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Schema zur Analytik von synth. PeptidenSynthese (manuel, automatisch, parallel)

Abspaltung (Fällung aus unpolarem Lösungsmittel)

Gefriertrocknung

HPLCMSMS/MSSequenzierung

Kopplung mitUV, MS

Aminosäurenanalyseggf. an chiraler Säule

Reinheit

Identität

SalzgehaltEntantiomerenreinheit

1

Chromatographie

Peptidsynthese in Lösung

2

Säulehydrophob: SiR3-O-C12H25

Pumpen

Laufmittel: Wasser, pH 2; Acetonitril

Probenaufgabesystem

Detektor

Octadecyl‐Phase C18 

3

Wellenlänge [nm]

Peptid (enthält Tyrosin)

Peptid (mit Fmoc-Schutzgruppe)

Peptid (mit Mtr-Schutzgruppe)

UV-Spektren von Peptiden mit und ohne Schutzgruppen

220 240 260 280 300 4

HPLC eines Roh-Peptides

Cy3-NPYCy3-NPY

220 nm 552 nm

5

Dünnschicht-chromatographie(2-dimensional)

Detektion mit Ninhydrin-Sprühreagenz

Ionenaustausch-chromatographie

Derivatisierung mit Ninhydrin

Absorption l=570nm

A

t [h]

Derivatisierung

RP-HPLC/chiralerSäuleDetektion im UV,Fluoreszenz

A

t [min]

Aminosäurenanalyse

Peptid Totalhydrolyse (6N HCl, 24 h, 110 °C)Totalhydrolyse (6N HCl, 24 h, 110 °C)

Ninhydrin reagiert mit α‐Aminosäuren

Ruhemanns Violett 6

PITC=PhenylisothiocyanatPTC=PhenylthiocarbamoylATZ=AnilinothiazolinonPTH=Phenylthiohydantoin

Sequenzierung nach Edman

1. Schritt: Kupplung2. Schritt: Spaltung3. Schritt: Umwandlung

N-terminaler Sequenzierungszyklus

7

Phenylisothiocyanat

(Phenylthiocarbamoylpeptid)

1. Schritt: Kupplung

Sequenzierung nach Edman

8

ATZ-Aminosäure(Anilinothiazolinon)

um eine Aminosäureverkürztes Peptid

2. Schritt: Spaltung

Wird mit einem hydrophoben Lösungsmittel extrahiert

Sequenzierung nach Edman

(Phenylthiocarbamoylpeptid)

9

Phenylthiohydantoin-Aminosäure

3. Schritt: Umwandlung (Hydrolyse+ Umlagerung)

Phenylthiocarbamoyl-Aminosäure

Sequenzierung nach Edman

10

W

min

Analyse mittels HPLC

11

12

Massenspektrometrie

Essentielle Eigenschaften von allen MS Verfahren:• Erzeugung von Ionen in der Gas- oder Plasmaphase• Beschleunigung der Ionen in einem elektrischen Feld• Trennung der Ionen entsprechend der m/z Verhältnis

in einen Massenanalysator• Detektion der Ionen

13

Massenspektrometer

“soft"

14

MALD-Ionisierung

• Probe in lichtabsorbierender Matrix• Laserbestrahlung• thermische, photochemische Anregung  Ionisierung

Matrixassistierte LaserdesorptionIonisations(MALDI)-Massenspektrometrie

Koichi Tanaka

Nobel Price in Chemistry 20021/4 share

15

Matrix

2,5-dihydroxybenzoesäure(DHBA)MW 154.12

-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) MW 189.17

Sinapinsäure (SA)3,5-Dimethoxy-4-hydroxzimtsäureMW 224.21

266 nm337 nm355 nm

337 nm355 nm

266 nm337 nm355 nm

Peptide,Proteine

Peptide

Proteine

16

Massenanalysator

Matrixkristallmit Analyten

LaserN2 337 nm 3-5 nsNd:YAG 355 nm 5-15 nsEr:YAG 2.94 μm 90 ns

MALD-Ionisierung

pulsed

17

MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Laser

Probein

Matrix

TOF = T1-T0

Linsensystem

T0

Ionen

Laser

Probein

TOF = T -T0

Detektor

Linsensystem

T0

T1

Ionen

(TOF = Time Of Flight)

18

Vacuum

MALDI/TOF-Massenspektrometrie

19

MALDI-TOF-Massenspektrometrie

++

Probe + Matrix Ionen mit gleicher Masseverschiedener Geschwindigkeit

Problem: Peaks sind inhärent breit in MALDI-TOF Spektra (niedrige Massenauflösung)

Ungleiche Energieverteilung bei der Ionisierung +

20

MALDI-TOF-MassenspektrometrieMethoden zur Kompensation der initialen Geschwindigkeits‐verteilung der Ionen:• Verzögerte Ionenextration (delayed extraction)

Das elektrische Feld wird zeitversetzt zum Laser Desorptionsimpuls eingeschaltet.

• Ionenspiegeln (Reflektoren)Elektrisches Gegenfeld angeschlossen an die Driftstrecke

SchärferePeaks

21

Kein elektrisches Feld, Ionen streuen.

++ +

Ionen mit gleicher Masse, unterschiedlicher Geschwindigkeit

Feld angelegt, langsame Ionen beschleunigen mehr als die Schnelleren

0 V.

0 V.

++ +

Langsame Ionen erreichen die Schnellen

20 kV.

20 kV.

0 V.

0 V.+++

MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Delayed extraction

1.

2.

3.

22

MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Reflektor

23

TOF: Time-of-flight

• Trennung der Ionen aufgrund unterschiedlicher Flugzeit bei vorgegebenem Wegt = f (   2m/z     )

• Reflektor und Delayed Extraction (DE): erhöhen Genauigkeit und Empfindlichkeit

24

MALDI-TOF von Angiotensin: M+H+theor. 1046.54

25

MALDI-TOF von recombinant SERPINA12 / Vaspin

26

Elektrospray-Ionisierung

Spray Elektrospray

27

Elektrospray-Ionisierung

28

Elektrospray-Ionisierung

Verdampfungdes Lösungsmittels

29

Elektrospray-Ionisierung

• protonenhaltige Lösung der Probe• Zerstäubung im Hochspannungsfeld• Lösungsmittel verdunstet• Zerfall der Molekülcluster in vielfachgeladene Ionen:[M+nH]n+ oder [M‐nH]n‐

John B. Fenn

Nobel Price in Chemistry 20021/4 share

30

Interface zwischen ESI-Quelle und Quadrupole

Atmosphärendruck Hochvakuum

Vorvakuum

31

Quadrupol-Filter

-

-

+

+

-

-+

+

32

Quadrupol-Filter

33

Quadrupol-Detektion

• Massentrennung durch Schwingung der Ionen in einem hochfrequenten elektrischen Feld(Kombination von Radiofrequenzspannung V und Gleichspannung U)

• V/U konstant  nur ein m/z‐Ion stabil• Veränderung der Amplitude  Spektrum 

34

ESI-MS von Neurotensin 1673,5

35

36

MALDI gegen ESI

MALDI ESIAnalyte in matrix Analyte in solutionSample bombardment with laser to desolvate ions

Dissolved charged sample desolvated, “cold ions”

Ionization takes place through the matrix

Ions are brought to the gas phase

Ionization in vacuum Spray in atmospheric pressureGenerates ion pulses Generates a continuous current

Historically coupled to:TOF analyzer Quadrupole analyzer

37

ESI-MS-MS: Tandem-Massenspektrometrie

Sequenzierung mittels Massenspektrometrie

38

Fragmentierung der Peptidbindung

39

40

Sequenzierung von Peptiden mit MS

41

200 400 600 800 1000 1200 14000

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Abs. Int. * 1000a H M K*b H M K*y R P S F S P K* M H

110.050a 1

138.060b 1

175.075y 1

H241.060

a 2

269.054b 2

272.117y 2

595.190a 3

623.188b 3

359.112y 3

K*

506.189y 4

P

593.178y 5

926.408a 6

690.248y 6

F

1044.330y 7

1175.506y 8

1312.655y 9

R

KPy7b4

PSy6b5

SFy5b6

KPSy7b5

PSF y6b6

PSFSPy6b8

42

m /z750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 3250 3500 3750

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Abs. Int . * 1000

1115.60243-50

1129.658295-301

1217.607356-363

1219.688280-285

1306.66951-61

1312.657216-224

1335.719346-355

1687.99859-70

1690.87129-40

1938.011349-363 1975.054

29-42

1989.058331-345

2002.25047-61

2159.12929-42

2350.269216-232

2392.279216-232

2533.375321-340

2979.637322-345

3149.689150-175

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Schema zur Analytik von PeptidenSynthese (manuel, automatisch, parallel)

Abspaltung (Fällung aus Lösungsmittel)

Gefriertrocknung

HPLCMSMS/MSSequenzierung

Kopplung mitUV, MS

Aminosäurenanalyseggf. an chiraler Säule

Reinheit

Identität

SalzgehaltEntantiomerenreinheit

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