ESERCITAZIONI 2008 APPLICAZIONI DI GENETICA UMANA E MOLECOLARE Quantizzazione delle proteine...

ESERCITAZIONI 2008APPLICAZIONI DI GENETICA

UMANA E MOLECOLARE

• Quantizzazione delle proteine• Applicazioni delle proteine di fusione

Quantizzazione delle proteine tramite reattivo di Bradford

N+

N

Coomassie Brilliant Blu R

HN

OCH2CH3

SO3Na

SO3Na

Il legame del colorante Il legame del colorante Coomassie Brilliant BlueCoomassie Brilliant Blue G-250 alle G-250 alle proteine proteine determina uno spostamento del massimo di assorbimento del determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, 1976)1976)

Quantizzazione delle proteine tramite reattivo di Bradford

• Tale colorante forma forti complessi non covalenti con le Tale colorante forma forti complessi non covalenti con le proteine tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminici e proteine tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminici e carbossilici e tramite forze di van der Waalscarbossilici e tramite forze di van der Waals

• Il colorante è preparato come soluzione Il colorante è preparato come soluzione stockstock in acido fosforico in acido fosforico

• Il metodo è un semplice procedimento costituito da un unico Il metodo è un semplice procedimento costituito da un unico passaggio in cui il colorante è aggiunto ai campioni e si determina passaggio in cui il colorante è aggiunto ai campioni e si determina l’assorbanza a 595 nml’assorbanza a 595 nm

• La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di proteina presente in soluzione, pertanto l’intensità del colore blu (e proteina presente in soluzione, pertanto l’intensità del colore blu (e dunque l’assorbimento) è proporzionale alla concentrazione dunque l’assorbimento) è proporzionale alla concentrazione proteica. In genere quantità uguali di proteine differenti legano la proteica. In genere quantità uguali di proteine differenti legano la stessa quantità di colorante → stessa quantità di colorante → il saggio è indipendente dal tipo di il saggio è indipendente dal tipo di proteinaproteina

•

VANTAGGI• Semplicità di preparazione del reattivo• Sviluppo del colore immediato• Stabilità del complesso• Elevata sensibilità (fino a 22 µg/ml)• Il saggio è compatibile con la maggior parte dei tamponi

comuni,degli agenti denaturanti come guanidina·HCl 6M e urea 8 M e dei preservanti come sodio azide

SVANTAGGISVANTAGGI• Il reagente colora le cuvette ed è piuttosto difficile da rimuovere• La quantità di colorante che si lega alla proteina dipende dal

contenuto in aminoacidi basici → ciò rende difficile la scelta di uno standard

• Molte proteine non sono solubili nella miscela di reazione acida

Quantizzazione delle proteine tramite reattivo di Bradford

• Saggi di Pull-Down• Doppio Ibrido• Saggi di legame

APPLICAZIONI DELLE PROTEINE DI FUSIONE

Pull-Down

• Tecnica per verificare interazioni proteina-proteina “sospette”

ESCAProteina di fusione

PREDAProteina d’interesse

(eucariotica)

Pull-Down

• Produrre la proteine di fusione (ex: GST-proteina)• Purificare la proteina di fusione (ex: GST-Resina

Glutatione)• Controllare su gel di poliacrilammide la qualità

della purificazione• Preparare gli estratti cellulari eucariotici che

contengono la proteina d’interesse

Preda

Pull-DownESPERIMENTO CONTROLLO

GST EscaResina

Estratto cellulare

PredaX

lavaggi

GST EscaResina

X

GSTResina

Estratto cellulare

PredaX

lavaggiX

GSTResina Preda

JYZ JY

Z

Z Z

Pull-DownVerifica dell’interazione tramite SDS-Page Western Blot

SDS-PAGE TRASFERIMENTO WESTERN BLOT

WESTERN BLOTWESTERN BLOT

BLOCKING ANTICORPOPRIMARIO

ANTICORPOSECONDARIO

SVILUPPO

Pull-DownVerifica dell’interazione tramite SDS-Page Western Blot

MK INPUT CO ESP

La nostra proteinad’interesse è stata legatadalla proteina di fusione!

Il controllo è pulito

Pull-Down

LIMITI DEL SAGGIO:• Necessità di controlli negativi, presenza di legami

aspecifici alla resina.• Interazioni deboli o transienti potrebbero non

essere rilevate.• La presenza del tag potrebbe interferire con il

legame.• E’ un sistema forzato che potrebbe non

rispecchiare l’effettiva situazione biologica.

Sistema del Doppio Ibrido

Con questa tecnica è possibile individuare interazioni proteina-

proteina.Si basa sulla proprietà dei fattori di trascrizione di essere

organizzati funzionalmente in domini distinti1)Il dominio legante il DNA (DBD)2)Il dominio di transattivazione (AD)

I domini proteici sono normalmente identificati a classificati in base alle loro caratteristiche strutturali, funzionali e legate all’evoluzione.

Un dominio può quindi essere descritto come un’unità strutturale foldata, compatta e autonoma, conservata durante l’evoluzione e in grado di funzionare indipendentemente dal contesto a cui appartiene la proteina.

Sistema del Doppio Ibrido

Sperimentalmente è quindi possibile scindere due domini di una proteina che singolarmente non funzionerebbero, e fare in modo che riaquistino la loro funzionalità “rincontrandosi”.

Sistema del Doppio Ibrido

AD

DBDBAD

DBAD

AD

DB

Sistema del Doppio Ibrido Tra i fattori di trascrizione più utilizzati c’è GAL4, che legando il

promotore di Lacz permette la trascrizione della β-galattosidasi. Se nel mezzo di coltura è presente X-Gal, la β-galattosidasi è in

grado di scinderla e le colonie che hanno integrato il plasmide si colorano di blu.

Lacz

Gal4

β-galattosidasi X-Gal

UAS

Creazione di due ibridi:• DBD Hybrid: costituito dal dominio DBD fuso alla proteina

d’interesse (Esca). Questa proteina di fusione può legare il DNA, ma non è in grado di attivare la trascrizione.

• AD Hybrid: costituito dal dominio AD fuso ad un’altra proteina (Preda). Normalmente viene utilizzata una libreria di DNA.

Sistema del Doppio Ibrido

Sistema del Doppio Ibrido

Peptide Microarray

Peptide Microarray

High signal intensity

Low signal intensity

Positive data set Negative data set