View
21
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
PEDİATRİK MAKROTROMBOSİTOPENİLİ
OLGULARDA
MYH9 & TUBB1 GEN MUTASYONLARI
1Didem Torun Özkan, 2Abdullah A. Waheed, 3Yeşim Oymak, 3Canan Vergin, 2Ayten Kandilci, 4Nejat Akar
1. Okan Üniversitesi, Sağlık Hizmetleri Meslek Yüksekokulu, İstanbul2. Gebze Teknik Üniversitesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, İstanbul3. Dr. Behçet Uz Eğitim ve Araştırma Hastanesi,Hematoloji ve Onkoloji Kliniği, İzmir4. TOBB-ETU Hastanesi, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı, Ankara
Bu çalışma TÜBİTAK- 3001-Başlangıç Ar-Ge Projelerini Destekleme Kapsamında (214S601) desteklenmektedir.
TROMBOSİTLER
Boyutu: 1-4 µm
Yaşam Süresi: 7-10 gün
Bulunduğu Yer: 1/3 Dalak
2/3 Dolaşım
Normal Trombosit Sayısı: 150000-450000/mm3
Düşük sayıda olmasıyla karakterize olan trombositopeni
Trombositopeni + dev trombosit sendromu ise makrotrombositopeni
Otozomal dominant kalıtım
MYH9 (Miyozin Ağır Zincir-9) Geni
May-Hegglin anomalisi (MHA)
Sebastian sendromu (SBS)
Fechtner sendromu (FTNS)
Epstein sendromu (EPTS)
Proteinin farklı doku ve organlarda sentezlenememesi sonucu;
non hematolojik bulgular: işitme kaybı, katarakt, nefrit
Makrotrombositopeni
MYH9 Geni
5.8kb’lık mRNA
40 ekzon
Kromozom 22q13.1’de lokalize
Baş Boyun Helikal Olmayan Kuyruk
Makrotrombositopeni Genetiği
Makrotrombositopeni
Tübülin Beta-1 (TUBB-1) Geni
Mikrotübüllerin fonksiyonunda oluşan defekt proplatelet formasyonunda
değişime sebep olarak makrotrombositopeni’ye yol açar mı?
TUBB-1 Geni
Kromozom 20q13.32’ de lokalize
451 aa
4 ekzon
Mikrotübüllerin en önemli bileşeni
GTP bağlanma bölgeleri
Özellikle ekspresyonu; trombositler ve megakaryositlerde
Otozomal dominant; Makrotrombositopeni
2000-2017 yılları arasında literatürde MYH9 geninde, 17 tanesimakrotrombositopeni taşıyan hastalarda olmak üzere, toplam 52 mutasyontanımlanmıştır.
Makrotrombositopeni ile ilişkili olarak TUBB1 geni ile ilgili ise yalnızca
2 mutasyon tanımlanmıştır. (Kunishima ve ark., 2015)
Amaç
Türkiye’nin farklı hematoloji kliniklerinden makrotrombositopeni tanısıalarak laboratuvarımıza ulaştırılan hastalarda makrotrombositopeniyleilişkili olduğu öngörülen genlerden MYH9 ve TUBB1 genindekideğişimlerin, DNA ve RNA boyutundaki genetik ve fonksiyoneldeğişimlerini tek bir çalışmada ve ilk kez Türk populasyonundagerçekleştirmektir
Materyal ve Yöntemler
Hasta Grubunun Oluşturulması
DNA Ekstraksiyonu
PolimerazZincir
Reaksiyonu
DNA Dizi Analizi
Verilerin
Değerlendirilmesi
Hasta Grubunun Oluşturulmasında Klinik Bulgular
TOBB- ETU Hastanesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Bölümü
Dr. Behçet Uz Eğitim ve Araştırma Hastanesi Hematoloji Kliniği
Kriterler:
Trombosit sayısı genelde 20000-130000mm3 arasındadır.
Hastaların kanama semptomları hafif ve ender olup, hematomlar ve kolay morarma
gözlenebilmektedir.
Lökositlerde inklüzyon cisimciği periferik yaymada saptanan tipik bir bulgudur.
DNA İzolasyonu Klasik Fenol- Kloroform Yöntemi
PCR MYH-9 7 ekzon
TUBB-1 Geni 4 ekzon
Hedef Bölge
DNA Dizi Analizi
TUBB-1 Geni
Ekzon Forward primer Reverse primer Amplikon
uzunluğu (bç)
Ekzon 1CATACCACGGTCACTAGGGC AAAGCCCAAAGGCATTGTC 587
Ekzon 2 GGAAACAGGCTTGGGAATG CATTTCCATCTCCTGGGC 282
Ekzon 3TTTGGACCAGTATCACAAAGTTC AAAAGAGAAACCAGCAGGGG 295
Ekzon 4-1GCATTCGATCTAGCAAATTAGG ATCGAACATCTGCTGGGTG 766
Ekzon 4-2TACCCTGAAGCTGACGACAC GCTGCAGGAGAAACACTCATC 789
Ekzon4-3AACGAATTTGGGGAAGCTG GAAAGCAGGATGCCAGTCAG 608
Ekzon 4-4GGATTTGCAGGGAGCCAC TTCCTGCATTTGAATGGTTG 623
Ekzon 4-5TTTCATTCAGTCATCACCCC TTGGTATGTATTTTAGTTATTTCCTCG 604
Ekzon 4-6GGGTTCTCATCTCTTGATTTGC CGAAAGAGTAGGATGGTGAGATG 620
4010 bç
Santa Cruz Genom Browser Database /Primer tasarım programı
BULGULAR
C. Ailesi- MYH9 /Ekzon 26B
AŞ
VU
RU
NE
DE
Nİ
YA
Ş&
CİN
SİY
ET
TR
OM
BO
SİT
10
3/u
L
MP
V(f
L)
PC
T(%
)
PD
W(f
L)
MY
H9
TU
BB
1
AMELİYAT ÖNCESİ
TROMBOSİT
DÜŞÜKLÜĞÜ
19E 39 11,1 0,04 14,1 c.3756 C>A,
c.3762 G>A
c.821 C>T, c.920G>A
Klinik Tablo
MYH9 Geni/ Ekzon 26
İki yeni mutasyon birlikteliği
c. 3756 C>A (p.L1176M) + 3762 G>A (p.E1182K)
İlk kez bu çalışmada gösterilmiştir
Çocukta görülen bu mutasyon
De Novo Mutasyon
olarak adlandırılabilir mi?
Marker Baba (A.C.) Anne (F. C.) (Hasta) /Çocuk (M.H.C.)
D851179 210/218 206/218 206/210
TMOI 333/338 338/346 333/346
D355818 251/255 246/246 246/251
D18551 461/465 461/472 461/472
D351358 193/197 193/197 193/193
D21511 183/191 191/191 183/191
FGA 293/297 297/305 297/305
%99,9 oranında baba, çocuğun babası
Düzen Laboratuvarı- DNA Fingerprint Analysis
C.AilesiTUBB1/ Ekzon 4
(821C>T (p. T274M)+ 920 G>A (p.R307H))
Forward primer Reverse primer
Species Match AA Alignment
Human 274 LHFFMPGFAPLTAQGSQQYRALSV
Mutated not conserved 274 LHFFMPGFAPLMAQGSQQYRALS
P.troglodytes all identical 274 LHFFMPGFAPLTAQGSQQYRALS
M.mulatta all identical 274 LHFFIPGFAPLTAQGSQQYRALS
M.musculus all identical 274 LHFFMPGFAPLTAQGSQQYRALS
G.gallus all identical 274 LHFFMPGFAPLTARGSQQYRALS
D.rerio all identical 274 LHFFMPGFAPLTARGSQQYRALT
D.melanogaster all identical 283 LHFFMPGFAPLTSRGSQQYRALT
C.elegans all conserved 274 LHFFMPGFAPLSAKGTQAYRALT
p.T274M Threonine (T) Hydrophilic/Polar – Neutral Methionine (M) Hydrophobic/Non-Polar
Natarajan K. and Senepati S., 2012, PLoSONE, 78(8); e42351.
p.R307H
Species Match AA Alignment
Human 307 ARNTMAACDLRRGRYLTVACIFRG
Mutated not conserved 307 AACDLRHGRYLTVACIFR
P.troglodytes all identical 307 AACDPRRGRYLTVACIFR
M.mulatta all identical 307 AACDPRRGRYLTVACIFR
M.musculus all identical 307 AACDPRRGRYLTVACIFR
G.gallus all identical 307 AACDPRRGRYLTVACIFR
D.rerio all identical 307 TACDPRRGRYLTVAGIFR
C.elegans not conserved 307 AACDPRHGRYLTVAAMFR
D.melanogaster not conserved 316 AKNMMAACDPRHGRYLTVAAIFR
p.T274M ve p. R307H mutasyonlarının TUBB1 proteinine etkisi
PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer)
MYH9 ve TUBB1 mutasyonlarının aynı hastada birlikte görülme durumu
şimdiye kadar yapılan çalışmaların hiçbirinde gösterilmemiş olup ilk kez bu
araştırma ile ortaya konulmuştur.
Aynı zamanda Human Gene Mutation Database’de (HGMD) daha önce
tanımlanmayan mutasyonlarla makrotrombositopenili bir ailede ilk kez
‘’de novo’’ mutasyon varlığı da gösterilmiştir.
MYH9 Geni Ekzon 1
c.286 T>G, p.S96A
BA
ŞV
UR
U
NE
DE
Nİ
YA
Ş&
CİN
SİY
ET
TR
OM
BO
SİT
10
3/u
L
MP
V(f
L)
PC
T(%
)
PD
W(f
L)
MY
H9
TU
BB
1
AMELİYAT ÖNCESİ TROMBOSİT
DÜŞÜKLÜĞÜ
20E 22 9,0 0,02 16,6 c.286 T>G c.803G>T
Ekzon 25c.3814 T>G, p. S1195A
İlk kez bu çalışmada gösterilmiştir
BA
ŞV
UR
U
NE
DE
Nİ
YA
Ş&
CİN
SİY
ET
TR
OM
BO
SİT
10
3/u
L
MP
V(f
L)
PC
T(%
)
PD
W(f
L)
MY
H9
TU
BB
1
BURUN KANAMASI 18E 94 11,6 1,08 16,6 c.3814 T>G,
p. S1195A
c.803G>T
Ekzon 26
c.3660 T>G, p.A1144L
Ensembl / rs71081 polimorfizmi
BA
ŞV
UR
U
NE
DE
Nİ
YA
Ş&
CİN
SİY
ET
TR
OM
BO
SİT
10
3/u
L
MP
V(f
L)
PC
T(%
)
PD
W(f
L)
MY
H9
TU
BB
1
AMELİYAT
ÖNCESİ TROMBOSİT
DÜŞÜKLÜĞÜ
11 E 89 8,4 0,074 17,1 c.3660 T>G,
p.A1144L
c.803G>T
TUBB1 GeniEkzon 4
TUBB1 geni 635C>T, p.H122H TUBB1 geni 636 G> C, p. E123Q
Hasta Hasta
İlk kez bu çalışmada gösterilmiştir
TUBB1 GeniEkzon 4
c.705G>A, p. G146R
Hasta
İlk kez bu çalışmada gösterilmiştir
Mutasyon mu, polimorfizm mi?
E123Q G146R
Sonuçlar..
TUBB1 geninde bulduğumuz bazı değişimler literatürde daha öncefarklı hastalıklarda bildirilmiş olmakla birlikte,makrotrombositopeniyle ilişkisi henüz bilinmemektedir.
Bu çalışma ile TUBB1- makrotrombositopeni ilişkisi net biçimdeortaya konulmuştur.
Human Gene Mutation Database’de (HGMD) yer almayanmutasyonlar ilk kez bu çalışmada bildirilmiş olmakla birlikte ,yine ilk kez bu çalışma ile makrotrombositopenili bireyde ‘’denovo’’ mutasyon varlığı da gösterilmiştir.
Sağlıklı ve hasta (C.U.) periferik kan örneklerinden
(trombosit) RNA izolasyonu yapıldıktan sonra cDNA sentezi
yapılmıştır. TUBB1 ve referans gen olarak seçilen HPRT’ye
ait Ct değerleri saptanarak replikaların aritmetik ortalamaları
alınmıştır.
TUBB1’de meydana gelen mutasyon mikrotübül organizasyonunda
defektlere yol açmaktadır.
TEŞEKKÜRLER…
Recommended