KLONLAMA VEKTÖRLERİoyilmaz.org/document/klonlama.pdfÖnceleri genetik inceleme için ... Slayt 1...

KLONLAMA VEKTÖRLERİ

DR. ONUR YILMAZ

ADÜ ZİRAAT FAKÜLTESİZOOTEKNİ BÖLÜMÜ

BİYOMETRİ & GENETİK ABD

Vektörler, kendilerine eklenen yabancı DNA parçasınıkonakçı hücreye taşıyan ve burada çoğalmasınısağlayan küçük DNA parçalarıdır.

Kendini ve taşıdığı herhangi bir DNA parçasını bağımsız olarak replike edebilmelidir.

Klonlanacak DNA parçasının insersiyonuna olanak tanıyan birçok tanıma dizisi içermelidir.

ori

Vektörde seçicilik sağlayan “marker genler” bulunmalıdır. Bunlar, vektör taşıyan ve taşımayan konak hücreleri ayırmak için gereklidir.

• Bunlar; antibiyotik direnç genleri ya da

koloni rengini değiştirecek genler

olabilir.

• Vektör ve vektörün taşıdığı DNA parçası

konaktan kolaylıkla ayrıştırılabilmelidir.

Plasmidler Bakteriyofajlar Cosmidler Bakteri Yapay Kromozomları (BAC) Maya Yapay Kromozomları (YAC) Memeli Yapay Kromozomları (MAC) İnsan Yapay Kromozomları (HAC) İfade Vektörleri

Günümüzde en sık kullanılan vektörler Plasmid Bakteriyofaj Cosmid Yapay Kromozomal vektörlerdir

1947-59 --Professor of genetics at the University of Wisconsin. Conducts research in the genetics of E. coli and Salmonella as well as on antibody formation. Discovers and names plasmids, particles of DNA

in bacterial cells that replicate separately from chromosomal DNA

Joshua Lederberg (1925-2008)

Plasmid, çoğu bakteri türünde doğal olarak bulunan,

Bağımsız olarak replike olabilen, Bakterinin kendi kromozomu

dışındaki çift zincirli halkasal veya süper sarmallı DNA molekülleridir.

• Plazmid varlığı genellikle bulunduğu bakteriye

avantaj sağlar.

• Bunlar; antibiyotiklere, ağır metallere ve olumsuz

çevre şartlarına direnç sağlayan genleri taşıyabilir.

• Klonlama vektörleri olarak kullanılan ilk plazmidler

1970’li yıllarda kullanılan ve E. coli’de doğal olarak

bulunan bakteriyel plazmidlerdi.

• Klonlanmak istenen DNA fragmanını, plazmid vektöre

aktarmak için restriksiyon enzimleri kullanılır.

Plazmid vektör

rekombinant plazmid

aynı restriksiyon enzimi ile kesim hedef DNA’nın

plazmid vektöre aktarılması

yabancı DNA segmenti

hedef DNA fragmanı

• Restriksiyon enzimleri ile kesilerek doğrusal hale

getirilen plazmid ile aynı yapışkan uçlara sahip

yabancı DNA fragmanı birbirlerine kolayca tutunur

ve birlikte tekrar halkasal forma dönerler.

Yapışkan uçlar

EcoRI

• Her restriksiyon enzimi yapışkan yapışkan uçlar

üretir mi?

• DNA ligaz enzimi, plazmid DNA'sı ile hedef DNA

fragmanının birbirlerine kovalent olarak sıkı bir şekilde

bağlanmasını sağlar.

rekombinant plazmid

DNA ligaz

hedef DNA fragmanı

Oluşturulan rekombinant DNA kendisini alabilecek

ve replikasyonuna olanak sağlayacak uygun bir alıcı

hücreye aktarılır.

• pBR322 plazmidinin alıcı

hücresi bu plazmidlerin ait

olduğu E. coli

• pUB110 plazmidi için

uygun alıcı hücre

Bacillus subtilis 'tir.

Plazmid vektör

+

Klonlanacak DNA fragmanı

DNA fragmanınınPlasmid vektöre

eklenmesiRekombinant

plazmid

E.coli ile plazmidCaCl2 ve ampisilinli nütrient

agarda inkübasyon

Plazmidi alamayanE. coli ölür

Plazmidi alan E. coli yaşar

Plazmidin replikasyonu

üreme

AmpR

Amp R.

ori

ori

• Yabancı DNA fragmanı, direnç genlerinden birini kodlayan bölge

içerisine yerleştirilirse, bu direnç geni insersiyonel olarak inaktive

olur.

DNA fragmanlarının plazmide bağlanması

pUC18 plazmid vektörü ampisilin direnç genine ve β-galaktozidaz enzimini kodlayan lacZ gen bölgesine sahiptir .

Bu plasmidi barındıran E.coli’ler ampisilin ve X gal içeren besi yerinde üreyerek mavi renk verirler.

Hedef DNA’nın bu bölgeye eklenmesi bu genin transkripsiyonunu durdurur.

Bu durumda E.coli kolonileri beyaz renkte olacaktır

DNA fragmanlarının plazmide bağlanmasıRE ile kesim

Ap dirençli, lac negatifbeyaz koloni

Ap dirençli, lac pozitifmavi koloni

Mavi-beyaz tarama yönteminde kullanılan pUC serisi plazmidler aynı zamanda çoklu klonlama bölgesine sahiptirler.

Bu tür vektörler, alıcı hücre tarafından aktive edilebilecek promotor bölgelerini de taşırlar. Böylece plazmidin ekspresyon şansı arttırılmış olur.

Bakterileri enfekte eden virüslerdir. Tüm virüsler gibi basit bir yapıya

sahiptirler. Genellikle baş, boyun, kuyruk ve

kuyruk fibrillerinden oluşmakla birlikte filamentöz yapıda olanları da vardır

Bakteriyofajlar, enfekte ettikleri bakteride litik ve lizojenikolmak üzere iki farklı hayat döngüsüne sahiptirler

λ-DNA profaj

LizojenikLitik

En çok çalışılmış bakteriyofajlardanbirisi E. coli’ye ait lambda (λ) bakteriyofajıdır.

Bakteriyofaj DNA’sının her iki ucunda (5’ uçlarında) 12 bazlık ve birbirinin tamamlayıcısı olan nükleotid dizileri mevcuttur.

Bu uçlar tıpkı restriksiyon enzimi kesimi sonucu oluşan yapışkan uçlara benzer (cos-cohesive end)

cos

λ Faj Genomu

cos

Bu yapışkan uçlar sayesinde doğrusal yapıda olan fajgenomu, bakteri hücresine girdiğinde halkasal hale gelir. Bağlanma bölgesi, plazmidlerde olduğu gibi ligaz enzimleri sayesinde onarılır.

Halkasal faj genomu

Konak genomu

Bakteriyofaj genomuna eklenecek hedef DNA’nın büyüklüğü en fazla 20 kb kadar olabilir.

Kosmid vektörler, bir bakteriye ait ve replikasyon orijin bölgesine sahip plasmidle, buna birleştirilmiş lambda fajıyapışkan ucundan (cos, cohesive ends) oluşturulmuşlardır

35-40 kb uzunluğunda yabancı bir DNA fragmanını kabul edebilir ve alıcı hücreye aktarabilir.

Restriksiyon enzimiyle kesim ve hedef DNA fragmanı ile ligasyondan sonra oluşan DNA, λ faj partiküllerine paketlenir.

Orikozmid

Ampr

cos

MCS

Ampr MCS cos ori

Ampr cos ori

Yabancı DNA fragmanı

Daha büyük DNA parçalarının (1 Mb’dan daha fazla) klonlanmasına olan ihtiyaç duyulması yapay kromozom vektörlerinin geliştirilmesine neden olmuştur.

İlk olarak Saccharomyces cerevisiae’da geliştirilmiştir. Bu mayanın genomu temel alınarak inşa edilen rekombinant

kromozomlar (yeast artifical chromosomes,YAC’s). Önceleri genetik inceleme için Daha sonra çok büyük DNA parçalarının klonlanmasında kullanılmıştır:

Yapay kromozomlarda maya genomuna ait telomer,

sentromer, otonom olarak çoğalan diziler (ARS) izole edilmiş

ve plazmid üzerinde birleştirilmiştir.

• Bakteriyel yapay kromozomlar YAC’lardan daha küçük DNA

fragmanları (300-350 kb) taşıyabilen klonlama vektörlerdir. Buna

rağmen çok önemli bazı avantajlara sahiptirler.

• YAC’lar, kararsız bir yapıya sahip olduklarından çoğalma sırasında

taşıdıkları DNA fragmanlarını kaybedebilmektedirler.

• Bakteriyel yapay kromozomlar ise hem oldukça kararlı bir yapıya

sahiptirler hem de E. coli gibi çok hızlı ve kolaylıkla üreyen bir

bakterinin tranformasyon kolaylığına sahiptirler.