Estudio del mecanismo de la pirazinamidasa de Mycobacterium tuberculosis. Mecanismo de resistencia a...

Estudio del mecanismo de la pirazinamidasa de

Mycobacterium tuberculosis. Mecanismo

de resistencia a la pirazinamida.

Jon López-Llano, Ph. D.

Laboratorios de Investigación y Desarrollo, UPCH

INTRODUCCIÓN

• La tuberculosis causa casi 2 millones de muertes al año.• La tuberculosis tiene cura pero aun así mata a 5000 personas al día.• El 98% de las muertes por TB se producen en países en vías de

desarrollo y corresponden en su mayoría a adultos jóvenes en los años más productivos.

• La tuberculosis en la principal causa de muerte en las personas infectadas por el VIH.

• Si no se controla, la tuberculosis matara otros 35 millones de personas en los próximos 20 años.

• 2 mil millones de personas, es decir, una tercera parte de la población mundial, están infectadas por el bacilo tuberculoso.

• La MDR-TB está presente en casi todos los 109 países estudiados recientemente por la OMS/WHO y sus asociados.

• Cada año surgen 425000 casos nuevos de MDR-TB.

WHO 2005

INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

Niveles de resistencia de diferentes drogas en pacientes con tratamiento estandar en el Perú (1997-2003)

Etionamida (E) 40%Etambutol (Et) 45%Pirazinamida (PZA) 30%Ciprofloxacino (C) 4%Kanamicina (K) 3%

Unidad Técnica TBMDR- MINSA -2003

El problema de MDR-TB en Perú

Importancia de la PZA en el tratamiento de TB

• Capaz de eliminar bacilos de Mycobaterium tuberculosis en estado latente (efectividad del 95%).

• Su uso acorta el tratamiento de 9 a 6 meses.

Mecanismo antibacteriano de la PZA

Causas de resistencia a PZA:

Mal funcionamiento de la PZasa (80-99%)

Fallas sistema flujo/eflujo

Falta de toma de PZA

Expresión inadecuada de PZasa

Hidrólisis de la Pirazinamida

Nicotinamidasa/Pirazinamidasa

Estructura tridimensional

de la Pirazinamidasa

Estructura 3D de la PZasa

P. HorikoshiiPzasa con homología de secuencia 37%

Otro modelo a partir de N-carbamoylsarcosine amidohydrolase (CSHasa) de Arthrobacter sp., de parecida función y homolgía 26%

Estructura 3D de la PZasa

P. Horikoshii M. tuberculosis

Estructura 3D de la PZasa

Estructura 3D de la PZasa

M. tuberculosis

H51

H71

D49 D8A134

C138

Sitio unión metal

D49

H51

H71

Sitio activo

D8

A134

C138

Hidrólisis de la Pirazinamida

Distribución de mutaciones missense en PZasa en cepas aisladas en el

Perú

Distribución de mutaciones missense en PZasa en cepas aisladas en el resto del

mundo

363 mutaciones diferentes reportadas a nivel del gen

Clonación y Purificación de PZasa H37RV (y mutantes)

Clonamiento de la PZasa

S. T. Cole et. al., Nature (1998).

ATGCGGGCGTTGATCATCGTCGACGTGCAGAACGACTTCTGCGAGGGTGGCTCGCTGGCGGTAACCGGTGGCGCCGCGCTGGCCCGCGCCATCAGCGACTACCTGGCCGAAGCGGCGGACTACCATCACGTCGTGGCAACCAAGGACTTCCACATCGACCCGGGTGACCACTTCTCCGGCACACCGGACTATTCCTCGTCGTGGCCACCGCATTGCGTCAGCGGTACTCCCGGCGCGGACTTCCATCCCAGTCTGGACACGTCGGCAATCGAGGCGGTGTTCTACAAGGGTGCCTACACCGGAGCGTACAGCGGCTTCGAAGGAGTCGACGAGAACGGCACGCCACTGCTGAATTGGCTGCGGCAACGCGGCGTCGATGAGGTCGATGTGGTCGGTATTGCCACCGATCATTGTGTGCGCCAGACGGCCGAGGACGCGGTACGCAATGGCTTGGCCACCAGGGTGCTGGTGGACCTGACAGCGGGTGTGTCGGCCGATACCACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCGCCAGCGTCGAGTTGGTTTGCAGCTCCTGA

Purificación de la PZasa

Movie

Purificación de la PZasa

Relación entre la eficiencia de la PZasa

y la resistencia microbiológica (MIC, Wayne) de M.

tuberculosis

Parámetros cinéticos de la PZasa

Cinética

Michaelis-Menten

Vmax [S]V0 =

Km +[S]

Parámetros cinéticos de la PZasa

H37Rv

D12A

D12G

G24D

Y34D

K48T

D49N

H51R

G78C

F94L

T135P

D136G

Parámetros cinéticos de la PZasa

Método Wayne

• Ensayo de actividad pirazinamidasa in vivo

Cálculo MIC

• Concentración mínima inhibitoria

• Métodos BACTEC

Lowenstein-Jensen

Middlebrook 7HX

Parámetros cinéticos de la PZasa

Obtención de la estructura

tridimensional de la PZasa

Cristalización de la PZasa

Gota colgante

Cristalización de la PZasa

Buffer control 4ª semana PZAsa 1ª semana

PZAsa 2ª semana PZAsa 3ª semana

Exploración de las condiciones óptimas de cristalización (1536 condiciones)

“Hampton-Woodward” Medical Institute, University of Buffalo NY. USA. (Dr. Willliam Duax)

Cristalización de la PZasa

•Mejorar el modelo de la PZasa H37Rv.

•Optimizar la producción de cristales y obtener la estructura 3D de la

PZasa H37Rv (y mutantes).

•Determinar el contenido metálico del enzima mediante Fluorescencia de

rayos X.

•Estudiar el efecto de diferentes metales en la actividad de la PZasa, en la

proteína quelada y sin quelar.

•Determinar el efecto de las mutaciones a nivel molecular y proponer un

mecanismo de reacción para la hidrólisis de la PZA.

•Obtener anticuerpos monoclonales anti-PZasa para su posible uso como

diagnóstico.

Trabajo pendiente

Laboratorio de Bioinformática

Wilfredo EvangelistaDaniel RuedaMirko Zimic

Miembros del Equipo

Laboratorio de Enfermedades Infecciosas

Patricia FerrerGina ChristiansenJon López-LlanoPatricia Sheen