View
245
Download
3
Category
Preview:
DESCRIPTION
Molekularna genetika - Restrikcijske endonukleaze - oruzje molekularne biologije
Citation preview
Restrikcijske endonukleaze
Oruđe u molekularnoj biologiji
Nomenklatura
tri slova iz imena bakterije, oznaka soja, rimski broj
EcoRI- Escherichia coli, soj R, rimski broj
- HinDIII- Haemophilus influenzae, soj D, treći izolat
Što prepoznaje i kako cijepa EcoRI?
Sažetak
Pojavu restrikcije i modifikacije otkrio je Werner Arber, švicarski znanstvenik.
Za to je otkriće podijelio Nobelovu nagradu 1978. sa Amekikancima D. Nathansom i H. Smithom.
OTKRIĆE RESTRIKCIJSKIH ENDONUKLEAZA
Zaključak
Prvo - soj K i soj B imaju neki mehanizam za “restrikciju” infektivne sposobnosti bakteriofaga izoliranog iz onog drugog soja (suprotnog soja). Naime, infektivnost bakteriofaga se smanjuje kada se inicijalno prebaci s jednog soja na drugi.
Drugo – do “restrikcije” infektivnosti bakteriofaga dolazi replikacijom DNA bakteriofaga unutar bakterijske stanice. Evidentiran je povratak infektivnosti bakteriofaga nakon nekoliko inkubacija sa novim sojem bakterijskog domaćina.
RESTRIKCIJSKI ENZIMI
najvažniji enzimi koji se koriste u genetičkom inženjerstvu
restrikcija DNA → degradacija, "inaktivacija" DNA
modifikacija DNA → zaštita od restrikcije
Modifikacijsko-restrikcijski sustav:
modifikacija se sastoji u metilaciji adenina (N6-metiladenin) i/ili citozina (5-metilcitozin ili N4-metilcitozin), u sekvenciji kojuprepoznaje restrikcijski enzim.
do metilacije dolazi nakon replikacije, a za modifikacijsku metilazu najbolji supstrat je hemimetilirana DNA.
NH
CH
N
O
NH2
CH3
NH
CH
N
N
CH
N
NCH3H
NH
CH
N
O
CH
NCH3
H
N6-metiladenin
(6-metilaminopurin)
N4-metilcitozin
123
45
6
321
65
4
78
9
12
3 4 5
6
5-metilcitozin
Restrikcijske endonukleaze, tri skupine, različiti mehanizmi reakcije i važnost:
I. Režu nespecifično 100-1000 bp od mjesta prepoznavanja (SAM, ATP, Mg2+).Tri gena, hsdM + hsdS i hsdR, jedan kompleks (enzim) (S prepoznaje sekvenciju, M metilira, R cijepa?)
II. Režu unutar sekvencije (Mg2+ !). Dva gena, odvojene aktivnosti.
IIS. Režu na određenom mjestu pokraj sekvencije prepoznavanja.
III. Režu na udaljenosti od 25-27 bp, asimetrična sekvencija (Mg2+, ATP). Dva gena, jedan kompleks.
(IV. Mcr/Mrr - režu modificiranu DNA, zaštita od modificiranih faga!)
II. Skupina restrikcijskih endonukleaza.
- prepoznaju specifičnu, "palindromsku" sekvenciju - tetra, penta, heksa, hepta ili oktanukleotid (učestalost - 1/4n).- isti redoslijed nukleotida u oba lanca (ali u istom smjeru 5'→ 3' !)
RESTRIKCIJSKI ENZIMI – OSNOVNE KARAKTERISTIKE
1. Utjecaj metilacije DNA – često inhibira aktivnost enzima
GATC GA*TCMboI, NdeI + -Sau3A + + DpnI - +
2. Nomenklatura (e.g. EcoRV ili EcoR V).
3. Palindrom! 4. Krajevi – a) 3' hidroksil, b) 5' fosforil, c) ravni
5. Izoshizomeri (e.g. SmaI, XmaI); “striktni izoshizomeri” – nastaju isti krajevi. 6. Kompatibilni krajevi (e.g. SmaI, XhoI).
Restrikcijski enzimi - primjer
Recommended