necesario para abastecer el mercado europeo,
asumiendo una productividad de 40.000 litros por hectárea al año en sistemas
de cultivo eficientes. Esta productividad se basa en una conversión de energía
solar del 3% de la biomasa (máximo teórico es del 9%) y un contenido de lípidos
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del 50% de la biomasa, en las condiciones solares de Portugal. Por esta razón,
es necesario encontrar cepas de microalgas con altas concentraciones de
lípidos desarrollando tecnologías que ayuden a maximizar su productividad. De
esta manera, el aumento de la producción al menos 3 órdenes de magnitud y la
disminución de los costos por un factor de 10 (Wijffels & Barbosa, 2010),
podría ser una solución para que las microalgas compitan en el mercado de la
energía renovable.
Tabla 1.1. Comparación de algunos recursos para biodiesel en productividad de lípidos (L/ha), y
área necesaria (M ha). Adaptado de Chisti (2007).
CultivoRendimiento de
lípidos (L/ha)Área de terreno necesario (M ha)a
Maíz 172 1540
Soya 446 594
Canola 1190 223
Jatrofa 1892 140
Coco 2689 99
Aceite de palma 5950 45
Microalga b 136900 2
Microalga c 58700 4,5
a. Para suplir el 50% de todo el transporte necesario en Estados Unidos
b. 70% lípidos (por peso seco) en biomasa
c. 30% lípidos (por peso seco) en biomasa
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1.2. Biología de microalgas
Las microalgas pueden ser clasificadas como células procariotas
(cianobacterias) o eucariotas. Las células procariotas carecen de organelos
limitados por membranas (p. ej.: plastidios, vacuolas, núcleos y cuerpos de
Golgi; Becker, 1994). Las microalgas eucariotas se clasifican en una variedad de
clases definida principalmente por su ciclo de vida, estructura celular básica y
su pigmentación (Tomaselli, 2004). La clasificación sistemática de las algas
sobre la base de los componentes de sus pigmentos, ha sido reestudiada por
Cavalier-Smith (2010), quien propone incluir a todas las algas dentro del reino
Chromista, compartiendo como característica común poseer clorofila c
contenida en plastidios situados en la membrana periplastidica en el interior
del lumen del retículo endoplasmatico rugoso (RER); y poseer pelos bi o
tripartitos en uno o ambos cilios. El reino Chromista estaría dvidido en:
Heterocontophytas, Haptophytas, Cryptomonadas. Sin embargo, se ha incluido
tres grupos más: Alveolata, Rhizaria y Heliozoa (Cavalier-Smith, 2010).
Se ha estimado que existe alrededor de 300.000 especies de microalgas
y su diversidad es mucho mayor que las plantas terrestres (Scott et al., 2010).
Se desarrollan en diversos hábitats, tales como agua dulce, agua salobre, y
agua de mar. También pueden adaptarse a diferentes temperaturas y
condiciones extremas de pH, además muchas microalgas presentan un rápido
crecimiento en condiciones óptimas (Chen et al, 2009). Las microalgas poseen
diversas características, tales como ser ricas en almidones, lípidos, proteínas,
siendo capaces de acumular metabolitos secundarios como son los carotenoides
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(Lee, 2008) y algunos quimiopreventivos de cáncer (Amin, 2008, Custódio et al.,
2012).
Las microalgas pueden ser autotróficas, heterotróficas o mixotróficas
(Lee, 2004). Las formas autotróficas requieren sólo compuestos inorgánicos
tales como CO2, sales (nitratos, fosfatos, microelementos y oligoelementos), y
una fuente de energía luminosa para el crecimiento. Las especies
heterotróficas no fotosintéticas, requieren de una fuente externa de
compuestos orgánicos como fuente de energía. Las especies mixotróficas
pueden adquirir energía tanto de la fotosíntesis como de nutrientes orgánicos
exógenos (que podría ser glucosa) y de forma simultánea fijar carbono
inorgánico (CO2) como fuente de energía (Lee, 2004, Xiong et al., 2010).
Algunas especies de microalgas tienen la capacidad de cambiar de estilo
de vida, desde autotrofía a heterotrofía y en algunos casos a mixotrofía (Lee &
Shen, 2004; Kumar et al., 2010).
1.2.1. La fotosíntesis.
La luz del sol es la fuente más común de energía para las microalgas. En
las algas verdes autotróficas (Chlorophyta), la fotosíntesis es clave para la
supervivencia (Masojídek et al., 2004). Fundamentalmente, en el proceso de
fotosíntesis, la radiación solar y el CO2 absorbido por los cloroplastos es
convertido en adenosina trifosfato (ATP) y O2, que es energía utilizable en
respiración a nivel celular, para elaboración de macromoléculas (carbohidratos,
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proteínas, lípidos, etc.) y en último término, para llevar a cabo el crecimiento
(Brennan & Owende, 2010).
El mecanismo para realizar la fotosíntesis es a través del cloroplasto,
que contiene una serie de vesículas aplanadas o tilacoides y en algunos casos
uno o más pirenoides. Las reacciones luminosas fotosintéticas se encuentran en
las membranas de los tilacoides (Masojídek et al., 2004) donde existe una
serie de pigmentos tales como, clorofila a, clorofila b y xantófilas
(carotenoides oxigenados) (Lee, 2008). Los tilacoides se componen
principalmente de dos lípidos: mono y digalactosilglicerol, dispuestos en una
doble capa, donde las proteínas se encuentran embebidas formando un mosaico
líquido (Masojídek et al., 2004; Lee, 2008).
La fotosíntesis se realiza generalmente en dos etapas separadas: la fase
luminosa y la fase oscura. En la fase luminosa, los fotones de luz solar son
capturados directamente por la clorofila y pigmentos accesorios. La luz
produce las reacciones de transporte de electrones provenientes del agua,
desde un estado energético más alto hacia uno más bajo, hasta ser
convertirdas en ATP, NADPH2 reducido y oxígeno molecular (Chen et al.,
2009).
En la fase oscura, el CO2 se convierte en hexosa con ayuda de la energía
en forma de ATP y el NADPH generados durante la fase luminosa, siguiendo los
pasos que aparecen en la Figura 1.3.
En general, en las algas existen dos vías de carboxilación para convertir
el CO2 en carbono orgánico: la vía C3 y C4. En la vía C3, la enzima RuBisCo
(ribulosa-bifosfato carboxilasa-oxigenasa) cataliza la reacción de ribulosa
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bifosfato (RuBP) + CO2 + HO2 a 2 ácido fosfoglicérido (PGA), un compuesto de
3 carbonos que entra en el ciclo de Calvin, convirtiéndose en carbohidrato
(Raven et al., 1996; Masojídek et al., 2004). La mayoría de las algas y las
plantas superiores, estudiadas, emplean la vía C3 para fijar el carbono
inorgánico (Raven et al., 1996). Algunas algas y plantas evolucionaron a la vía
alternativa C4 donde el CO2 se convierte primero en un compuesto de cuatro
carbonos que libera CO2 para la fijación glicerofosfato por la acción de la
enzima RuBisCo (Figura 1.3). Posterior, a la conversión del CO2 en
carbohidratos, otras vías de síntesis pueden llevarse a cabo, como la
lipogénesis que por la vía del acetil CoA puede transformar las cadenas de
carbono en ácidos grasos y posteriormente en triacilgliceridos (Masojídek et
al., 2004; Lee, 2008).
Las microalgas tienen una gran capacidad de fijar CO2 desde la
atmósfera, desde algunos gases emanados por los procesos químicos
industriales y desde algunos carbonatos solubles (por ejemplo, NaHCO3 y
Na2CO3) (Kumar et al., 2010).
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Figura 1.3. Fase oscura en el Ciclo de Calvin-Benson. La Ribulosa-P es fosforilada por el ATP. A
continuación, un CO2 se incorpora para formar Glicerato-P, se transfiere otro P a partir de
ATP y forma Glicerato-bi-P. El NADPH2 incorpora un H2 y forma gliceraldehído-P, donde se
divide en Triosa-P para formar cualquier carbohidrato (Adaptado de Masojídek et al., 2004).
En condiciones heterotróficas o mixotróficas, algunas especies de
microalgas pueden metabolizar carbonatos a partir de una variedad de
compuestos orgánicos, incluyendo glucosa, como el caso de Chlorella
protothecoides (Xiong et al., 2010), melaza y ácido acético, así como los
compuestos presentes en las aguas residuales y el petróleo (Lee, 2004; Kumar
et al, 2010)
Ribulosa-P
Ribulosa-bi-P
CO2
NADPH2
Lípidos Aminoácidos
Glicerato-P
Glicerato-bi-P Gliceraldehído-P
Hexosa-P
Carbohidratos
NADP
ATP
Combinación de C3-, C4-, C5-, C6-, y C7-, azúcar fosforilada
ADP
Productos de 3C (Triosa –P)
ATP
ADP
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1.2.2. Nutrientes en las microalgas
Los nutrientes en las microalgas son esenciales para el correcto
desarrollo y crecimiento celular. Los nutrientes pueden dividirse en
oligoelementos, microelementos y vitaminas (Grobbelaar, 2004).
El nitrógeno es un importante componente para el crecimiento de las
microalgas y puede ser incorporado a través de amonio o nitratos disueltos en
el medio. El nitrógeno forma parte de los ácidos nucleicos y de las proteínas,
además está directamente relacionado con el metabolismo primario
(Grobbelaar, 2004). En cianobacterias cultivadas bajo condiciones limitadas de
nitrógeno, el efecto más llamativo es la degradación activa y específica de los
ficobilisomas (Grossman et al., 1993), causando finalmente la disminución del
crecimiento celular (Damiani et al., 2010). Sin embargo, varios estudios
demuestran que la limitación o privación de nitrógeno en cultivos de microalgas
de varios grupos taxonómicos, causan una mayor biosíntesis y acumulación de
lípidos (Illman et al, 2000; Gouveira & Oliveira, 2009; Converti et al, 2009;
Kumar et al, 2010; Damiani et al, 2010; Chen et al, 2011).
La limitación de nitrógeno podría causar tres cambios: la disminución del
contenido celular en la membrana de los tilacoides, la activación de la acil
hidrolasa que puede degradar glicolípidos, y la estimulación de la hidrólisis de
fosfolípidos (Xin et al., 2010). Estos cambios pueden activar la diacilglicerol
acil-transferasa, que convierte acil-CoenzimaA en triglicéridos (TAG),
aumentando el contenido intracelular de los ácidos grasos (Takagi et al., 2000).
Sin embargo, la estrategia para cultivar microalgas con un aporte inicial de
nitrógeno suficiente para el crecimiento, seguido de la privación de nitrógeno
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en el medio de cultivo, sólo se probó recientemente en Chlorella minutissima,
por Tang et al, (2011) para obtener una alta generación de biomasa y un alto
contenido de lípidos. Este enfoque podría ser una buena estrategia para lograr
un alto rendimiento en la producción de lípidos.
El fósforo es otro nutriente muy importante en el crecimiento de
microalgas (Grobbelaar, 2004). Juega un papel principal en procesos
metabólicos celulares como la incorporación de ortofosfato (Pi) para la
formación de nucleótidos trifosfatos (ATP) altamente energéticos, generados
por fotofosforilación en los cloroplastos, fosforilación oxidativa en las
mitocondrias y el transporte de electrones de esos organelos (Cembella et al.,
1984). Además el fósforo participa en la formación de enzimas, proteínas,
polisacaridos, polinucleótidos, glicerolípidos, glicolípidos, fosfolípidos y otros
componentes estructurales necesarios para el crecimiento y desarrollo normal
de las microalgas (Cembella et al., 1984). Sin embargo, no todos los
componentes del fósforo son biodisponibles (p. ej., aquellos en combinación con
iones de metal) y por lo general deben ser suministrados en el medio de cultivo
(Lee, 2004).
El agotamiento del fósforo en el medio de cultivo ha sido reportado
como un aumento de ß-caroteno en células de Dunaliella (Phadwal & Singh,
2003), aunque este aumento no es superior en comparación con el aumento
reportado por la deficiencia de nitrógeno.
El hierro es un oligoelemento esencial y desempeña un papel importante
en la composición bioquímica celular debido a sus propiedades oxido- reducción
(Raven et al., 1996; Lee, 2004). Tiene una implicancia en procesos
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fundamentales, como la fotosíntesis, la respiración, la fijación de nitrógeno y la
síntesis de ADN. El exceso de hierro se cree que genera estrés oxidativo
(Estevez et al., 2001), pero la limitación de hierro está asociada con una amplia
reorganización del sistema fotosintético estudiada en Dunaliella salina
(Varsano et al., 2003), produciendo la contracción de los cloroplastos y la
disminución de las membranas de tilacoides apiladas. También la C-ficocianina y
la clorofila a, pueden ser degradadas cuando el hierro es limitante (Lee, 2004).
Pocos estudios se han realizado para demostrar si el agotamiento de hierro
aumenta la concentración de lípidos en las microalgas (Liu et al., 2008),
pudiendo ser un elemento clave en dicho aumento.
Otros metales traza (Mg, Ca, Mn, Zn Cu y Mb) y vitaminas, suelen
complementar el medio de cultivo para reforzar el crecimiento de las
microalgas (Lee, 2004).
1.2.3. Lípidos a partir de microalgas
Las microalgas son capaces de adaptarse en un amplio rango de
condiciones ambientales y esto se refleja en la excepcional variedad de
patrones lipídicos, así como en la serie de compuestos inusuales que pueden
sintetizar (Hu et al, 2008; Harwood & Guschina, 2009).
Los lípidos son clasificados de acuerdo a su polaridad: los no-polares
(lipofílicos), que dependen solo de las cadenas de carbono (ácidos grasos); y los
polares (hidrofílicos) con grupos relacionados (grupos carboxílicos, alcoholes,
carbohidratos, etc.; Griffiths & Harrison, 2009). No obstante, dentro de los
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lípidos se pueden incluir, ésteres de cera, esteroles e hidrocarburos, así como
derivados de isoprenos, tales como tocoferoles, carotenoides, terpenos,
quinonas y pigmentos que contienen pirrol, como las clorofilas (Raven et al.,
1996; Griffiths & Harrison, 2009).
El grupo más importante para el consumo humano y producción de
biodiesel son los lípidos no polares (lípidos neutros), donde podemos encontrar
los triglicéridos y ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), mientras que los
lípidos polares son esencialmente glicéridos en que uno o más ácidos grasos han
sido sustituidos por un grupo polar, por ejemplo; fosfolípidos y glicolípidos. En
algas eucariotas es posible encontrar cadenas de carbonos muy largas (>20C),
tales como los ácidos grasos poliinsaturados eicosapentaenoico,
docosahexaenoico y el ácido araquidónico (Harwood & Guschina, 2009).
También se encuentran los ácidos grasos de cadena media (10C -14C), y de
cadena larga (16C -18C), importantes para la producción de biocombustibles.
La biosíntesis de ácidos grasos ocurre principalmente en el cloroplasto
(Hu et al, 2008; Chen et al, 2009), cuyo paso principal es la carboxilación de
acetil CoA dependiente de ATP para su conversión en malonil-CoA (Figura 1.4).
La reacción está catalizada por la enzima acetil-CoA carboxilasa clave en el
proceso, ya que compromete el aporte de acetil-CoA hacia la biosíntesis de
lípidos. La reacción anterior es seguida por ciclos de adición descarboxilativa
de malonil-CoA a unidades acilo y β-reducción, catalizados por el sistema ácido
graso sintetasa, hasta producir moléculas de 16C y 18C saturadas (Garibay
Hernández et al., 2009; Huang et al., 2010).
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SÍNTESIS DEÁCIDOS GRASOS
NADPHATP
TRIACILGLICÉRIDO
Diacilglicérido
Fosfatidilcolina
Ácido fosfatídico
Fosfolípidos
Ácido Lisofosfatídico
Retículo Endoplásmico
Glicerol 3-PAcil-CoAAcil-ACP
CICLO DE CALVIN
Piruvato
CO2
H2O
Luz
Cloroplasto
Ácido 3 -fosfoglicérido
Citoplasma
Los ácidos palmítico (16:0) y oleico (18:1cis-9) son los precursores de las
moléculas poliinsaturadas, producidas mediante mecanismos de desaturación
aerobia y elongación.
Por otro lado, ha sido propuesto que la biosíntesis de triacilgliceridos
(TAG) en las algas, sucede en el citosol y en el retículo endoplásmico,
esencialmente a través de la catálisis de acil-transferasas (Hu et al., 2008;
Garibay Hernández et al., 2009; Huang et al., 2010).
Figura 1.4. Síntesis de ácidos grasos en los cloroplastos y triacilglicéridos en el citoplasma.
Adaptado a partir de Garibay Hernández et al. (2009).
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H2-C-O-PO3
H-C-OH
H2-C-OH
H2-C-O-PO3
H-C-OH
H2-C-O-acil (1)
H2-C-O-PO3
H-C-O-acil (2)
H2-C-O-acil (1)
H2-C-O-OH
H-C-O-acil (2)
H2-C-O-acil (1)
H2-C-O-acil (3)
H-C-O-acil (2)
H2-C-O-acil (1)
G-3-P Liso-P PA DAG TAG
1
Acil (1)-CoA
2 3
Acil (2)-CoA
4
PO4Acil (3)-CoA
Fosfolípidos Fosfatidilcolina (PC)
Los ácidos grasos producidos en el cloroplasto son transferidos de manera
secuencial desde la CoA a las posiciones 1, 2 del glicerol-3-fosfato, resultando
en la formación de ácido fosfatídico (Figura 1.5), el cual es hidrolizado por la
enzima fosfatidil fosfatasa para formar diacilglicerol (DAG), y finalmente con
la transferencia a la posición 3 de un ácido graso proveniente de la CoA, se
completa la formación de TAG (Hu et al., 2008; Huang et al., 2010).
Figura 1.5. Esquema simplificado que muestra la ruta de biosíntesis de triglicéridos en las algas
catalizada por las enzimas: (1) glicerol-3-fosfato aciltransferasa citosólica; (2) ácido liso-acil
fosfatídico transferasa; (3) ácido fosfatídico fosfatasa; y (4) diacilglicerol acil -transferasa.
Adaptado de Roessler et al., 1994 en Huang et al., (2010).
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En condiciones normales de crecimiento, los lípidos de microalgas en su
mayoría están presentes en forma de fosfolípidos en las membranas celulares
(Griffiths,& Harrison, 2009). Sin embargo, algunas microalgas cuando son
expuestas a condiciones de estrés (p. ej., falta de nutrientes o alta intensidad
de luz) podrían acumular lípidos en forma de triglicéridos en los llamados
glóbulos lipídicos (Wijffels & Barbosa, 2010).
A pesar de haber sido reportados altos contenidos lipídicos en algunas
cepas de microalgas (Tabla 1.2), la eficiencia en la producción de biodiesel aun
debe ser mejorada (Chisti, 2007). Por este motivo, el aumento de la
concentración lipídica mediante estrés abiótico (luz, temperatura, nutrientes,
etc.) es una alternativa promisoria que actualmente está siendo evaluada por
varios autores (Gouveira & Oliveira, 2009; Hu et al., 2008; Converti et al.,
2009; Kumar et al., 2010; Damiani et al, 2010, Chen et al., 2011).
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Tabla 1.2. Especies de microalgas marinas y de agua dulce con potencial en biodiesel. Adaptado
de Rodolfi et al., (2009).
Microalga Contenido lipidico
(% biomasa)
Especies marinas
Tetraselmis suecica F&M-M35 12,9
Tetraselmis sp. F&M-M34 14,7
Nannocloropsis sp. F&M-M24 30,9
Ellipsoidion sp. F&M-M31 27,4
Isochrysis sp. (T-ISO) CS 177 22,4
Pavlova lutheri CS 182 35,5
Skeletonema sp. CS 252 31,8
Thalassiosira pseudonana CS 173 20,6
Skeletonema costatum CS 181 21,1
Chaetoceros muelleri F&M-M43 33,6
Chaetoceros calcitrans CS 178 39,8
Especies de agua dulce
Chlorococcum sp. UMACC 112 19,3
Scenedesmus sp. DM 21,1
Chlorella sorokiniana IAM-212 19,3
Chlorella vulgaris CCAP 211/11b 19,2
Monodus subterraneus UTEX 151 16,1
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1.2.4. Actividad antioxidante en Microalgas
La producción de radicales libres (p. ej. superóxido, óxido nítrico y
radicales hidroxilo) y otras especies reactivas (p. ej. peróxido de hidrógeno,
peroxinitrito, y el ácido hipocloroso), ocurre en las células eucariotas,
principalmente como resultado del metabolismo aeróbico (Fang et al., 2002;
Perry et al., 2002). Los radicales libres son especies químicas altamente
inestables por la presencia de un electrón impar en una de sus órbitas y
generalmente están compuestas de oxígeno (Fang et al., 2002). Cumplen
funciones críticas en los organismos, tales como la transducción de señales, la
transcripción de genes y la regulación de guanilato ciclasa soluble. Además, los
radicales oxidativos y precursores oxidativos en forma de O2 y H2O2
respectivamente, son altamente tóxicos, estando encargados de unirse y dar
muerte a agentes extraños (ej. bacterias y virus) (Cheeseman & Slater, 1993).
Otro ejemplo es el óxido nítrico (NO), que es una de las moléculas de
señalización más extendida y participa en prácticamente todas las funciones
celulares en el cuerpo (Fang et al., 2002). Los niveles fisiológicos de NO
producidos por las células endoteliales son esenciales para la regulación de la
relajación y la proliferación de células vasculares en la musculatura lisa, la
adhesión de leucocitos, la agregación plaquetaria, la angiogénesis, la trombosis,
el tono vascular, y la hemodinámica. También el NO producido por las neuronas
actúa como un neurotransmisor, y el NO generado por macrófagos activados es
un importante mediador de la respuesta inmune (Fang et al., 2002). Sin
embargo, los radicales libres y otras especies reactivas, actúan como oxidantes
e inhibidores de las enzimas que contienen un núcleo de hierro-azufre,
causando la oxidación de biomoléculas como proteínas, aminoácidos, lípidos y
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ADN, lo que conduce a la lesión celular y muerte (Cheeseman & Slater, 1993;
Perry et al., 2002, Fang et al., 2002). No obstante, las células han desarrollado
una gama completa de defensas antioxidantes para prevenir el aumento en la
formación de radicales libres o limitar sus efectos perjudiciales. Algunas de
ellas son: enzimas para descomponer peróxidos, proteínas para metales de
transición y una serie de compuestos que inhiben la acción de los radicales
libres (Fang et al., 2002).
El aumento de radicales libres en las células humanas causado por estrés
oxidativo, puede deberse al envejecimiento celular, la contaminación ambiental,
el tabaquismo, la exposición a la radiación solar, las dietas ricas en grasas
saturadas y pobres en proteínas, vitaminas y minerales (Fang et al., 2002). El
estrés oxidativo podría estar asociado a muchas enfermedades
neurodegenerativas crónicas (p. ej., demencia con cuerpos de Lewy, Parkinson,
Huntington, Alzheimer, etc.), principalmente en la población anciana (Li et al.,
2007; Pulok et al., 2007). Por otra parte, enfermedades cardiovasculares,
cáncer y cataratas han evidenciado experimental y epidemiológicamente la
participación de radicales libres (Li et al., 2007).
Con respecto a las enfermedades neurodegenerativas como la
enfermedad de Alzheimer (Alzheimer disease, AD), el daño histopatológico del
estrés oxidativo, se debe a la sobrerregulación de las enzimas antioxidantes
(Perry et al., 2002). Las características patológicas de la AD incluyen los
depósitos del péptido beta amiloide (Aβ) en el plasma de plaquetas seniles, la
formación de nudos de neurofibrillas intracelulares, y la pérdida de neuronas
basales colinérgicas del cerebro anterior, dando lugar a reducciones en los
marcadores colinérgicos, como los niveles de acetilcolina, la
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acetilcolintransferasa y receptores muscarínicos y nicotínicos de acetilcolina
(Weinreb et al., 2011). La función principal de la acetilcolinesterasa (AChE) es
poner término a la transmisión de impulsos nerviosos en la sinapsis colinérgica
por la rápida hidrólisis de la acetilcolina (ACh); por lo tanto, la intervención de
la acción de la acetilcolinesterasa y sus efectos mediante compuestos
antioxidantes, serviría como una estrategia para el tratamiento de la
enfermedad de Alzheimer (AD), entre otras enfermedades
neurodegenerativas (Fang et al., 2002; Pulok et al., 2007).
La medicina actual basada en la inhibición de la AChE, posee ciertos
efectos adversos sobre los pacientes, como disturbios gastrointestinales y
problemas con la biodisponibilidad (Pulok et al., 2007). Por este motivo, algunos
estudios han sido enfocados en la pesquisa de antioxidantes capaces de
contrarrestar los efectos de los radicales libres en perjuicio de la actividad de
la acetilcolina y sin causar efectos adversos (Custodio et al., 2012)
Un antioxidante sintético ampliamente utilizado, es el BHT o butil
hidroxitolueno (E-321) procedente de la industria petrolera. Se utiliza
prácticamente siempre mezclado con el BHA (Li et al., 2007; Sasidharan &
Menon, 2011). Actualmente ha sido detectado su posible toxicidad y potencial
efecto cancerígeno. Por este motivo, existe un interés en todo el mundo por
encontrar nuevos y seguros antioxidantes provenientes de fuentes naturales,
principalmente de origen vegetal y recientemente de algas y microalgas (Li et
al., 2007), por su alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados, -caroteno,
vitaminas, compuestos fenólicos y otros pigmentos, los cuales poseen
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importantes propiedades antioxidantes (Miranda et al., 1998; Li et al., 2007;
Ibañez et al., 2008).
Las microalgas tienen un amplio potencial de compuestos antioxidantes,
debido a su gran diversidad, siendo mayor que el de plantas terrestres.
Actualmente las microalgas forman parte del grupo de alimentos funcionales
por la presencia de compuestos con propiedades antibacteriales, antivirales,
antifúngicas y además con actividad antioxidante (Ibañez et al., 2008). No
todos los grupos de microalgas pueden ser usados como fuentes naturales de
antioxidantes, debido a su gran variación en la concentración de compuestos
objetivo, rendimiento, facilidad de cultivo, entre otros factores (Li et al.,
2007). Existen pocos estudios acerca de la capacidad antioxidante de
compuestos fenólicos en microalgas (Li et al., 2007, Custodio et al., 2012),
siendo los compuestos fenólicos de mucha importancia en el control de
enfermedades como el Alzheimer (Dillard & German, 2000). Sin embargo, la
relación entre la concentración de compuestos fenólicos y la actividad
antioxidante en microalgas no ha sido bien establecida (Custodio et al., 2012).
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1.3. Producción de Microalgas a gran escala
1.3.1. Sistemas de cultivo
La producción masiva de biomasa microalgal sin duda tiene un costo
económico mayor que la producción de otros recursos vegetales para producir
biocombustibles (Chisti, 2007). Principalmente el cultivo de microalgas ha sido
llevado a cabo bajo dos tipos de sistemas de cultivo: sistemas abiertos o
tanques de cultivo y sistemas cerrados o fotobiorreactores (Jorquera et al,
2010; Harun et al., 2010).
Dentro de los sistemas abiertos existe una gran variedad de piscinas o
tanques de cultivo, de diverso material y diseño (Figura 1.6). Un ejemplo son los
que tanques tipo canal que se caracterizan por poseer baja profundidad y
paletas, que ayudan a la mezcla para evitar puntos anóxicos y poca
disponibilidad de la luz dentro del sistema. Alrededor del 90% de la producción
comercial mundial de microalgas se hace a través de sistemas abiertos, debido
al bajo costo (Van Beilen, 2010). Sin embargo, los sistemas abiertos son menos
favorables por proporcionar poco control frente a la contaminación por polvo,
microorganismos, etc. (Tredici, 2004).
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Figura 1.6. Sistemas de cultivo abiertos: A) Tanques tipo canales; B) Tanques circulares; C)
Tanques sin agitación. Adaptado de Chen et al., (2009)
Los sistemas cerrados o fotobiorreactores (Figura 1.7), generalmente
son tubos o placas planas en los cuales pueden ser controlados parámetros
como nutrientes, temperatura, CO2 disuelto y pH (Chen et al, 2009), siendo en
este sentido, la ventaja comparativa frente a los sistemas abiertos.
Figura 1.7. Sistemas de cultivo tipo fotobioreactores de paneles: A) sumergidos, prototipo de
Bélgica. B) sumergidos, prototipo de USA. C) Paneles verdes, prototipo de Italia. Adaptado de
Wijffels & Barbosa (2010).
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A pesar de que los fotobioreactores son más caros que los sistemas
abiertos, son capaces de tener una mayor productividad por área de cultivo tal
como se observa en la Tabla 1.3.
Tabla 1.3. Productividad comparada entre sistemas de cultivo cerrado (fotobioreactor) y
sistema de cultivo abierto (estanques tipo canal). Adaptado de Chisti., (2007)
Variable Fotobiorreactor Tanques
tipo
Raceway
Producción anual de biomasa
(kg) 100000 100000
Productividad volumetrica (kg
m-1 d-1) 1,535 0,117
Concentración de biomasa en
medio de cultivo (kg m-3) 4 0,14
Rendimiento lipidico (m3 ha-1) 136,9a 99,4a
58,7b 42,6b
Area necesaria (m2) 5681 7828a Basado en 70% de lípidos por peso de biomasa secab Basado en 30% de lípidos por peso de biomasa seca
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1.3.2. Obtención de biomasa microalgal
Actualmente existen varios métodos para la extracción parcial o total
del medio de cultivo en que crecen las microalgas (deshidratación) donde el
producto final es una pasta (Figura 1.8). Las pastas de microalgas son usadas
con fines extractivos de compuestos bioactivos para la industria farmacéutica,
compuestos nutricionales para la industria alimenticia y lípidos para la industria
de biocombustibles. Entre los métodos de deshidratación más usados se
encuentran la floculación, centrifugación y filtración (Harun et al., 2010).
La floculación es un método de deshidratación el cual funciona bajo un
diferencial de cargas, ya que las células microalgales están cargadas
negativamente (Molina Grima et al., 2003). El medio de cultivo de microalgas es
cargado catiónicamente por adición de un medio químico conocido como
floculante. Este compuesto químico catiónico, coagula las algas sin afectar la
composición y toxicidad del producto. Algunos tipos de floculantes incluyen
Al2(SO4)3 (sulfato de aluminio), FeCl3 (cloruro de fierro) y Fe2 (SO4)3 (sulfato
férrico) (Harun et al., 2010).
La centrifugación es el método preferido para el manejo de células
algales (Molina Grima et al., 2003). La centrifugación involucra la aceleración
centrípeta para separar la biomasa algal del medio de cultivo. Una vez
separados, la biomasa algal puede ser drenada para eliminar el exceso de medio
de cultivo (Harun et al., 2010). La centrifugación siendo un método eficiente de
separar la biomasa del medio de cultivo, tiene sus limitaciones. Las altas
fuerzas gravitatorias en el proceso de centrifugación, pueden causar daño a la
estructura celular, y por otra parte el proceso tiene asociado un gran gasto de
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energía cuando los volúmenes son muy altos (Molina Grima et al., 2003; Harun,
et al., 2010; Verma et al., 2010).
La filtración es el método de manejo que puede ser más competitivo en
comparación al resto. Existen varias formas de filtración, como la filtración de
punto final, microfiltración, ultrafiltración, filtración por presión, filtración al
vacío y filtración de flujo tangencial (TFF). Generalmente, en la filtración el
medio algal traspasa una membrana o filtro dejando a la biomasa atrapada, el
líquido es drenado y eliminado, obteniendo como producto final una pasta de
alga (Molina et al., 2003; Harun et al., 2010).
Figura 1.8. Pasta de microalga separada de su medio de cultivo en una cinta transportadora.
Perteneciente a Cyanotech Corporation y adaptada desde Chisti, (2007)
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1.4. Biorefinería de microalgas para producción de Biodiesel
La Biorefinería es una instalación que integra los procesos de conversión
de biomasa a través de tecnología especializada para producir combustibles y
productos químicos de valor agregado, a partir de biomasa: un concepto análogo
a las refinerías de petróleo actuales (Taylor, 2008).
Gran parte de los compuestos provenientes de microalgas y algas pueden
ser convertidos en diferentes formas de combustibles, así como biogás,
combustibles líquidos y gaseosos para transporte, keroseno, etanol,
combustible para aviación y biohidrógeno, a través de la implementación de
tecnologías de proceso como digestión anaeróbica, pirolisis, gasificación,
disrupción catalítica y transesterificación enzimática o química (Subhara,
2010).
El concepto de biorefineria funciona con la noción de que varios
productos de alto valor incrementen su profitabilidad, y así productos como el
biodiesel, ayuden a disminuir los costos energéticos de los procesos de otros
productos y las emisiones de GHG relativos a las instalaciones de plantas
convencionales (Subhara, 2010).
Los pasos claves para la elaboración de biodiesel parten de la extracción
de lípidos crudos desde la biomasa, usando solventes apolares como n-hexano y
también otros solventes que pueden ser n-butanol, etanol, etc., los cuales
pueden cambiar levemente la eficiencia lipídica extraída (Tran et al., 2010).
Posteriormente, los ácidos grasos existentes en forma de triacilglicéridos
(TAG) son transformados en ésteres metílicos de la sigla en inglés (FAME), en
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un proceso llamado transesterificación (Figura 1.9). En este proceso, los TAG
reaccionan con un alcohol (metanol o etanol) para producir glicerol y ésteres
metílicos. Para esta reacción puede ser usado un álcali, un ácido, una enzima o
metanol supercrítico como catalizador (Harun et al., 2010).
En una transesterificación alcalina, el catalizador utilizado puede ser
KOH ó NaOH disuelto en metanol por agitación, siendo esta mezcla bombeada
dentro de un reactor que contiene lípidos. El reactor es mantenido a 70°C por
2 horas con agitación vigorosa hasta terminar la transesterificación. Posterior
a este periodo, se obtienen dos fases, en las cuales, la fase inferior
corresponde a glicerol y la fase superior a ésteres metílicos. Seguidamente a la
etapa de separación de las fases (que puede durar hasta 20 horas), los ésteres
metílicos son cuidadosamente lavados con agua a un 5,5% de su volumen, bajo
agitación. Un nuevo lavado se realiza con agua mas 1 g L-1 de ácido tánico, a un
28% del volumen de los ésteres. El lavado es agitado suavemente con aire, que
cuidadosamente se introduce en el fondo de la capa acuosa. El proceso continúa
hasta que la capa de ésteres se puede distinguir claramente. Después de esto,
la solución acuosa se elimina, y se añade agua a 28% del volumen de ésteres
para el lavado final. En este momento, se obtiene el producto final o biodiesel
(Gupta & Demirbas, 2010).
Siendo la catálisis básica el proceso más usado en la industria del
biodiesel, uno de los inconvenientes que surgen al utilizar KOH ó NaOH, es que
en presencia de agua los TGA pueden causar la reacción de saponización con los
cationes K+ ó Na+, formando jabón. El resultado es la reducción de la eficacia
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del catalizador y la baja conversión de biomasa a biodiesel (Ehimen et al.,
2010).
Entre los catalizadores ácidos se encuentran el ácido sulfúrico, ácido
clorhídrico y ácido sulfónico, los cuales tienen variados tiempos de reacción
(Gupta & Demirbas, 2010). Al igual que en la transesterificación básica, el
catalizador ácido se disuelve en metanol por agitación vigorosa y es bombeada
al reactor que contiene los lípidos. La reacción se lleva a cabo típicamente
entre 30 a 35°C y desde 1 hasta 6 horas.
Tran et al., (2010) realizaron la transesterificación ácida para Chlorella
protothecoides, utilizando diferentes concentraciones de ácido sulfúrico como
catalizador (desde 255% a 100% de H2SO4, basado en el peso real de los
lípidos) y razones molares de metanol:lípidos desde 30:1 a 56:1. La temperatura
en que se llevó a cabo la reacción fue de 90°C. Sin embargo, los resultados no
fueron óptimos ya que según el autor la elevada concentración del ácido y la
alta temperatura, podrían haber oxidado algunos de los lípidos.
Además de los métodos convencionales de transesterificación, también
existe la transesterificación in situ, que según Chen et al. (2009), tiene la
ventaja de ser directa sin tener que extraer y separar los lípidos de la biomasa
previamente. La transesterificación in situ es más efectiva cuando los lípidos
vienen de biomasa seca, y baja la eficiencia cuando la biomasa es más húmeda
(Chen et al., 2009). Un estudio realizado por Ehimen et al, (2010), en Chlorella
spp., indicó que al realizar una transesterificación ácida in situ, obtuvo una
inhibición en el proceso cuando la biomasa presentó un contenido de agua de
115% (w/w) con respecto al peso de los lípidos, por el contrario, obtuvo buenos
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rendimientos a partir de biomasa con una deshidratación del 73%. Debido a
estos antecedentes, el proceso de biorefinería de microalgas para la
conversión a biodiesel puede ser mejorado.
Figura 1.9. Proceso de transesterificación a través de catálisis. Adaptado de Gupta & Demirbas
(2010).
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1.5. Especies de microalgas utilizadas en este estudio
1.5.1.Chlorella sp.
Esta microalga perteneciente al dominio Eukaryota, fila Chlorophyta,
orden Chlorellales y género Chlorella, es una microalga de color verde
unicelular microscópica que mide entre 2 a 10 µm. Poseen paredes lisas que
contienen glucosamida (quitosano) y las células solitarias tienen un aspecto
globoso o elipsoidal (Tomaselli, 2004).
La reproducción es asexual por autoesporas divididas entre dos y ocho
por célula y son liberadas por la ruptura de la pared celular de sus
progenitores. La reproducción sexual aún se desconoce (Tomaselli, 2004).
El género Chlorella se encuentra en todos los hábitats acuosos, tanto en
agua dulce como agua marina. Estas microalgas han sido cultivadas por su buena
adaptabilidad a diferentes ambientes. Por ejemplo, en aguas residuales
municipales (Bhatnagar et al, 2010), en condiciones heterotróficas y
mixotróficas (Heredia-Arroyo et al., 2010). Además presentan un rápido
crecimiento y elevados niveles de lípidos (entre 25 y 35%) (Tran et al., 2010;
Figura 1.10A).
1.5.2. Tetraselmis chuii
Esta especie perteneciente a la fila Chlorophyta, orden Chlorodendrales
y al género Tetraselmis, es una microalga de color verde, unicelular y flagelada,
de dimensiones entre los 10 y 20 µm. Las células son más o menos comprimidas
y ligeramente ovaladas. En el extremo anterior posee una invaginación de donde
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salen cuatro flagelos formados en pares. Posee un solo cloroplasto (rara vez
son dos cloroplastos) en forma de copa y por lo general con un pirenoide
central. Sólo una mancha ocular está presente y se encuentra en uno de los
lados aplanados de la célula (Lee, 2008).
La reproducción es asexual en la etapa en que las células no son móviles.
Esta especie ha sido principalmente cultivada como alimento para pequeños
crustáceos (Velázquez et al., 2001), y para moluscos; como bioindicadores de
metales pesados y agentes tóxicos (Cordero et al., 2005). En los últimos años
se ha convertido en una especie promisoria para la obtención de lípidos que
podrían ser favorables para la producción de biodiesel y otros compuestos
bioactivos de interés biotecnológico (Li et al., 2007; Figura 1.10B).
Figura 1.10. Especies utilizadas en este estudio: A); Chlorella sp.; B) Tetraselmis chuii.
(Fuente: Marbiotech-CCMAR, UALG)
(A) (B)
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1.6. Objetivos
1.6.1. Objetivos generales
Estudiar los efectos de estrés abiótico en la producción de lípidos en
Chlorella sp. y Tetraselmis chuii, importantes para elaboración de biodiesel. Por
otro lado, evaluar la actividad antioxidante de ambas especies, relevante en el
tratamiento de enfermedades que involucren estrés oxidativo provocado por
radicales libres.
1.6.2. Objetivos específicos
- Determinar la concentración celular de Chlorella sp., y Tetraselmis
chuii cultivadas en sistemas tipo batch, para evaluar el crecimiento celular en
el tiempo, identificando las distintas fases de la curva de crecimiento.
- En cada fase de crecimiento, determinar la concentración lipídica y el
peso de biomasa seca. La concentración lipídica será evaluada a través del
método directo o gravimetría. Además, en cada etapa de crecimiento será
evaluada la concentración de lípidos neutros a través del método de tinción por
fluorescencia rojo de Nilo en diferentes concentraciones celulares.
- Determinar la recta de calibración de lípidos, relacionando ambos
métodos (método gravimétrico y método por tinción de fluorescencia rojo de
Nilo), para obtener resultados de concentración de lípidos totales a partir de
la detección de lípidos por el método indirecto rojo de Nilo.
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- Someter a las microalgas Chlorella sp., y T. chuii a estrés abiótico en la
fase exponencial tardía de cada ciclo de cultivo tipo batch, para determinar
diferencias en los resultados de crecimiento celular, concentración de lípidos
totales, perfil lipídico y peso de biomasa seca, comparados con sus respectivos
controles.
- Por otra parte, se determinará el porcentaje de actividad antioxidante
de las microalgas Chlorella sp. y T. chuii, a través de la secuestración de
radicales libres, con la prueba de DPPH. Además, se determinará la máxima
concentración media (IC50) en que los compuestos bioactivos reducen en un
50% la acción de radicales libres, involucrados en diversas enfermedades
neurodegenerativas.
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2. Materiales y Métodos
En el laboratorio “MarBiotech” de la Facultad de Ciencias y Tecnología de la
Universidad de Algarve, Portugal; fue realizado el presente trabajo, el cual fue
dividido en las siguientes etapas:
Cultivo de cepas de microalgas y crecimiento celular
Análisis de lípidos totales
Inducción a la producción de lípidos por estrés abióticos
Evaluación del perfil lipídico
Evaluación de actividad antioxidante
2.1. Cultivo de cepas de microalgas y crecimiento celular
Las cepas de Chlorella sp. y Tetraselmis chuii fueron obtenidas desde cultivos
unialgales pertenecientes a CCMAR-UALG.
El cultivo de Chlorella sp. y T. chuii fue iniciado en concentraciones de
1x106 y 2x105 cel mL-1 respectivamente, debido a estimaciones previas sobre
concentración mínima de crecimiento celular en cada especie. Ambos cultivos
fueron iniciados en botellas transparentes con un volumen de 4 L. El cultivo de
ambas microalgas fue mantenido bajo un flujo de densidad fotónica de 35µmol
s-1 m-2 y a 21°C (Figura 2.1).
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Figura 2.1. Microalgas cultivadas en condiciones normales de laboratorio: A) Tetraselmis
chuii; B) Chlorella sp. (Fuente: Marbiotech-CCMAR, UAlg)
La aireación se mantuvo constante y el suministro de aire fue filtrado. El
medio de cultivo utilizado fue Algal modificado de Fábregas et al. (1984), cuya
composición se presenta en la Tabla 2.1. Cada solución de micronutrientes,
macronutrientes y solución de Fe, fue preparada en agua destilada y
autoclavada por separado a 120 ºC, durante 20 minutos. Posteriormente, las
soluciones fueron mezcladas para producir el medio de cultivo o solución de
trabajo Algal. El agua de mar necesaria para el cultivo microalgal, fue
esterilizada en una autoclave a 120 °C, durante 20 minutos.
A B
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Tabla 2.1. Composición del medio de cultivo Algal, modificado de Fábregas et al., (1994).
2.2. Curva de crecimiento
Para obtener la curva de crecimiento y determinar el ciclo de cultivo de
ambas cepas de microalgas, fue extraída una muestra de 1 mL cada dos días,
con el fin de hacer el recuento celular en un hemocitómetro Neubauer
mejorado, a través de un microscopio estereoscópico. La concentración celular
fue determinada por la siguiente fórmula:
Concentración celular (cel/mL) = (Nº cel/0,4µL) x (103 µl/mL)x factor de
dilución, para T. chuii
Concentración celular (cel/ml) = (N° cel/0,1µL) x (103 µl/mL) x factor de
dilución, para Chlorella sp.
Compuesto Concentración
Solución de micronutrientes
ZnCl2 1 mM
ZnSO4 H2O 1 mM
MnCl2 4H2O 1 mM
Na2MoO4 2H2O 0.1 mM
CoCl2 6H20 0.1 mM
CuSO4 5H2O 0.1 mM
EDTA-Na 6.4 mM
MgSO4 7H2O 2 mM
Solución de Fe
FeCl3 20 mM
EDTA-Na 20 mM
Solución de macronutrientes
NaNO3 2 M
KH2PO4 100 mM
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La diferencia en el cálculo de concentración celular se debe a que las células
de T. chuii fueron contadas en los cuadrantes (A) y las células de Chlorella sp.,
sólo en el cuadrante central (B), debido a su menor tamaño celular (Figura 2.2)
Figura 2.2. Cuadrantes de conteo celular en hematocitómetro. El cuadrante central (B)
contiene 25*16= 400 pequeños cuadrantes. El área del cuadrante mayor (A) es: 400*0,0025
mm2 = 1 mm2. El volumen sobre cada cuadrante (A ó B) es: 1mm2*0,1mm = 0,1mm3 = 0,1 µl
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La tasa de crecimiento (Lee & Shen, 2004), fue calculada de acuerdo a
cada fase de crecimiento celular (Figura 2.3), con la siguiente fórmula:
µ = (1/n)* ln (Xm/X0)
Donde:
n= número de días de cultivo celular
Xm= concentración celular final
X0= concentración celular inicial
Figura 2.3. Esquema sobre la curva de crecimiento celular en microalgas, identificando las
diferentes fases de crecimiento.
Cre
cim
ien
to c
elu
lar
tiempo
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2.3. Determinación del peso seco en biomasa microalgal
Fue determinado el peso seco de biomasa para las especies en cultivo a
través del método de filtración.
Un inoculo de volumen conocido fue tomado a partir de cada cultivo de
microalga, y filtrado a través de papel filtro de fibra de vidrio (1 μm de poro),
previamente lavado con agua destilada y secado a 60 °C durante al menos 3
horas, y desecado por 10 min. La experiencia se realizó en triplicado y se
evaluó el peso seco de la microalga filtrada en el papel, (secada a 60 ºC por 72
horas, hasta que su peso quedara uniforme, y desecada por 10 min), en una
balanza analítica (0,0001 g de precisión). La diferencia en el peso seco fue
estimada por la siguiente fórmula:
Peso seco (g/L) = peso seco final – peso seco inicial
Volumen de la muestra
Donde: Peso seco final = papel filtro con células de microalgas
Peso seco inicial = papel filtro sin células de microalgas
2.4 Análisis de lípidos totales
2.4.1 Método Gravimétrico
Para la determinación y análisis de lípidos totales, fue utilizado el
método gravimétrico de Bligh & Dyer (1959) y modificado en el Centro de
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Acuicultura SINTEF, en Trondheim, Noruega. En este método los lípidos son
extraídos a través de los solventes metanol, cloroformo y agua (Smedes &
Thomasen, 1996).
Desde el cultivo microalgal de T. chuii y Chlorella sp., descritos en el
capítulo 2.1; fueron tomadas cuatro muestras con 50 mL cada una, en la fase
lag, exponencial, exponencial tardía, estacionaria y estacionaria tardía (ver
Figura 2.3). Cada muestra en tubos falcon de 50 mL de capacidad, fueron
centrifugados a 5000 x g por 10 min. Eliminado el sobrenadante, la biomasa fue
congelada a -20 °C hasta que las muestras fueran tratadas.
Posteriormente las muestras se descongelaron y adicionaron 0,8mL de
agua destilada para disolver la biomasa, por un periodo de 20 min aprox. Cada
muestra fue traspasada a tubos de extracción de lípidos (15 mL de capacidad y
material de vidrio).
Los siguientes pasos fueron realizados secuencialmente: Se adicionaron
2 mL de metanol y 1 mL de cloroformo. Dentro de un recipiente con hielo, las
muestras en los tubos de extracción fueron enfriadas y homogenizadas a
velocidad máxima en un dispersador IKA Ultra-Thurrax por 60s; enseguida se
adicionó 1 mL de cloroformo y nuevamente fueron homogenizadas por 30s. Se
adicionó 1 mL de agua destilada y homogenizó durante 30s. Luego, las muestras
fueron centrifugadas a 2000 x g y a temperatura ambiente por 10 min.
Al término de la centrifugación, las muestras presentaron dos fases: en
la parte superior el metanol, agua y restos de microalgas, y en la parte inferior
los lípidos en cloroformo presentando un color verde translúcido. El extracto
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de lípidos fue removido cuidadosamente por medio de una pipeta hacia nuevos
tubos de vidrio (15 mL de capacidad).
Paralelamente, los tubos para pesaje de lípidos (1,5 mL de capacidad y
material de vidrio) fueron secados en un baño seco VWR-Digital, a 60 °C por al
menos 3h. A continuación, los tubos fueron desecados por 3h más, y pesados en
una balanza analítica con 0,001 mg de precisión.
Fue removido 1 mL de cada extracto de lípido hacia los tubos
previamente pesados (1,5 mL de capacidad). Los extractos fueron secados en
un baño seco VWR-Digital Heating, a 60 °C por 3h. Una vez que el cloroformo
fue totalmente evaporado, las muestras fueron llevadas a un desecador por 3 h
y pesadas en una balanza analítica 0,001 mg de precisión. El porcentaje de
lípidos fue calculado con la siguiente fórmula:
Donde:
Peso final = tubo de pesaje de lípidos con lípidos (mg),
Peso inicial = tubo de pesaje de lípidos sin lípidos (mg),
Volumen de la muestra = que corresponde a 1 mL de lípidos disueltos en
cloroformo. (Nótese que el volumen total de lípidos en cloroformo fue 2 mL),
Peso biomasa seca = biomasa seca total de microalgas
% lipidos totales = ((peso final - peso inicial) * (Volumen de la muestra/2)) * 100
peso biomasa seca
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2.4.2. Determinación de lípidos por fluorescencia
Los lípidos fueron determinados a través de la tinción de fluorescencia
liposoluble rojo de Nilo (Figura 2.4), que consiste en la penetración celular de
la tinción por medio de DMSO, un compuesto capaz de atravesar las paredes
celulares. Una vez dentro de la célula, la tinción tiene gran afinidad por los
lípidos apolares.
Para determinar la concentración de lípidos fue preparada una solución
madre de rojo de Nilo (R.N.) en DMSO ((CH3)2SO) a 500 µg mL-1 (0,08 M).
Desde la solución stock y bajo oscuridad se preparó una solución de
trabajo con un 25% de DMSO y 74% de agua destilada.
Figura 2.4. Estructura química de la molécula rojo de Nilo (http://www.chemspider.com)
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Los inóculos de ambas microalgas fueron obtenidos desde los cultivos
descritos en el capítulo 2.1 y en las mismas etapas en que fue realizada la
determinación de lípidos por gravimetría. Los inóculos fueron diluidos en medio
de cultivo a diferentes concentraciones (1:10, 1:5, 1:1, 1) y puestos en una placa
negra de 96 pozos. Seguidamente, cada muestra en 3 replicados, fueron
diluidas en la solución de trabajo de R.N. en una proporción de 1:6, para
completar 300 µL en la placa de 96 pozos (50 µL de microalga diluida y 250 µL
de solución R.N.). Además, fue realizado un control negativo que consistió en
medio de cultivo y solución R.N. y un control positivo que consistió en microalga
y medio de cultivo. Este último control mediría la autofluorescencia de las
microalgas. La placa fue homogenizada en un vortex (120 rpm) por 10 min, e
incubada a 60 °C por 10 min.
La lectura de fluorescencia fue realizada en un lector de microplacas
(Biotek Synergy 4) en un espectro de 530 nm de excitación y 580 nm de
emisión.
Los resultados de concentración de lípidos obtenidos por el método
gravimétrico y rojo de Nilo, fueron correlacionados para obtener una recta de
calibración. A partir de esta recta de calibración se podría extrapolar los
valores de concentración de lípidos a partir de fluorescencia, para obtener
resultados de concentración de lípidos totales en células microalgales de
ensayos posteriores.
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2.4.3 Evaluación del perfil lipídico
El perfil lipídico fue evaluado por medio de cromatografía gaseosa con
espectrofotometría de masa (GC-MS). Todo el material usado fue previamente
descontaminado con 2% de Hextran MA01 (detergente alcalino) y el material
de plástico fue descartado.
Un volumen equivalente a 0,1 g de peso seco fue extraído y centrifugado
a 5000 x g por 5 min a 4 °C. Luego, fueron adicionados 1,5 mL de solución de
derivatización (metanol y cloreto de acetilo, 20:1 v/v) y transferidos a viales
de derivatización. Cada vial fue colocado dentro de un recipiente con hielo para
desagregar las células por medio de un dispersador IKA Ultra-Thurrax por 1,5
min. Al término de este periodo, 1 mL hexano fue adicionado. Los viales fueron
bien cerrados y puestos en un baño húmedo a 100 °C por 60 min.
Las muestras fueron enfriadas en hielo y transferidas a frascos de
centrifugación (50 mL de capacidad). Se adicionó 1 mL de agua destilada y se
agitó en un vortex por 1,5 min. A continuación, las muestras fueron
centrifugadas a 1000 x g, 4 °C por 5 min. Dos fases separadas fueron visibles
(fase acuosa y fase orgánica). La fase orgánica fue extraída y transferida
hacia nuevos frascos de vidrio (15 mL capacidad). Se adicionaron 3 mL más de
hexano, se agitó en un vortex por 1,5 min y se centrifugó a 1000 x g, 4 °C por 5
min. Este procedimiento fue repetido hasta retirar todo el extracto. Cada
muestra fue realizada en triplicado y guardadas a -20 °C hasta un posterior
tratamiento.
En un evaporador rotatorio IKA RV 10 Digital–VWR, las muestras fueron
reducidas y transferidas a nuevos viales (20 mL). El exceso de agua fue
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removido con sulfato de sodio y subsecuentemente, las muestras fueron
filtradas con un filtro de jeringa (0,45 mm de poro), hacia los viales para
cromatografía previamente pesados. Las muestras concentradas con una suave
corriente de nitrógeno evaporaron el hexano totalmente. Los viales fueron
pesados nuevamente con la fracción total de lípidos.
La identificación y cuantificación de ésteres metílicos fue llevada a cabo
por GC-MS (Cromatografía Gaseosa con Espectrofotometría de Masa) "Agilent
Technologies 6890 Network GC System, 5973 Inert Mass Selective
Detector". La separación de diferentes compuestos se obtuvo usando un
programa de temperatura específico para ésteres metílicos de ácidos grasos
(Figura 2.5). La cuantificación se efectuó con rectas de calibración efectuadas
con un patrón de calibración de ésteres metílicos de ácidos grasos conocidos
(Tabla 2.2).
Figura 2.5. Programa de temperatura para GC-MS
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Tabla 2.2. Patrón de calibración con ecuación de la recta, coeficiente de determinación R2 y
tiempo de retención.
Compuesto Ecuación R2 Tiempo de
retención
(min)
C6:0 y = 1E+09x - 366811 0,9978 3,019
C8:0 y = 2E+09x + 203279 0,9965 4,595
C10:0 y = 2E+09x - 347253 0,9983 7,059
C11:0 y = 2E+09x - 525781 0,999 8,732
C12:0 y = 2E+09x - 624370 0,9983 10,625
C13:0 y = 2E+09x - 617972 0,9987 12,627
C14:1 y = 2E+09x - 1E+06 0,9986 14,397
C14:0 y = 2E+09x - 829068 0,9984 14,665
C15:1 y = 2E+09x - 1E+06 0,9988 16,429
C15:0 y = 2E+09x - 879453 0,9987 16,691
C16:1 y = 2E+09x - 1E+06 0,9984 18,237
C16:0 y = 2E+09x - 1E+06 0,9984 18,675
C17:1 y = 2E+09x - 1E+06 0,9989 20,165
C17:0 y = 2E+09x - 1E+06 0,9982 20,585
C18:3n6 y = 1E+09x - 2E+06 0,9995 21,474
C18:2n6 y = 1E+09x - 1E+06 0,9989 21,796
C18:1n9 c y = 3E+09x - 4E+06 0,9982 21,936
C18:1n9 t y = 2E+09x - 1E+06 0,9983 22,058
C18:0 y = 2E+09x - 1E+06 0,9981 22,429
C20:4n6 y = 9E+08x - 2E+06 0,9996 24,692
C20:5n3 y = 8E+08x - 1E+06 0,9987 24,747
C20:3n3/C20:3n6 y = 9E+08x - 1E+06 0,9999 24,991
C20:2n6 y = 1E+09x - 2E+06 0,9934 25,343
C20:1n9 y = 2E+09x - 2E+06 0,9985 25,453
C20:0 y = 1E+09x - 2E+06 0,9974 25,915
C21:0 y = 1E+09x - 1E+06 0,9986 27,558
C22:6n3 y = 4E+08x - 1E+06 0,9975 27,814
C22:1n9 y = 8E+08x - 1E+06 0,9995 28,684
C22:0 y = 8E+08x - 863254 0,9643 29,14
C23:0 y = 6E+08x - 779356 0,9987 30,308
C24:1 y = 4E+08x - 753105 0,999 31,16
C24:0 y = 5E+08x - 1E+06 0,9995 31,471
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2.5. Estudio de inducción a la producción de lípidos por estrés abiótico
Ambas especies de microalgas fueron sometidas a diferentes tipos de
estrés abiótico con el fin de aumentar la producción de lípidos:
Incremento en la intensidad luminosa
Depleción en la concentración de nitratos
Depleción en la concentración de hierro
El estrés fue aplicado en la fase exponencial tardía del ciclo de crecimiento
para ambas microalgas, correspondiendo al día 14, para Chlorella sp. y día 10
para T. chuii, luego de iniciado el cultivo. Un control fue realizado en óptimas
condiciones de luz, concentración de nitratos y concentración de hierro.
Todos los ensayos fueron llevados a cabo en una cámara de ambiente
controlado (ClimaCell-MMM), para asegurar la estabilidad de luz y temperatura
(25 °C y 32 µmol s-1.m-2).
Los ensayos se realizaron en tubos de 100 mL de capacidad y en
triplicado (Figura 2.6), usando medio de cultivo Agal descrito anteriormente,
con las modificaciones necesarias para cada estrés. La concentración celular
inicial fue 1x106 y 2x105 cel mL-1 para Chlorella sp. y T. chuii, respectivamente,
en un volumen máximo de 70 mL por cada tubo.
Los tubos de ensayo fueron cerrados con tapones de goma perforados
con dos agujas de jeringa para asegurar la entrada y salida de aire. La entrada
de aire fue provista por una bomba de acuario (2 W) conectada a una manguera
de acuario (6 mm de diámetro). El aire de entrada fue esterilizado a través de
un filtro de jeringa (0.45 µm de poro). Las burbujas de aire fueron
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uniformemente distribuidas dentro de cada tubo de ensayo por medio de micro
tubos y micro capilares conectados a la aguja de jeringa esterilizada.
Cada dos días el agua evaporada fue reemplazada por agua destilada y se
tomaron alícuotas de 1 mL para determinar la concentración celular y
concentración de lípidos por fluorescencia. En el último día de cultivo fue
determinado el peso seco. La tasa de crecimiento específica, salinidad, pH y
perfil lipídico, también fueron determinados de acuerdo a lo descrito en el
capítulo 2.3.
Figura 2.6. Chlorella sp. y T. chuii fueron cultivadas en seis tubos de ensayo en una cámara con
ambiente controlado. Ambas fotografías muestran el mismo ensayo pero en diferente ángulo.
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2.5.1 Incremento en la intensidad luminosa
Para evaluar el efecto del incremento en la intensidad de la luz, tres
tubos de ensayo fueron mantenidos en las condiciones descritas anteriormente
(capitulo 2.4). En la etapa exponencial tardía (día 14 de cultivo), la intensidad
de luz fue aumentada a 59 µmol s-1.m-2 dentro de la cámara de ambiente
controlado para ambas especies hasta la etapa estacionaria tardía. El resto de
los parámetros se mantuvieron constantes y la toma de muestras para conteo
celular, fluorescencia, peso seco, tasa específica de crecimiento (µ), salinidad,
pH y perfil lipídico fueron realizados como describe el capítulo 2.3.
2.5.2 Depleción de la concentración de Nitrato
El mismo procedimiento descrito en el capítulo 2.3., fue realizado para el
ensayo “depleción de nitratos” en ambas especies, hasta la fase exponencial
tardía del ciclo de cultivo. En este punto, cada tubo de ensayo fue centrifugado
a 1000 x g por 5 min para eliminar el medio de cultivo, el cual fue reemplazado
por un nuevo medio de cultivo en el mismo volumen. Tres tubos fueron
reemplazados con medio de cultivo normal (ensayo “control nitrato”), y tres
tubos fueron reemplazados por medio de cultivo con un 1/4 de nitratos de la
concentración normal (ensayo “estrés nitrato”). El resto de los parámetros se
mantuvieron constantes y la toma de muestras para conteo celular,
fluorescencia, peso seco, tasa específica de crecimiento (µ), salinidad, pH y
perfil lipídico fueron realizados como describe el capítulo 2.3.
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La concentración de nitratos fue analizada a través de absorvancia para
ambas especies Chlorella sp. y T. chuii, en la fase exponencial tardía y fase
estacionaria tardía. El sobrenadante de cada muestra fue obtenido por
centrifugación a 5000 x g, for 10 min y transferidos 100 µL a tubos eppendorf
en triplicado. Posteriormente, fueron adicionados 900 µL NaCl (13%) y 20 µL
HCl (1M). Las muestras fueron traspasadas a cubetas de cuarzo y leídas en un
espectofotómetro con una longitud de onda (λ) de 220 y 275 nm. El cálculo fue
realizado con las siguientes formulas:
Absorbancia (A) = 220 nm - 275 nm
Concentración de Nitratos (mM) = (0,3558 * (A – 0,0093)) * 10
2.5.3. Depleción de la concentración de Hierro
El mismo procedimiento del ensayo control fue llevado a cabo hasta la
fase exponencial tardía del ciclo de cultivo (capítulo 2.3), en ambas especies de
microalgas. En este punto, cada tubo fue centrifugado a 1000 x g por 5 min
para eliminar el medio de cultivo, el cual fue reemplazado en el mismo volumen,
por un nuevo medio de cultivo. Tres tubos fueron reemplazados con medio de
cultivo Algal-1,5µM FeCl3+ EDTA-Na 6µM (ensayo “control Fe”), y otros tres
fueron reemplazados por medio de cultivo Algal-1,5 µM FeCl3+ EDTA-Na 6µM
más un quelante de Fe, deferroxamine (DFB) Sigma-Aldrich, Inc., a una
concentración de 100 µM (ensayo “estrés Fe”). El resto de los parámetros se
mantuvieron constantes y la toma de muestras para conteo celular y
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Página 65
determinación de lípidos neutros fueron realizados. El peso seco, tasa
específica de crecimiento (µ), salinidad y pH fueron determinadas.
2.6. Evaluación de actividad antioxidante
2.6.1. Extracción de compuestos antioxidantes
La extracción de compuestos antioxidantes provenientes de las
microalgas Chlorella sp.y T. chuii, fue realizada con hexano (solvente apolar,
constante dieléctrica: 2,0) y diclorometano (DCM) (polaridad intermedia,
constante dieléctrica: 9,1).
Previamente las microalgas fueron liofilizadas y 3 g se diluyeron en 30
mL de cada solvente. Los extractos se realizaron en triplicado y tratados en un
dispersador IKA Ultra-Thurrax para la desagregación celular por 2 min.
Seguidamente, las muestras fueron agitadas con un agitador vortex por 1 min y
centrifugadas a 5000 x g por 15 min. El sobrenadante fue filtrado con papel
filtro (Whatman n° 4). Previamente, cuatro frascos de evaporación limpios
fueron pesados para contener la solución filtrada.
2.6.2. Fase de Evaporación
Cada extracto fue concentrado en un evaporador rotatorio IKA RV 10
Digital –VWR. Los extractos con solvente hexano fueron evaporados a 60 °C y
los extractos con solvente DCM a 40 °C. Una vez evaporado todo el solvente de
las muestras, cada frasco fue pesado nuevamente para obtener la fracción
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Página 66
total del extracto. Posteriormente cada extracto fue diluido en una solución
con DMSO (50mg/mL).
2.6.3. Actividad secuestradora de radicales libres (Radical scavenging
activity, RSA)
La actividad secuestradora de radicales libres (RSA) fue determinada
por el radical estable 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) de acuerdo al
método de Brand-Williams et al., (1995) y adaptado a escala de microplaca por
Moreno et al., (2006), en donde el radical DPPH se reducirá por medio de un
agente antioxidante a testear.
Desde la solución stock (50 mg/mL) fueron extraídas muestras (22 µL)
diluidas en tres concentraciones: 10- 5 y 1 mg mL-1; y mezcladas con 200 µL de
una solución de DPPH (120 µM) en metanol. La mezcla (222 µL) fue llevada a una
placa con 96 pozos de microtitulación. También fue realizado un control
negativo (22 µL DMSO + 200 µL DPPH), un control positivo (22 µL
hidroxitolueno butilado (BHT) + 200 µL DPPH) y un blanco de color (22 µL
muestra de cada concentración + 200 µL DMSO).
La placa de 96 pozos fue incubada en oscuridad por 30 min y la
absorvancia fue medida a 517 nm en un lector de microplacas (Biotek Synergy
4).
Los resultados fueron expresados como actividad antioxidante (%)
relativo al control negativo. El porcentaje de inhibición fue calculado y
expresado por la siguiente fórmula:
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Actividad antioxidante (AA) = Abs517nm – CB
% de inhibición = 100 – ((AA/NC)* 100)
Donde:
Abs517nm = Absorbancia de cada muestra,
CB = Blanco de color,
NC = Control negativo
2.7. Análisis Estadístico
El crecimiento celular entre cada estrés y su control, fue analizado por
un test de medias paramétrico Test t-Student.
La concentración de lípidos totales y fluorescencia de lípidos neutros,
fueron relacionados a través de una correlación de Pearson, seguidamente la
influencia de una variable con respecto a la otra (lípidos totales vs
fluorescencia de lípidos neutros) fue analizada por una regresión lineal.
Los tratamientos de estrés abióticos fueron representados como la
media ± desviación estándar de la media (DS) y evaluados estadísticamente a
través del test de medias Test t-student para determinar si no existieron
diferencias significativas en cada fase de cultivo con respecto a su ensayo
control (p < 0,05).
Todos los análisis se realizaron por medio del software SPSS 17.0 Inc.
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Los resultados de actividad antioxidante, fueron expresados como la
media ± error estándar de la media (ES) y se analizaron por el test
paramétrico ANOVA de un factor para evaluar si existieron diferencias
significativas (p < 0,05) entre y dentro de los porcentajes de actividad
antioxidante en las tres concentraciones de extractos, con ambos solventes
(hexano y DCM). Las diferencias significativas entre medias fueron analizadas
por el test de comparaciones múltiples, Scheffe. Los análisis fueron realizados
por medio del software SPSS 17.0, Inc. Además fue calculada la máxima
concentración media (IC50) a través de una regresión no lineal con el software
GraphPad Prism 5.0 ®.
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Página 69
3. Resultados
3.1. Cultivo de cepas de Clhorella sp. y Tetraselmis chuii
3.1.1 Crecimiento celular
El crecimiento celular de Clhorella sp., fué medido durante 23 días. La
fase de latencia o fase “Lag”, tuvo una corta duración (< 24 h), aumentando su
crecimiento de forma exponencial hasta el día 16, en que comenzó la fase
estacionaria (Figura 3.1A). Una muestra visual del declinar del cultivo, fue su
aspecto, el cual se tornó de un color verde-amarillento. La tasa de crecimiento
específica (µ), medida durante la fase exponencial de cultivo, fue de 0,13 d-1. El
pH inicial y final fue 8,4 y 7,9; respectivamente. La salinidad fue constante en
35‰.
El crecimiento celular de Tetraselmis chuii fue medido durante 16 días
en los cuales se observa una fase de latencia o fase “Lag” en los dos primeros
días, luego comienza la fase exponencial hasta el día 12 en que entra a la fase
estacionaria (Figura 3.1B). La tasa de crecimiento específica (µ), medida
durante la fase exponencial del ciclo de cultivo, fue de 0,25 d-1. El pH inicial
fue de 8,2 y final de 7,6. La salinidad fue de 35‰.
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Figura 3.1. Crecimiento celular en: Chlorella sp., durante 23 días de cultivo (A), y Tetraselmis
chuii, durante 16 días de cultivo (B).
3.2. Determinación de lípidos
3.2.1. Lípidos Totales
La cuantificación de lípidos totales en Chlorella sp., por el método
gravimétrico, presentó la máxima concentración de lípidos en el día 23 del ciclo
de crecimiento celular, correspondiente a la fase estacionaria tardía con un
2,4% de lípidos totales por peso de biomasa seca (Figura 3.2).
A B
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Figura 3.2. Lípidos totales de Chlorella sp., durante el ciclo de crecimiento. La línea muestra las
medias de lípidos totales en (g L-1) y sus desviaciones estándar, las barras muestran el
porcentaje de lípidos por peso seco de biomasa.
Para T. chuii, la mayor concentración de lípidos totales cuantificados por
el método gravimétrico durante el ciclo de crecimiento celular, estuvo
presente en el día 12, correspondiente a la fase estacionaria con un 0,7% de
lípidos por peso seco de biomasa (Figura 3.3).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
2 6 8 16 19 23
Lípidos
tot
ales (%
peso
seco
)
Lípidos
tot
ales (g L
-1)
Días de Crecimiento
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Figura 3.3. Lípidos totales de Tetraselmis chuii, durante el ciclo de crecimiento. La línea
muestra lípidos totales promedio y sus desviaciones estándar en (g L-1). Las barras muestran el
porcentaje de lípidos por peso seco de biomasa.
3.2.2. Análisis de lípidos a través de la técnica rojo de Nilo
Según los resultados, se puede observar en Chlorella sp., valores de
fluorescencia entre 80 ± 30 y 154 ± 5 unidades arbitrarias (u.a.); el día 2,
correspondiente a la fase de latencia “Lag” y el día 8, correspondiente a la fase
exponencial intermedia, respectivamente (Figura 3.4; Tabla 3.1). Luego, en el
día 16 de la fase exponencial tardía, presenta un aumento en el valor de la
fluorescencia de 1563 ± 20 u.a. El máximo valor de fluorescencia fue 2804 ± 49
u.a., en el día 23 de la fase estacionaria tardía de crecimiento celular (Figura
3.4; Tabla 3.1).
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
2 6 10 12 16
Lípidos
tot
ales ( % p
eso
seco
)
Lípidos
tot
ales (g L
-1)
Días de Crecimiento
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Figura 3.4. Fluorescencia (u.a.) durante los días del ciclo de cultivo en Chlorella sp.
En T. chuii se observaron valores entre 52 ± 38 y 330 ± 24 u.a. de
fluorescencia, entre el día 2 y 16 de cultivo celular (Figura 3.5; Tabla 3.1).
Figura 3.5. Fluorescencia (u.a.) durante los días del ciclo de cultivo en T. chuii
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
2 6 8 16 19 23
fluo
resc
enc
ia (u.
a.)
días
0
50
100
150
200
250
300
350
400
2 6 10 12 16
fluo
resc
enc
ia (u.
a.)
días
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El valor mínimo de fluorescencia correspondió al día 2 de la fase Lag en T.
chuii, y el máximo valor al día 16 de la fase estacionaria tardía del cultivo
celular (Tabla 3.1).
Tabla 3.1. Valores promedio ± desviación estándar de fluorescencia (u.a.) a través de la técnica
rojo de Nilo para Chlorella sp., y T. chuii en cada etapa del ciclo de crecimiento celular.
Etapas de
crecimiento
Chlorella sp 110 ± 4 80 ± 30 154 ± 5 1563 ± 20 1580 ± 17 2804 ± 49
T. chuii 52 ± 38 91 ± 2 112 ± 4 122 ± 23 330 ± 24
Estacionaria
tardía
Lag Exponencial
temprana
Exponencial
intermedia
Exponencial
tardía
Estacionaria
-
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3.2.3. Relación entre la concentración lipídica determinada por el método
gravimétrico y por fluorescencia con rojo de Nilo (recta de calibración)
Los resultados indicaron que existe una correlación positiva (R = 0,862)
entre los lípidos totales y fluorescencia de lípidos neutros en Chlorella sp.,
además de una relación directa significativa (p = 0,000), con un R2 = 0,87 entre
el aumento de la fluorescencia (concentración de lípidos neutros) y el aumento
de la concentración de lípidos totales (Figura 3.6).
Figura 3.6. Representación gráfica de la regresión lineal y ecuación de la recta, entre
fluorescencia en unidades arbitrarias (u.a.) y lípidos totales en microgramos (µg), para
Chlorella sp.
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T. chuii, presentó una correlación positiva entre los lípidos totales y
fluorescencia de lípidos neutros (R = 0,831). La regresión lineal presentó una
relación directa significativa (p = 0,000) entre el aumento de concentración de
lípidos totales y el aumento de la fluorescencia de lípidos neutros (R2 = 0,69)
(Figura 3.7).
Figura 3.7. Representación gráfica de la regresión lineal y ecuación de la recta, entre
fluorescencia unidades arbitrarias: (u.a.) y lípidos totales en microgramos (µg), para T. chuii
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Los datos de fluorescencia analizados en los distintos factores de
dilución (1:10; 1:5; 1:2 y 1:1) en ambas microalgas, fueron relacionados con
respecto a la concentración de lípidos totales en todas las fases de
crecimiento en ambas microalgas (Figuras 3.6 y 3.7). Por consiguiente, las
ecuaciones de la recta resultantes para Chlorella sp y T. chuii, fueron
utilizadas para determinar en experiencias posteriores, la concentración de
lípidos totales a partir de fluorescencia por medio del método indirecto rojo
de Nilo.
3.3. Crecimiento celular en microalgas sometidas a estrés abiótico
3.3.1. Incremento en la intensidad de luz
Para Chlorella sp., huvo diferencias significativas en la concentración
celular entre el ensayo “estrés luz” y el ensayo control, Test t-Student; p <
0,05 (Figura 3.8A). La tasa de crecimiento (µ), fue de 0,58 d-1 para el ensayo
control y 0,33 d-1 para el ensayo “intensidad de luz” en la fase exponencial de
crecimiento celular. Luego del día 14, o comienzo de la fase estacionaria, la µ
en el ensayo control fue de 0,04 d-1 y 0,05 d-1 en el ensayo “estrés luz”.
En Chlorella sp., el pH inicial para el ensayo control fue 8,9 y final de
8,2. Para el ensayo “intensidad de luz” el pH inicial fue 8,5 y final fue de 8,2.
La salinidad se mantuvo constante en 35‰.
En cuanto a T. chui, la concentración celular fue significativamente
mayor en el tratamiento control, con respecto al ensayo “estrés de luz” (Test
t-Student; p < 0,05; Figura 3.8B). La tasa de crecimiento en el ensayo control
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fue 0,32 d-1 y de 0,22 d-1 para el ensayo “estrés de luz” analizada en la fase
exponencial de cada tratamiento. Luego del día 10 en que fue aplicado el
estrés, la tasa de crecimiento en el ensayo control fue de 0,06 d-1 y 0,05 d-1
para el ensayo “estrés luz”.
En T. chuii, el pH inicial para el ensayo control fue 8,8 y final 7,6. Para el
ensayo “intensidad de luz” el pH inicial fue 8,5 y final 8,2. La salinidad se
mantuvo constante en 35‰.
Figura 3.8. Concentración celular (cel mL-1), A) Chlorella sp., y B) T. chuii, en ensayo “estrés de
Luz” y su respectivo control. La línea punteada indica el inicio del estrés y * indica diferencias
significativas (t-Student; p<0,05).
* *
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3.3.2. Depleción de la concentración de Nitrato
Para Chlorella sp., no huvo diferencias significativas en la concentración
celular entre el ensayo “estrés nitrato” y el ensayo “control nitrato” (Test t-
Student; p >0,05; Figura 3.9A). La tasa de crecimiento para el ensayo “estrés
nitrato” fue de 0,28 d-1, y 0,29 d-1 para el ensayo “control nitrato”, evaluados
en la fase exponencial. Luego del día 14 en que fue aplicado el estrés, la µ fue
de 0,46 d-1 hasta el día 15 y decayó a una tasa de -0,09 d-1 en el ensayo “estrés
nitrato”. En el ensayo “control nitrato” luego del día 14, la µ aumentó a 0,51 d-1
y disminuyó a partir del día 15 a -0,06 d-1 hasta el final del ensayo (Figura
3.9A).
En Chlorella sp., el pH inicial del ensayo “estrés nitrato” fue 8,5 y final
8,2. Para el ensayo “control nitrato” el pH inicial fue 8,5 y final 8,2. La
salinidad se mantuvo en 36‰, para ambos ensayos.
Para T. chuii, la depleción de nitratos en el medio de cultivo, presentó
diferencias significativas en la concentración celular luego de la fase
estacionaria (Test t-Student; p < 0,05; Figura 3.9B). La tasa de crecimiento
durante la fase exponencial para el ensayo “estrés nitrato” y “control nitrato”,
fue de 0,32 d-1 y 0,28 d-1, respectivamente. Luego del día 10 en que fue
aplicado el tratamiento de estrés, la µ en el ensayo “estrés nitrato” fue de
0,30 d-1 hasta el día 15 y decrece a -0,01 d-1 hasta el final del ensayo. En el
ensayo “control nitrato” la µ aumenta a 0,40 d-1 hasta el día 15 y decrece a -
0,03 d-1 hasta el final de la experiencia (Figura 3.9B).
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En T. chuii, el pH inicial para el ensayo “estrés nitrato” fue 8,6 y final 6,8. Para
el ensayo “control nitrato” el pH inicial fue 8,6 y final 7,2. La salinidad para
ambos ensayos se mantuvo constante en 36‰.
Figura 3.9. Concentración celular (cel mL-1), A) Chlorella sp., y B) T. chuii, en ensayo “estrés
nitrato” y su respectivo control. La línea punteada indica el inicio del estrés y * indica
diferencias significativas (t-Student; p<0,05).
* *
**
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Por otra parte, la concentración de nitratos (mM) en Chlorella sp.,
disminuyó a una razón de 5 entre la fase exponencial tardía (antes de la
aplicación del estrés abiótico) y la fase estacionaria tardía (final de la
experiencia), en el ensayo “estrés nitrato”. En cambio, en el ensayo “control
nitrato”, la disminución fue a una razón de 2 (Tabla 3.2).
La evaluación de la concentración de nitratos (mM) en T. chuii, indicó que
hubo una disminución de 1,7 veces en el ensayo “estrés nitrato” y 1,4 veces en
el ensayo “control nitrato”, desde la fase exponencial tardía (antes de la
aplicación de cada tratamiento), y hasta la fase estacionaria tardía y final de
cada experiencia (Tabla 3.2).
Tabla 3.2. Concentración de Nitratos (mM) en los ensayos “Control Nitrato” y “Estrés Nitrato”,
para Chlorella sp. y T.chuii.
Inicio * Exponencial
tardía **
Estacionaria
tardía
Chlorella sp. Control Nitrato 2 0,08 0,04
Estrés Nitrato 2 0,12 0,02
T. chuii Control Nitrato 2 0,16 0,11
Estrés Nitrato 2 0,17 0,10
* valor estimado a partir del medio de cultivo Algal
**antes de ser aplicado el tratamiento
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3.3.3. Depleción de la concentración de Hierro
La depleción en la concentración de Fe en el medio de cultivo de
Chlorella sp., tuvo diferencias significativas (Test t-Student; p < 0,05) en el
aumento en la concentración celular, con respecto al ensayo “control Fe” en la
fase estacionaria tardía (Figura 3.10A). La tasa de crecimiento µ, para el
ensayo “estrés Fe” fue de 0,27 d-1 y 0,26 d-1 para el ensayo “control Fe”
durante la fase exponencial. Luego de aplicado el estrés, la µ aumenta 0,10 d-1
en el ensayo “estrés Fe” y 0,13 d-1 en el ensayo “control Fe”, hasta el día 15.
Desde el día 15 y hasta el final de cada experiencia, la µ aumenta en 0,15 d-1
para el ensayo “estrés Fe” y 0,10 d-1 para el ensayo “control Fe” (Figura 3.10A).
El pH inicial fue 8,05 en ambos ensayos de Chlorella sp. El pH final para
el ensayo “estrés Fe” fue 8,39 y para el ensayo “control Fe” 8.37. La salinidad
se mantuvo constante en 35,5‰.
T. chuii; no tuvo diferencias significativas (Test t-Student; p=0,839) en
la concentración celular entre el ensayo “estrés Fe” y “control Fe” (Figura
3.10B). La tasa de crecimiento específica en la fase exponencial del ensayo
“estrés Fe”, fue de 0,29 d-1 y 0,38 d-1 en el ensayo “control Fe”. Luego de
aplicado el estrés, la µ aumenta 0,46 d-1 en el ensayo “estrés Fe” y 0,47 d-1 en
el ensayo “control Fe”, hasta el día 15. Desde el día 15 y hasta el final de cada
experiencia, la µ aumenta 0,04 d-1 en el ensayo “estrés Fe” y 0,06 d-1 en el
ensayo “control Fe” (Figura 3.10B).
El pH inicial para ambos ensayos en T. chuii fue 8,2 y el pH final en el
ensayo “estrés Fe” fue 8,34 y 8,2 para el ensayo “control Fe”. La salinidad se
mantuvo constante en 35,5‰.
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Figura 3.10. Concentración celular (cel mL-1), A) Chlorella sp., y B) T. chuii, para los ensayos
“estrés Fe”; y su respectivo control. La línea punteada indica el inicio del estrés y * indica
diferencias significativas (t-Student; p<0,05).
3.4. Estudio de la inducción a la producción de lípidos por estrés abiótico
3.4.1. Incremento en la intensidad de luz
Clorella sp., presentó concentraciones lipídicas significativamente
mayores en el ensayo “estrés de luz” en comparación al ensayo control desde el
día 3 al día 19 de cultivo (Test t-student, p < 0,05). La máxima concentración
lipídica en el ensayo “estrés intensidad de luz” se presentó en el día 14 (1473 ±
235 µg mL-1), y en el día 19 y final de la experiencia (1400 ± 232 µg mL-1). En el
ensayo control, la máxima concentración lipídica (943 ± 138 µg mL-1)
correspondió al día 17 del ciclo de cultivo (Figura 3.11A).
T. chuii presentó concentraciones lipídicas significativamente superiores
en el ensayo “estrés de luz” en comparación al ensayo control, en el primer día
de cultivo (Test t-student, p < 0,05). En el día 2, 12 y 14 de cultivo celular, las
concentraciones lipídicas fueron significativamente inferiores en el ensayo
“estrés luz” en comparación al ensayo control (Test t-student, p<0,05). La
*
*
* *
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concentración de lípidos en T. chuii tuvo la máxima concentración lipídica (395
± 127 µg mL-1) en el día 16 del tratamiento “estrés intensidad de luz”. Para el
tratamiento control, la máxima concentración lipídica (377 ± 82 µg mL-1) fue
observada en el día 16 y final del ciclo de cultivo (Figura 3.11B).
Figura 3.11. Concentración (µg mL-1) de lípidos (media ± desviación estándar) para: A) Chlorella
sp., y B) T. chuii, “estrés de Luz” y ensayo control. La línea punteada indica el inicio del estrés y
* indica diferencias significativas (t-Student; p<0,05).
3.4.2. Depleción de la concentración de Nitrato
Chlorella sp., tuvo diferencias significativas en la concentración de
lípidos en los días 5 y 7 de cultivo celular (Test t-Student; p<0,05). Luego, en el
día 15, 17 y 19 de cultivo celular presentó concentraciones lipídicas
significativamente superiores en el ensayo “estrés Nitrato” con respecto al
ensayo “control Nitrato” (Test t-Student; p<0,05). El ensayo “estrés nitrato”
en Chlorella sp., tuvo su máxima concentración de lípidos el día 19 del ciclo de
cultivo con un valor de 988 ± 130 µg mL-1. El ensayo “control nitrato” tuvo su
**
* *
**
*
*
*
*
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máximo valor el día 13 del ciclo de cultivo, con un valor de 415 ± 48 µg mL-1
(Figura 3.12A).
T. chuii, presentó concentraciones lipídicas significativamente
superiores en el ensayo “estrés Nitrato” con respecto al ensayo “control
Nitrato”, el día 13 y 18 de crecimiento celular (Test t-Student; p<0,05). La
máxima concentración de lípidos para T. chuii en el ensayo “estrés nitrato” fue
el día 18 de cultivo con un valor de 472 ± 95 µg mL-1. En el ensayo “control
nitrato”, la máxima concentración de lípidos se encontró en el día 18 y final de
cultivo con un valor de 309 ± 81 µg mL-1 (Figura 3.12B).
Figura 3.12. Concentración (µg mL-1) de lípidos (media ± desviación estándar) para: A) Chlorella
sp., y B) T. chuii, en ensayo “estrés nitrato” y su respectivo control. La línea punteada indica el
inicio del estrés y * indica diferencias significativas (t-Student; p<0,05).
3.4.3. Depleción de la concentración de Hierro
La concentración lipídica en Chlorella sp., fue significativamente superior
en el ensayo “estrés Fe” el día 7 de cultivo y significativamente superior en el
**
* *
*
*
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ensayo “control Fe” el día 19. La máxima concentración de lípidos en Chlorella
sp., en el ensayo “estrés Fe” se observó el día 20 de cultivo y final, con un valor
de 386 ± 72 µg mL-1. Para el ensayo “control Fe”, la máxima concentración de
lípidos igualmente fue observada el día 20 y final de cultivo, con un valor de
379 ± 46 µg mL-1 (Figura 3.13A).
En T. chuii, la concentración lipídica fue significativamente diferente
desde el día 11 hasta el día 18 de cultivo (Test t-student; p<0,05). El máximo
valor de concentración de lípidos en T.chuii, fue 348 ± 55 µg mL-1 para el
ensayo “estrés Fe”, el día 16 y final de la experiencia, y 348 ± 85 µg mL-1 para
el ensayo “control Fe”, el día 11 del ciclo de cultivo (Figura 3.13B).
Figura 3.13. Concentración (µg mL-1) de lípidos (media ± desviación estándar) para: A) Chlorella
sp., y B) T. chuii, en ensayo “estrés Fe” y su respectivo control. La línea punteada indica el
inicio del estrés y * indica diferencias significativas (t-Student; p<0,05).
3.5. Efectos del estrés abiótico en la producción de lípidos en Chlorella
sp., y T.chuii
La inducción a estrés abiótico tuvo un efecto significativo en la
producción de lípidos al final de cada experiencia, en Chlorella sp. (ANOVA; p
= 0,000), siendo el ensayo “intensidad de luz” quien presentó un aumento
*
*
*
**
*
*
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significativo de la concentración lipídica con respecto al ensayo control
(Scheffe; p = 0,00; Tabla 3.3).
En T. chuii, la inducción a estrés abiótico tuvo un efecto significativo en
la producción de lípidos al final de cada experiencia (ANOVA; p =0,002). La
significancia estuvo representada por el ensayo “control Fe”, con respecto al
ensayo “intensidad de luz” (Scheffe, p = 0,03; Tabla 3.3), y con respecto al
ensayo “estrés nitrato” (Scheffe, p = 0,005; Tabla 3.3).
Tabla 3.3. Fluorescencia (media ± error estándar de la media) evaluada al final de cada
tratamiento (ANOVA 1 factor; 95% de significancia)
Valores marcados con letras diferentes (a b; y c d), indican diferencias significativas entre
tratamientos (test de comparaciones múltiples, Scheffe; p < 0,05).
3.5.1. Determinación del porcentaje de lípidos totales con respecto a la
biomasa.
La concentración de lípidos por peso de biomasa seca al final de cada
experiencia, inducida a través de estrés abiótico, en Chlorella sp., fue de
28,4% en el ensayo estrés luz y 10,4% en el ensayo control. En el ensayo
control nitrato el porcentaje de lípidos fue de 6,0% y 7,9% en el ensayo
“estrés nitrato”. En el ensayo “control Fe” el porcentaje de lípidos por peso de
biomasa seca, fue 6,7% y 6,3% en el ensayo “estrés Fe” (Tabla 3.4).
Chlorella sp. 578 ± 209a 1400 ± 232b 429 ± 92a 308 ± 73a 386 ± 72a 380 ± 46a
T. chuii 377 ± 82 395 ± 127a 472 ± 95c 309 ± 81 348 ± 56 145 ± 17bd
Control Estrés luz Estrés Nitrato Control Nitrato Estrés Fe Control Fe
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Tabla 3.4. Estimación de la concentración de lípidos (media ± desviación estándar) y porcentaje
de lípidos por peso seco de biomasa para Chlorella sp.
Para T. chuii, se observa que el porcentaje de lípidos con respecto a la
biomasa seca medida al final de cada ensayo, es de 7,6% en el ensayo estrés
luz y 5,5% en el ensayo control. En el ensayo “estrés nitrato” tuvo un
porcentaje de 7,9% y el “control nitrato” un porcentaje de 5,2%. En el ensayo
“estrés Fe” la concentración de lípidos con respecto al peso seco de biomasa,
medida al final de cada ensayo, fue de 5,5% y 2,3% en el ensayo “control Fe”
(Tabla 3.5).
Chlorella sp.
Tratamiento
Concentración
(cel/ mL)
Lípidos
(% P.S.)
Control 7,81E+07 6,03 ± 0,25 0,58 ± 0,16 10,4
Estrés Luz 8,30E+07 4,93 ± 0,34 1,40 ± 0,23 28,4
Control Nitrato 1,17E+08 5,13 ± 0,36 0,31 ± 0,07 6,0
Estrés Nitrato 1,08E+08 5,44 ± 0,16 0,43 ± 0,09 7,9
Control Fe 9,96E+07 5,70 ± 0,40 0,38 ± 0,05 6,7
Estrés Fe 1,32E+08 6,14 ± 0,21 0,39 ± 0,07 6,3
* Estimación a partir de la ecuación de la recta de calibración y= 433,68x + 31,743
Peso seco
Biomasa (g /L)
Estimación
Peso Lípidos
(g/L)*
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Tabla 3.5. Estimación de la concentración de lípidos (media ± desviación estándar) y porcentaje
de lípidos por peso seco de biomasa para T. chuii.
3.6. Evaluación del Perfil Lipídico
De acuerdo al perfil lipídico los principales ácidos grasos metil esteres
(EMAG), correspondieron a cadenas entre 10 y 20 carbonos en Chlorella sp.,
siendo arriba de un 93,2% aptos para la producción de diesel en todos los
ensayos excepto en el ensayo “estrés de luz” donde no existen datos
disponibles (Tabla 3.6).
Tabla 3.6. Resumen de la naturaleza de los EMAG (%), de Chlorella sp., en los tratamientos
analizados y su potencial uso en biocombustibles
T. chuii
Tratamiento
Concentración
(cel/ mL)
Lípidos
(% P.S.)
Control 6,03E+06 6,72 ± 0,36 0,37 ± 0,08 5,5
Estrés Luz 4,09E+06 5,65 ± 0,18 0,43 ± 0,09 7,6
Control Nitrato 4,65E+06 5,89 ± 0,27 0,31 ± 0,08 5,2
Estrés Nitrato 4,29E+06 5,98 ± 0,37 0,47 ± 0,10 7,9
Control Fe 7,39E+06 6,37 ± 0,38 0,15 ± 0,02 2,3
Estrés Fe 7,72E+06 6,31 ± 0,23 0,35 ± 0,06 5,5
* Estimación a partir de la ecuación de la recta de calibración y= 118,7x + 4,6464
Peso seco
Biomasa (g /L)
Estimación
Peso Lípidos
(g/L)*
Chlorella sp. Control Estrés Luz Control
Nitrato
Estrés
Nitrato
Control Fe Estrés Fe
Saturados (%) 38,4 n/d 38,7 42,9 38,8 25,2
Mono-insaturados (%) 36,0 n/d 29,8 30,7 32,5 36,8
Poli-insaturados (%) 25,6 n/d 31,6 26,4 28,7 38,0
Derivado de lípidos
Queroseno (C9-C16) (%) 68,9 n/d 64,1 67,9 63,9 52,3
Diesel (C15-C25) (%) 93,9 n/d 94,0 93,2 94,1 96,0
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T. chuii presentó EMAG con cadenas entre los 14 y 20 carbonos, además
casi el 100% de los EMAGs identificados fueron favorables para la elaboración
de biodiesel, en todos los tratamientos analizados, excepto en el ensayo estrés
de luz, donde no hubieron datos disponibles (Tabla 3.7).
Tabla 3.7. Resumen de la naturaleza de los EMAG (%), de T. chuii, en los tratamientos
analizados y su potencial uso en biocombustibles
T. chuii Control Estrés Luz Control
Nitrato
Estrés
Nitrato
Control Fe Estrés Fe
Saturados (%) 34,7 n/d 39,2 51,2 38,7 35,8
Mono-insaturados (%) 14,6 n/d 22,4 34,1 28,2 33,1
Poli-insaturados (%) 50,6 n/d 38,4 14,7 33,0 31,1
Derivado de lípidos
Queroseno (C9-C16) (%) 39,9 n/d 47,9 55,8 48,8 45,8
Diesel (C15-C25) (%) 100,0 n/d 100,0 98,9 100,0 99,6
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Los principales ácidos grasos encontrados en Chlorella sp., para todos los
tratamientos analizados, fueron el ácido palmítico, el ácido palmitoleico y el
ácido eicosapentaenoico. El ácido palmítico tuvo porcentajes de 32,4% en el
ensayo “control nitrato” y 34,2% en el ensayo “estrés nitrato”, además del
ensayo control con un porcentaje de 30,9%. En el ensayo “estrés luz” no hubo
datos disponibles. El ácido palmítico tuvo un porcentaje de 18,8% en el ensayo
“control Fe” y 27,5% el ensayo “estrés Fe” (Tabla 3.8). El ácido palmitoleico
tuvo un porcentaje de 25,6% en el ensayo “control nitrato” y 26,1% en el
ensayo “estrés nitrato”. En el ensayo control, el ácido palmitoleico tuvo un
porcentaje de 31,2%. El ensayo “estrés luz” no tuvo datos disponibles. En el
ensayo “control Fe” el ácido palmitoleico tuvo un porcentaje de 28,5% y en el
ensayo “estrés Fe” de 29,0% (Tabla 3.8). El ácido eicosapentaenoico tuvo
porcentajes de 22% en el ensayo “control nitrato” y 16,3% en el ensayo “estrés
nitrato”. En el ensayo control tuvo un porcentaje de 16,4%, y en el ensayo
estrés de luz no hubo datos disponíbles. En el ensayo “control Fe”, el ácido
eicosapentaenoico tuvo un porcentaje de 20,8% y el ensayo “estrés Fe” un
porcentaje de 12,6% (Tabla 3.8).
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Tabla 3.8. Porcentajes (%) de Ácidos Grasos Metil Ester encontrados en los diferentes
tratamientos en Chlorella sp. (n indica el número de réplicas analizadas)
En Tetraselmis chuii, los principales ácidos grasos encontrados fueron el
ácido palmítico, el ácido linoleico y más atrás lo sigue el ácido oleico. El
porcentaje de ácido palmítico en el ensayo “control nitrato” fue de 38,8% y en
el ensayo “estrés nitrato” de 46,3%. En el ensayo “control Fe”, el porcentaje
de ácido palmítico fue de 37,7% y en el ensayo “estrés Fe” de 31,1%. En el
ensayo control, la concentración de ácido palmítico fue de 34%, sin embargo en
el ensayo “estrés luz” no hubo datos disponibles (Tabla 3.9). El porcentaje de
ácido linoleico en el ensayo “control nitrato” fue de 19,5% y en el ensayo
“estrés nitrato” de 7,5%. En el ensayo “control Fe”, el porcentaje de ácido
linoleico fue de 13,2% y en el ensayo “estrés Fe” de 12,7%. En el ensayo
Control
(n=2)
Estrés
Luz
(n=0)
Control
Nitrato
(n=2)
Estrés
Nitrato
(n=1)
Control
Fe (n=3)
Estrés Fe
(n=2)
Cáprico C10:0 0,1
Laurico C12:0 0,3 0,3 0,1 0,3
Tridecanoico C13:0 4,1 4,0
Mirístico C14:0 5,8 2,0 6,4 1,7 3,6
Pentadecanoico C15:0 0,6 0,2 0,9 1,9 0,5
Palmitoleico C16:1 31,2 25,6 26,1 28,5 29,0
Palmitico C16:0 30,9 32,3 34,2 27,5 18,8
Margánico C17:0 0,2 0,1 0,4 0,2 0,4
Linoleico C18:2n6 5,5 7,7 6,0 6,3 13,4
Oleico C18:1n9 4,7 4,2 4,6 4,0 7,8
Esteárico C18:0 0,6 0,6 3,2 1,5
Araquidónico C20:4n6 3,7 1,9 4,1 1,7 12,1
Eicosapentaenoico C20:5n3 16,4 22,0 16,3 20,8 12,6
Chlorella sp.
Compuesto
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control, la concentración de ácido linoleico fue de 41,2%, sin embargo en el
ensayo “estrés luz” no hubo datos disponibles (Tabla 3.9). Para el ácido oleico,
el porcentaje en el ensayo “control nitrato” fue de 13,4% y de 23,6% en el
ensayo “estrés nitrato”. En el ensayo “control Fe”, el porcentaje de ácido oleico
fue de 19,8% y en el ensayo “estrés Fe” de 21,6%. En el ensayo control, la
concentración de ácido oleico fue de 9,5%, y en el ensayo “estrés luz” no hubo
datos disponibles (Tabla 3.9).
Tabla 3.9. Porcentajes (%) de Ácidos Grasos Metil Ester encontrados en los diferentes
tratamientos en T. chuii (n indica el número de réplicas analizadas)
Control
(n=2)
Estrés
Luz
(n=0)
Control
Nitrato
(n=2)
Estrés
Nitrato
(n=3)
Control
Fe (n=1)
Estrés Fe
(n=3)
Mirístico C14:0 1,1 0,4
Hexadecadienoico C16:3 3,0
Hexadecenoico C16:2 0,7 1,1 0,8 4,5
Palmitoleico C16:1 5,1 7,9 8,5 7,3 9,9
Palmitico C16:0 34,0 38,8 46,3 37,7 31,1
Linoleico C18:2n6 41,2 19,5 7,5 13,2 12,7
Oleico C18:1n9 9,5 13,4 23,6 19,8 21,6
Esteárico C18:0 0,7 0,4 3,9 1,1 4,3
Araquidónico C20:4n6 7,3 3,9 2,7 3,2 2,9
Eicosapentaenoico C20:5n3 1,3 13,9 4,5 12,8 11,0
Eicosenoico C20:1n9 1,1 2,0 1,1 1,6
T. chuii
Compuesto
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3.7. Actividad antioxidantes de microalgas Chlorella sp. y T. chuii
De acuerdo a los resultados, una alta actividad antioxidante presentó
Chlorella sp. El extracto con hexano tuvo su mayor porcentaje de actividad
antioxidante en la concentración de 10 mg mL-1 con un porcentaje de 65,7 ±
2,1%. Estadísticamente la actividad antioxidante fue significativamente
diferente entre las concentraciones evaluadas (ANOVA, p = 0,000; Tabla 3.10).
El extracto con DCM tuvo su máxima actividad en la concentración de 10 mg
mL-1 con un valor de 81,6 ± 1,4%, y fue significativamente diferente con
respecto a las otras concentraciones (ANOVA, p = 0,000; Tabla 3.10).
T.chuii presentó un porcentaje de actividad antioxidante de 46,4 ± 2,0%
con el solvente hexano, a una concentración de 10 mg mL-1, además presentó la
menor actividad antioxidante con una concentración de 1 mg ml-1 de 10,8 ±
2,1%. Estadísticamente, los extractos con hexano a diferentes
concentraciones presentaron diferencias significativas (ANOVA; p = 0,000;
Tabla 3.12). T.chuii con DCM presentó alta actividad antioxidante en las
concentraciones de 5 mg mL-1 y 10 mg mL-1 con respecto a la actividad de la
concentración 1 mg mL-1. Estadísticamente presentaron diferencias
significativas (ANOVA, p = 0,000; Tabla 3.10).
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Tabla 3.10. Actividad antioxidante (%) de extractos de microalga en tres concentraciones,
presentados como la media ± error estándar de la media.
a,b,c en la misma línea indican diferencias significativas entre las medias analizadas con el test
de comparaciones múltiples de Scheffe p < 0,05.
BTH es el control positivo.
La concentración media inhibitoria (IC50) para extractos de Chlorella sp.,
con el solvente hexano, fue 6,9 mg mL-1 y 3,4 mg mL-1 con el solvente DCM. El
IC50 para extractos de T. chuii con el solvente hexano fue 12,4 mg mL-1 y 3,3
mg mL-1 con el solvente DCM.
1 mg/mL 5 mg/mL 10 mg/mL
Chlorella sp. Hexano 12,2 ± 1,3 a 34,5 ± 1,8 b 65,7 ± 2,1 c
DCM 21,7 ± 1,2 a 56,7 ± 0,8 b 81,6 ± 1,4 c
T. chuii Hexano 10,8 ± 2,1 a 35,9 ± 0,9 b 46,4 ± 2,0 c
DCM 10,5 ± 2,3 a 68,3 ± 0,8 b 87,7 ± 1,3 c
BHT 86,6 ± 0,4
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4. Discusión
4.1 Crecimiento celular y concentración de lípidos bajo condiciones de
estrés
En el presente estudio, se pudo observar una concentración celular
mayor en los tubos de ensayos control para ambas especies, con respecto a los
cultivos iniciales en volúmenes de 4 L. Ambos sistemas de cultivo (tubos 100 mL
y botellas de 4 L), tuvieron condiciones similares, aunque no fueron cultivadas
en el mismo sitio. En Chlorella sp., la concentración celular final fue de 2,5x10+7
cel mL-1 en botellas de 4 L y 8,7x10+7 cel mL-1; en tubos de 100 mL. En T. chuii
la concentración celular final fue 2,5x10+6 cel mL-1 en botellas de 4 L, y 6x10+6
cel mL-1 en tubos de 100 mL. Estos resultados podrían deberse al material y
volumen de los reactores utilizados, también a las condiciones lumínicas en que
se desarrolló cada cultivo, ya que uno de los principales factores que afectan al
crecimiento celular en cultivos fotoautotróficos, es la luz (Tang et al., 2011).
Según algunos autores (Masojídek et al., 2004; Chisti, 2007), la naturaleza y
disponibilidad de luz en sistemas de cultivo, produce variaciones en el
crecimiento celular y la concentración de lípidos.
De acuerdo a los resultados presentados en este estudio, Chorella sp,
tuvo una tasa de crecimiento (µ), menor que T.chuii en condiciones normales de
crecimiento, calculada durante la fase exponencial (0,13 d-1 y 0,25 d-1
respectivamente). T. chuii, en condiciones normales de crecimiento, entró en la
fase estacionaria luego del día 10 de cultivo y Chlorella sp., luego del día 14. En
el caso de T. chuii, el día 16 de cultivo llegó a una biomasa de 0,62 g L-1, en
cambio Chlorella sp., sólo en el día 19 llegó a la misma concentración (0,62 g L-
1). En términos de costos de producción, una especie con un crecimiento lento
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Página 97
sería menos eficiente que una especie con rápido crecimiento celular y
producción de biomasa (Griffiths & Harrison, 2009). Ahora bien, la eficiencia
de una especie también depende de la productividad lipídica, la cual está
relacionada con la tasa de crecimiento y el contenido de lípidos en la biomasa
(Chisti, 2007; Rodolfi et al., 2009). En T. chuii, la concentración de lípidos por
biomasa seca alcanzados en el día 16 de cultivo, fue menor a lo alcanzado por
Chlorella sp., en el mismo día y posteriores (0,6% para T. chuii; y 1% para
Chlorella sp.), por lo tanto, en este caso, la disminución de la tasa de
crecimiento en microalgas estaría relacionada con el aumento en la
productividad lipídica (Rodolfi et al., 2009; Converti et al., 2009).
En el presente estudio, la concentración máxima de lípidos por peso de
biomasa seca en Chlorella sp., fue de 2,4% y 0,7% en T. chuii, en condiciones
normales de crecimiento. Estos resultados estuvieron muy por debajo en ambas
especies, comparados con estudios previos en especies del mismo género no
sometidas a estrés (Tabla 4.1).
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Página 98
Tabla 4.1. Porcentaje de lípidos por peso seco de biomasa en especies del género Chlorella y
Tetraselmis, evaluadas por diferentes autores
La técnica de fluorescencia utilizada en este estudio fue modificada
desde Chen et al., (2009), variando la temperatura de incubación. El óptimo
encontrado por el autor fue 40°C de temperatura de incubación, dando valores
de fluorescencia superiores a 500 unidades arbitrarias (u.a.), y a 60°C
inferiores a 100 u.a., al testear el método sin muestra de microalga. En este
trabajo se usó 60°C de temperatura de incubación, siendo los valores de
fluorescencia entre 100 y 200 u.a., en el control sin muestra de microalga.
Estos valores indicarían que la temperatura no tuvo efectos negativos en la
cuantificación de la concentración de lípidos por fluorescencia por rojo de Nilo
en la microalga, siguiendo una correlación positiva con respecto a la
concentración de lípidos determinados por el método gravimétrico (Chlorella
sp: R2 = 0,87; T. chuii: R2 = 0,69). Las ecuaciones de la recta de cada especie
Microalga Contenido lipídico
(% biomasa)
Autor
Tetraselmis suecica 15-23 Chisti, 2007
Tetraselmis suecica F&M-M24 12,9 Rodolfi et al. , 2009
Tetraselmis sp. F&M-M34 14,7 Rodolfi et al. , 2009
Chlorella sp. 28-32 Chisti, 2007
Chlorella sorokiniana IAM-212 19,3 Rodolfi et al. , 2009
Chlorella vulgaris CCAP 211/11b 19,2 Rodolfi et al. , 2009
Chlorella vulgaris 18 Illman et al ., 2000
Chlorella emersonii 29 Illman et al ., 2000
Chlorella vulgaris 5,9 Converti et al ., 2009
Chlorella vulgaris 14 – 56 Gouveia and Oliveira, 2009
Chlorella minutissima 57 Gouveia and Oliveira, 2009
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Página 99
de microalga estudiada en el presente trabajo, fueron utilizadas para
determinar la concentración lipídica a partir de valores de fluorescencia.
Algunos estudios han utilizado la técnica de fluorescencia para identificar y
cuantificar lípidos neutros en células de microalgas, con diferentes protocolos
y calibraciones, con longitudes de ondas variables de emisión y excitación,
además de la utilización de diferentes solventes (Elsey et al., 2007). Según
algunos autores, la penetración de la tinción rojo de Nilo, dependería entre
otros factores de la elección del solvente, la temperatura y tiempo de
incubación, rigidez de la pared celular en algunas especies de microalgas, la
presencia de pigmentos, entre otras (Elsey et al., 2007; Chen et al., 2009).
Los resultados de estrés fisiológico por factores abióticos en el
presente estudio para ambas especies, presentaron valores altos en el control
en comparación a los cultivos iniciales no sometidos a estrés (2,4% versus
10,4% en Chlorella sp., y 0,6% versus 5,5% en T.chuii). La variación en estos
porcentajes pudo deberse a las altas concentraciones celulares en los ensayos
estrés y alta fluorescencia que presentaron ambas especies provenientes de
cultivos en tubos de 100 mL.
Luego de ser aplicado cada tipo de estrés, sólo el efecto de la depleción
de nitratos aumentó significativamente la concentración de lípidos con
respecto al ensayo control, en Chlorella sp. En el ensayo estrés de luz, se
presentaron altos valores de concentración de lípidos en toda la experiencia,
aunque estos valores no pueden ser atribuidos al efecto de la luz. En T. chuii
hubo un aumento significativo estadísticamente en la concentración de lípidos
en el ensayo “stres nitratos” con respecto al ensayo “control nitratos”. Estos
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resultados concuerdan con los reportados por Damiani et al., (2010), quienes
sometieron a estrés de luz y depleción de nitrógeno a la especie
Haematococcus pluvialis, presentando aumento significativo de la
concentración de lípidos en los ensayos sometidos a ambos tipos de estrés.
Varios estudios han demostrado que el efecto de la depleción de
nitratos en el medio de cultivo disminuye la tasa de crecimiento celular y
aumenta la concentración de lípidos (Illman et al., 2000; Converti et al, 2009;
Rodolfi et al., 2009; Damiani et al., 2010; Xin et al., 2010). En este estudio,
cada estrés fue aplicado en forma bifásica, es decir, cada estrés comenzó solo
desde la fase exponencial tardía. Los ensayos “estrés nitrato”, “control
nitrato”, “estrés Fe” y “control Fe”, fueron sometidos a centrifugación y
recambio del medio de cultivo en la fase exponencial tardía. Este recambio
puede haber inducido al aumento parcial de la concentración celular, debido a la
renovación total de los componentes del medio de cultivo, excepto el
componente de prueba. En el caso de la depleción de nitratos, la concentración
disminuida no fue del 100%, sino del 75%. Esta fracción de nitratos en el medio
pudo haber ayudado a las células en un corto plazo a seguir con sus procesos
normales de crecimiento.
En cuanto al estrés por depleción de Fe, muy pocos estudios se han
realizado al respecto, aunque en todos concuerdan que niveles elevados de Fe
en el medio provoca estrés oxidativo y bajo crecimiento celular (Estevez et al.,
2001; Shcolnick et al., 2009). Un estudio realizado por Liu et al. (2008),
reportaron que bajas concentraciones de FeCl3 y Fe+ quelado, no indujeron a la
producción de lípidos en Chlorella vulgaris, en cambio concentraciones de
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1,2x10-5 mol L-1 de FeCl3, si indujo a la producción de lípidos en C. vulgaris. En el
presente estudio, la depleción de FeCl3 no indujo al aumento en la
concentración lipídica con respecto al ensayo “control Fe”. Si hubo un aumento
parcial en la concentración celular, y un declive luego que ambos ensayos fueran
sometidos a centrifugación y recambio del medio de cultivo. Estos resultados
podrían deberse a la presencia de Fe intracelular, ya que el medio de cultivo
utilizado en toda la experiencia fue rico en macronutrientes y reforzado en
FeCl3 (Pereira, 2009).
Especies sometidas a un estrés abiótico utilizarían la energía disponible
para acumular lípidos en vez de ser utilizada para crecimiento celular, así
presentarían una disminución en su tasa de crecimiento y aumentaría la
producción lipídica por peso de biomasa seca. De acuerdo a esto, la aplicación
de estrés fisiológico a una cepa de microalga, ha sido el interés actual de
varios autores (Liu et al., 2008; Converti, et al., 2009; Rodolfi et al., 2009;
Damiani et al., 2010; Xin et al., 2010; Chen et al., 2011). En el presente estudio,
los resultados de estrés abióticos en los ensayos, “estrés nitrato” y “estrés
Fe”, en Chlorella sp., y T. chuii, no presentaron diferencias significativas en el
crecimiento celular con respecto a su correspondiente control. Además, la tasa
de crecimiento tuvo leves variaciones luego de que ambas especies fueran
sometidas a estrés en la fase exponencial tardía de cada ciclo de cultivo, no
pudiendo ser relacionada su disminución con el aumento en la concentración
lipídica. A pesar de que en ambas especies estudiadas, hubo un aumento en la
concentración de lípidos por peso seco, en los ensayos estrés (excepto en el
ensayo estrés Fe de la especie Chlorella sp.), sólo el ensayo “estrés Nitrato”
tuvo un aumento significativo luego de ser aplicado el estrés. Converti et al.
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(2009), analizaron la tasa de crecimiento específica en Chlorella vulgaris y
Nannochloropsis oculata, al ser sometidas a estrés de temperatura y NaNO3.
En C. vulgaris, la tasa de crecimiento específica no fue afectada en
comparación al control, al ser sometidas a temperaturas entre los 25 y 30ºC,
tampoco al ser privadas de NaNO3, aunque sí fue incrementada su
concentración lipídica en ambos casos. En cuanto a N. oculata, no hubo una
relación entre la disminución de la tasa de crecimiento específica y el aumento
de la concentración lipídica al disminuir la temperatura; en cambio, si hubo una
disminución en la tasa de crecimiento específica al ser sometida a privación de
NaNO3 con respecto al control, y su concentración lipídica aumentó
significativamente. Estos antecedentes demuestran que microalgas sometidas
a estrés fisiológico, no siempre responden a la relación entre la disminución de
la tasa de crecimiento y el aumento en la concentración lipídica.
Los principales ácidos grasos encontrados en algas verdes son aquellos
con cadenas entre 16 y 18 carbonos (Hu et al., 2008, Damiani et al., 2010), tal
como indican los resultados del presente trabajo. Los ácidos grasos pueden ser
divididos por su composición química en saturados, monoinsaturados y
poliinsaturados, dependiendo de los dobles enlace en las cadenas de carbono.
Los ácidos grasos saturados y monoinsaturados son los ideales para la
obtención de biodiesel debido a la alta volatilidad y mayor afinidad con los
motores convencionales (Amin 2008; Basha et al., 2009), y principalmente
favorables para el transporte aeronáutico (Brenan & Owende, 2010). Los
principales ácidos grasos encontrados en Chlorella sp., fueron el ácido
palmítico, palmitoleico y eicosapentaenoico. En T. chuii, los principales ácidos
grasos encontrados fueron el ácido palmítico, el ácido linoleico y el ácido oleico,
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este último, considerado el ácido graso ideal para la elaboración de biodiesel
(Knothe, 2005). En el presente trabajo, el ácido palmítico tuvo las mayores
concentraciones en ambas microalgas y con los distintos tipos de estrés,
exceptuando el estrés de “intensidad de luz”, el cual no tuvo datos disponibles
en el presente estudio para ambas especies. En Chlorella sp., el ácido palmítico
aumenta desde 32,3% en el ensayo “control nitrato” a 34,4% en el ensayo
“estrés nitrato”. En T. chuii, el ácido palmítico aumenta desde un 38,8% en el
ensayo “control nitrato” a un 46,3% en el ensayo “estrés nitrato”. En el ensayo
“estrés Fe” no presenta un aumento y en el ensayo “intensidad de luz” no se
encuentran datos disponibles. Según Damiani et al. (2010), el ácido palmítico se
ve afectado en su concentración cuando las microalgas son sometidas a estrés,
lo cual se ve correspondido en el ensayo “estrés nitrato” para ambas especies
de microalgas.
En T. chuii, el ácido oleico presenta un aumento de 13,4% en el ensayo
“control nitrato” a un 23,6% en el ensayo “estrés nitrato”, y de un 19,8% en el
ensayo “control Fe” a un 21,6% en el ensayo “estrés Fe”. En este estudio,
ambas microalgas presentaron altos porcentajes de estos ácidos grasos ideales
para la elaboración de biodiesel, aunque no todos los ácidos grasos presentan la
misma eficiencia y calidad requerida por los estándares mundiales. Una gran
cantidad de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA´s) están presentes
generalmente en microalgas (Harwood &Guschina, 2009). Estos ácidos grasos,
generalmente son menos eficientes para la fabricación de biodiesel por la
inestabilidad que poseen producto de sus dobles enlaces. Para cumplir con los
requisitos de las normas europeas sobre estándar de calidad de biodiesel para
vehículos (EN 14214), uno de los principales requerimientos son la estabilidad
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del biodiesel frente a la oxidación, siendo el ácido linoleico y linolénico, quienes
presentarían una susceptibilidad especial a la oxidación cuando el biodiesel
debe ser almacenado (Knothe, 2005). En el presente estudio, T. chuii presentó
el segundo más alto porcentaje en la concentración de ácido linoleico, con
porcentaje de 41,2% en el ensayo control. En el ensayo “control nitrato” el
porcentaje disminuyó desde un 19,5%, a un 7,5% en el ensayo “estrés nitrato”.
En el ensayo “control Fe” el porcentaje disminuyo desde un 13,2% a un 12,7%,
en el ensayo “estrés Fe”. En Chlorella sp., los porcentajes de ácido linoleico
fueron menores al 13,4% de la composición total de ácidos grasos. En cuanto a
los estándares europeos permitidos de ácido linoleico en biodiesel para
vehículos (EN 14214), este ácido graso puede alcanzar un porcentaje de 12%
(mol/mol), además el contenido de EMAG con más de cuatro dobles enlaces,
sólo puede alcanzar el 1% (mol/mol), en el biodiesel para vehículos, según la
norma europea.
Los PUFA´s poseen un gran potencial nutricional tanto para animales
como para humanos. Según información recopilada por Harwood & Guschina
(2009), los PUFA´S como el ácido linoleico, el ácido araquidónico (ARA), el
ácido eicosapentaenoico (EPA), y el ácido docosahexaenoico (DHA), son usados
como suplementos nutricionales en formulaciones infantiles, además el EPA y
DHA, son ampliamente utilizados en la nutrición de organismos de acuicultura.
Por otra parte, los EPA y DHA, forman parte de los ácidos grasos esenciales en
seres humanos, por lo cual su deficiencia en los organismos, estaría vinculado a
una propensión en enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer.
Chlorella sp., tuvo un alto porcentaje de EPA en el presente estudio, con
valores de 16,4% en el ensayo control, en el ensayo “control nitrato”, presentó
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un valor de 22%, y un valor de 16,3% en el ensayo “estrés nitrato”. En el ensayo
“control Fe”, tuvo un porcentaje de 20,85% Y 12,6% en el ensayo “estrés Fe”.
En T. chuii, los porcentajes de EPA estuvieron por debajo del 13,9% del total
de ácidos grasos. Estos resultados indican que tanto Chlorella sp., como T.
chuii, al ser sometidas a estrés aumentan la concentración de ácidos grasos
ideales para la elaboración de biodiesel y disminuyen la concentración de
aquellos ácidos grasos que afectan su elaboración, por otra parte poseen un
perfil de ácidos grasos ideales para la obtención de compuestos nutricionales.
4.2 Actividad Antioxidante de microalgas Chlorella sp. y Tetraselmis chuii
De acuerdo a los resultados presentados en este estudio, la actividad
antioxidante presentada por los extractos de Chlorella sp. y T. chuii con el
solvente apolar hexano tuvo diferencias significativas entre las
concentraciones analizadas en este estudio. Estos resultados se acercan a los
encontrados por Custodio et al., (2012) para microalgas Tetraselmis chuii y
Chlorella minutissima, aunque los porcentajes de actividad antioxidante
obtenidos en la concentración de 10 mg mL-1 en este estudio para la especie T.
chuii, son menores en comparación a los resultados presentados por el autor
(46,4 ± 2% versus 68,1 ± 2,3%; respectivamente).
Los resultados mostrados por el solvente de polaridad intermedia
diclorometano (DCM), presenta alta actividad en ambas microalgas para
concentraciones de 5 y 10 mg ml-1, con porcentajes superiores al 50%. Además,
la actividad antioxidante en la concentración de 10 mg mL-1, es similar a la
producida por el antioxidante sintético BHT, con porcentajes por sobre el
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80%. Resultados similares en la actividad antioxidante con DCM fueron
encontrados para las microalgas Isochrysis. galbana y Chaetoceros calcitrans,
mostrando altos porcentajes 97,1 ± 0,1% y 97,4 ± 0,4% frente a la
peroxidación del ácido linoleico (Natrah et al., 2007). La concentración media
inhibitoria (IC50) para el extracto Chlorella sp., con hexano resultó ser 6,9 mg
mL-1, en cambio con DCM fue de 3,4 mg mL-1, Para T.chuii el IC50 con el
solvente hexano registró una concentración de 12,1 mg mL-1 y 3,3 mg mL-1 con el
solvente DCM. Estos resultados indicarían que los extractos de microalgas
Chlorella sp. y T.chuii, poseen una alta actividad antioxidante de compuestos de
polaridad intermedia y apolares en los cuales estarían ubicados derivados de
ácidos grasos y terpenoides (ej. Carotenoides, entre otros) (Herrero et al.,
2006). Según Custodio et al. (2012), la actividad antioxidante en microalgas
por solventes apolares no puede ser atribuida a compuestos fenólicos,
importantes antioxidantes y secuestradores de radicales libres en
enfermedades neurodegenerativas, debido a que estos radicales libres poseen
alta afinidad por solventes polares.
Las microalgas representan un recurso promisorio de antioxidantes
naturales. Sin embargo, no todos los grupos de microalgas se pueden utilizar
como fuentes naturales de antioxidantes, debido a su variado contenido en
compuestos objetivo, variabilidad en la tasa de crecimiento, facilidad de
cultivo o el rendimiento de sus compuestos (Li et al., 2007). El presente
estudio sólo estuvo enfocado en los compuestos bioactivos de naturaleza
apolar, importantes antioxidantes con amplios beneficios para la salud humana.
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Estudios posteriores debieran enfocarse en la identificación y
aislamiento de compuestos bioactivos de naturaleza apolar importantes para la
nutrición y salud de diversos organismos, incluyendo humanos.
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5. Conclusión
En el presente estudio Chlorella sp., cultivada en condiciones normales de
laboratorio y sistema tipo batch, tuvo mejores rendimientos lipídicos en
comparación a T. chuii.
En los ensayos de estrés abiótico, el “estrés de luz” tuvo mejores
resultados en cuanto a la concentración lipídica en Chlorella sp., aunque un
aumento significativo solo puede ser atribuido al estrés nitrato, luego de ser
aplicado dicho estrés. En Tetraselmis chuii, la concentración de lípidos fue
superior significativamente en el ensayo estrés nitrato con respecto a su
control, luego de ser aplicado dicho estrés.
El perfil lipídico mostró que los principales ácidos grasos encontrados en
Chlorella sp., fueron el ácido palmítico, ácido palmitoleico y ácido
eicosapensatenoico, y en T. chuii, fueron los ácido palmítico, linoleico y oleico,
este último importante para la elaboración de biodiesel. Los resultados
estuvieron basados en el porcentaje de la concentración de cada ácido graso,
por la concentración total en cada ensayo. Todos los ácidos grasos
determinados en el perfil lipídico tienen propiedades tanto para la fabricación
de biodiesel, como para nutrición animal y humana.
El porcentaje de actividad antioxidante en las microalgas Chlorella sp. y T.
chuii, a través de la técnica de DPPH, presentó diferencias significativas
utilizando distintas concentraciones de extractos, siendo las concentraciones
mayores quienes presentaron mejores porcentajes de actividad. El IC50 tuvo
mejores resultados con el solvente de polaridad intermedia DCM, para ambos
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extractos de microalgas. Estudios posteriores se deberían enfocar en
identificar los compuestos bioactivos responsables de la actividad antioxidante
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