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Estudio del mecanismo de la pirazinamidasa de
Mycobacterium tuberculosis. Mecanismo
de resistencia a la pirazinamida.
Jon López-Llano, Ph. D.
Laboratorios de Investigación y Desarrollo, UPCH
INTRODUCCIÓN
• La tuberculosis causa casi 2 millones de muertes al año.• La tuberculosis tiene cura pero aun así mata a 5000 personas al día.• El 98% de las muertes por TB se producen en países en vías de
desarrollo y corresponden en su mayoría a adultos jóvenes en los años más productivos.
• La tuberculosis en la principal causa de muerte en las personas infectadas por el VIH.
• Si no se controla, la tuberculosis matara otros 35 millones de personas en los próximos 20 años.
• 2 mil millones de personas, es decir, una tercera parte de la población mundial, están infectadas por el bacilo tuberculoso.
• La MDR-TB está presente en casi todos los 109 países estudiados recientemente por la OMS/WHO y sus asociados.
• Cada año surgen 425000 casos nuevos de MDR-TB.
WHO 2005
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
Niveles de resistencia de diferentes drogas en pacientes con tratamiento estandar en el Perú (1997-2003)
Etionamida (E) 40%Etambutol (Et) 45%Pirazinamida (PZA) 30%Ciprofloxacino (C) 4%Kanamicina (K) 3%
Unidad Técnica TBMDR- MINSA -2003
El problema de MDR-TB en Perú
Importancia de la PZA en el tratamiento de TB
• Capaz de eliminar bacilos de Mycobaterium tuberculosis en estado latente (efectividad del 95%).
• Su uso acorta el tratamiento de 9 a 6 meses.
Mecanismo antibacteriano de la PZA
Causas de resistencia a PZA:
Mal funcionamiento de la PZasa (80-99%)
Fallas sistema flujo/eflujo
Falta de toma de PZA
Expresión inadecuada de PZasa
Hidrólisis de la Pirazinamida
Nicotinamidasa/Pirazinamidasa
Estructura tridimensional
de la Pirazinamidasa
Estructura 3D de la PZasa
P. HorikoshiiPzasa con homología de secuencia 37%
Otro modelo a partir de N-carbamoylsarcosine amidohydrolase (CSHasa) de Arthrobacter sp., de parecida función y homolgía 26%
Estructura 3D de la PZasa
P. Horikoshii M. tuberculosis
Estructura 3D de la PZasa
Estructura 3D de la PZasa
M. tuberculosis
H51
H71
D49 D8A134
C138
Sitio unión metal
D49
H51
H71
Sitio activo
D8
A134
C138
Hidrólisis de la Pirazinamida
Distribución de mutaciones missense en PZasa en cepas aisladas en el
Perú
Distribución de mutaciones missense en PZasa en cepas aisladas en el resto del
mundo
363 mutaciones diferentes reportadas a nivel del gen
Clonación y Purificación de PZasa H37RV (y mutantes)
Clonamiento de la PZasa
S. T. Cole et. al., Nature (1998).
ATGCGGGCGTTGATCATCGTCGACGTGCAGAACGACTTCTGCGAGGGTGGCTCGCTGGCGGTAACCGGTGGCGCCGCGCTGGCCCGCGCCATCAGCGACTACCTGGCCGAAGCGGCGGACTACCATCACGTCGTGGCAACCAAGGACTTCCACATCGACCCGGGTGACCACTTCTCCGGCACACCGGACTATTCCTCGTCGTGGCCACCGCATTGCGTCAGCGGTACTCCCGGCGCGGACTTCCATCCCAGTCTGGACACGTCGGCAATCGAGGCGGTGTTCTACAAGGGTGCCTACACCGGAGCGTACAGCGGCTTCGAAGGAGTCGACGAGAACGGCACGCCACTGCTGAATTGGCTGCGGCAACGCGGCGTCGATGAGGTCGATGTGGTCGGTATTGCCACCGATCATTGTGTGCGCCAGACGGCCGAGGACGCGGTACGCAATGGCTTGGCCACCAGGGTGCTGGTGGACCTGACAGCGGGTGTGTCGGCCGATACCACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCGCCAGCGTCGAGTTGGTTTGCAGCTCCTGA
Purificación de la PZasa
Movie
Purificación de la PZasa
Relación entre la eficiencia de la PZasa
y la resistencia microbiológica (MIC, Wayne) de M.
tuberculosis
Parámetros cinéticos de la PZasa
Cinética
Michaelis-Menten
Vmax [S]V0 =
Km +[S]
Parámetros cinéticos de la PZasa
H37Rv
D12A
D12G
G24D
Y34D
K48T
D49N
H51R
G78C
F94L
T135P
D136G
Parámetros cinéticos de la PZasa
Método Wayne
• Ensayo de actividad pirazinamidasa in vivo
Cálculo MIC
• Concentración mínima inhibitoria
• Métodos BACTEC
Lowenstein-Jensen
Middlebrook 7HX
Parámetros cinéticos de la PZasa
Obtención de la estructura
tridimensional de la PZasa
Cristalización de la PZasa
Gota colgante
Cristalización de la PZasa
Buffer control 4ª semana PZAsa 1ª semana
PZAsa 2ª semana PZAsa 3ª semana
Exploración de las condiciones óptimas de cristalización (1536 condiciones)
“Hampton-Woodward” Medical Institute, University of Buffalo NY. USA. (Dr. Willliam Duax)
Cristalización de la PZasa
•Mejorar el modelo de la PZasa H37Rv.
•Optimizar la producción de cristales y obtener la estructura 3D de la
PZasa H37Rv (y mutantes).
•Determinar el contenido metálico del enzima mediante Fluorescencia de
rayos X.
•Estudiar el efecto de diferentes metales en la actividad de la PZasa, en la
proteína quelada y sin quelar.
•Determinar el efecto de las mutaciones a nivel molecular y proponer un
mecanismo de reacción para la hidrólisis de la PZA.
•Obtener anticuerpos monoclonales anti-PZasa para su posible uso como
diagnóstico.
Trabajo pendiente
Laboratorio de Bioinformática
Wilfredo EvangelistaDaniel RuedaMirko Zimic
Miembros del Equipo
Laboratorio de Enfermedades Infecciosas
Patricia FerrerGina ChristiansenJon López-LlanoPatricia Sheen