Биоиндикатори- предавање 2 5 . Микроорганизми као биоиндикатори

1

Биоиндикатори- предавање 2

5. Микроорганизми као биоиндикатори

5.1. Улога микроорганизама у природи

- микроoрганизми: једно- или вишећелијски организми, видљиви само кроз микроскоп, величине 0,2 до 200 μm (< 0,2 mm)

- категорија укључује гљиве, бактерије, протозое и алге

- најраширенија категорија живих бића на Земљи

- у земљишту, води, ваздуху, преко 1000 метара дубоко у литосфери, аеробним и анаеробним срединама, арктичком леду и на високим температурама

- адаптирали се на живот у готово свим условима

- добијају Е из светлости или оксидацијом хемијских супстанци

- донори електрона могу бити органске или неорганске супстанце

- извор угљеника могу бити СО2 или комплексна органска једињења

- микроскопске алге и фитопланктони- главни произвођачи биомасе у воденим системима

2


- у морима и океанима бактерије углавном разлажу супстанце које награде фитопланктони, као и њихове ћелијске остатке

- бактеријска секундарна продукција чини само 20% примарне продукције фитопланктона

- иако хетеротрофне бактерије могу да имају висок степен раста, измене у укупном броју врста бактерија су релативно мале

- захваљујући протозоама, број брзомножећих маринских бактерија (величине 0,2-2 μm) у једном истраживању је остајао < 1х106/ml

- у водама, главни организми који конзумирају бактерије су хетеротрофни флагелати (величине 2-20 μm)

3


- њих конзумирају веће протозое, попут цилијата

- они су исте величине као фитоплантони (20-200 μm)

- преко бактерија и протозоа се енергија коју су кроз стварање органске супстанце створили фитопланктони враћа у ланац исхране

- више биљке су главни произвођач биомасе у терестријалним екосистемима

- преко остатака биљака, али и коренског система, настала енергија и угљеникова једињења долазе у земљиште

- гљиве и бактерије су главни разграђивачи мртве органске супстанце

4


- ту се, пре свега, мисли на остатке биљака, супстанце лучене из корења, мртве микророганизме, остатке животиња у земљишту

- ове врсте микроорганизама су извор хране за протозое и нематоде, играју главну улогу у ланцу исхране и кружном току хранљивих супстанци

- минерализацију, тј. разградњу биополимера у СО2, Н2О, минерални N

и P и друге минералне елементе, изводе углавном микроорганизми

- минералне хранљиве супстанце које настају разлагањем су у земљишту доступне биљкама и микробима

- настаје нова биомаса, а хранљиве супстанце круже

- пољопривредно земљиште (0-25 cm) дубине садржи око 3000 kg биомасе по хектару

- микроби су доминантни у хемијским и физичкохемијским процесима у таквом земљишту

- одговорни за преко 80% укупне активности и процеса

5


- у обрадивом земљишту микроорганизми годишње разложе око 5000 kg угљеника по хектару

- такође произведу око 100 kg минералног азота

- заправо задовоље 50% потребе за азотом пољопривредних култура

- микроби и такође утичу на формирање и очување структуре земљишта

6


5.2. Зашто користимо микроорганизме као индикаторе?

- микроорганизми су корисни индикатори у биомониторингу

- присутни су у великим количинама у свим сферама животне средине

- учествују у ланцима исхране и кружном току елемената (N, P, C, S)

- незамењиви су живот виших организама

- мала величина и висок однос површине и запремине узрокује велики афинитет за ниске концентрације супстрата

- дакле, врло су осетљиви и реагују веома брзо на стрес и загађење

- микробиолошка активност зависи од збира свих физичких, хемијских и биолошких фактора који утичу на процесе разградње и трансформације хранљивих супстанци

- микробиолошки индикатори стога могу да послуже као средства за рано откривање проблема са којима се животна средина суочава

- микроорганизми укупно представљају велику количину биомасе

- такође су и веома разноврсни

7


- често су генетске разлике између неких биљака и животиња мање него разлике између појединих микроорганизама

- пошто су широко распрострањени и мале величине, не постоји проблем са узорковањем довољно великог броја микроорганизама

- практично је могуће доћи до било ког броја микроорганизама у узорку или било које величине узорка

- анализа опасности по животну средину услед загађења хемијским супстанцама се обично заснива на анализи самих ксенобиотика

- укупне концентрације служе да се утврди загађење и опасност

- међутим, при истој концентрацији, биодоступност једињења може да се разликује од случаја до случаја

- у земљишту и седиментима, у случају тешких метала, на пример, биодоступност је обрнуто пропорционална рН, садржају глине и органске супстанце

- иако се, дакле, знају неки фактори који утичу, процена биодоступности на основу искључиво хемијских анализа још увек крајње несигурна

8


- често се раде различите екстраполације

- екотоксиколошке лабораторије обично раде испитивања утицаја чистих супстанци на појединачне врсте

- то, међутим, не имитира ситуацију у животној средини

- када се тако добијени резултати примене на реалне ситуације, обично се у мањој или већој мери греши

- не узимају се у обзир интеракције између различитих живих бића и заједница, као ни ланци исхране који постоје

- такође, тестови токсичности обично обухватају леталне или сублеталне исходе базиране на релативно кратком утицају ксенобиотика

- њихов утицај често знатно дужи, дани, месеци, године, деценије...

- резултати, дакле, слабо релевантни у односу на реалан живот

- у лабораторијама акутна, у стварном животу и хронична токсичност

- често су ефекти, у случају дугорочног загађења, слабији

9


- ксенобиотик се делимично или потпуно дезактивира везивањем за органску или неорганску фракцију земљишта

- такође, и микроорганизми се прилагоде, развију одређени степен толеранције

- у реалном систему је ретко један загађивач присутан сам

- обично постоји више ксенобиотика

- лабораторијски модели за мерење адитивне токсичности, истовремене токсичности више супстанци, слабо развијени

- коначно, формално загађење често није једини стрес који екосистем осећа

- ту су и еутрофикација, ацидификација, исушивање, хладноћа...

- још један разлог за непоузданост лабораторијских испитивања

- еколошки ефекти стреса укључују и смањење биодиверзитета и сметње у процесима као што су разлагање и кружни ток супстанци

- тешко in situ мерити разлагање и минерализацију

10


- потребно дуго време инкубације, често године, пре него што, на пример, нагомилавање органске супстанце постане очигледно

- потребни су, дакле, осетљиви биолошки индикатори

- ипак, уз предности, постоје и проблеми

- за разлику од биљака и животиња, код микроба још до краја нису разјашњене све разлике између појединих врста

- много различитих врста, 104-105 по граму земљишта

- немогуће укључити све микроорганизме у процени утицаја ксенобиотика

- углавном се укључују доминанте популације

11


5.3. Микробиолошке методе које се користе у биомониторингу

- три најчешће информације које се добијају: количина биомасе, активност и диверсификација микробиолошке заједнице

- за све три информације користимо различите технике

- анализе могу бити рађене са микробима из свих средина

- већина касније споменутих метода (микроскопија, уградња 3Н-тимидина, DGGE) потичу из истраживања водених система

- примењују се у испитивањима земљишта од 1990-тих

- микроорганизми се дуго користе као индикатори квалитета вода

- укупан број колиформних бактерија и број фекалних колиформних бактерија се користе за утврђивање загађења пијаћих или вода за купање патогеним бактеријама из пробавног тракта

- степен еутрофикације вода се деценијама одређује мерењем броја и заступљености неких врста алги и цијанобактерија

12


- мерила се и њихова активност у фотосинтези (производња О2) и у дисању (БПК)

- коришћење микроорганизама у земљишту као индикатора почело касније

- од 80-тих година прошлог века отпочела брига због утицаја пољопривреде на квалитет земљишта

- преко микробиолошких индикатора могуће дати брзу оцену стања

- бактерије се, генерално, користе чешће него гљиве и протозое

- гљиве и протозое су важне у екосистемима, али се тешко “мере”

- још увек се развијају технике за одређивање ДНК гљива

- нису рутинизиране ни технике за одређивање биодиверзитета гљива

13


5.4. Одређивање количине биомасе микроорганизама

- класичан начин за одређивање количине живих микроорганизама је да се посеју на хранљиву културу у стакленом суду

- Петри 1887. први описао

- бактерије формирају колоније, број зависи и од коришћене културе

- око 1% бактерија из животне средине може да се одреди на овај начин

- коришћењем микроскопа, као и аутоматизованом анализом снимака, могуће је добити информације о укупном броју, биомаси и морфолошким карактеристикама микробиолошке заједнице

- често се обележавају флуоресцентним бојама

- други могући метод за одређивање укупне биомасе у земљишту је заснован на повећању екстрактабилног С и N након засићења узорка земљишта парама хлорофома

- хлороформ разара ћелијске мембране, тако да садржај ћелија прелази у раствор

14


- на основу разлике у односу на контролни, необрађен, узорак, се добија количина биомасе, тј. органског С и N

- како се око 50% биомасе екстрахује на овај начин из земљишта, неопходно је користити корекционе факторе

- елегантнија и савременија метода, уместо хлороформа се користе микроталаси.

15


5.5. Одређивање активности микроорганизама

- микробиолошка активност може бити релативно лако одређена мерењем дисања земљишта под стандардизованим условима у лабораторији

- у већини земљишта где је доступност лако разградивих супстанци ограничена, ово захтева 2-6 недеља инкубационог периода

- још једна коришћена техника је дисање индуковано супстратом

- Substrate Induced Respiration (SIR)

16


- мери се повећано дисање (ослобађање СО2) након додавања лако деградабилног супстрата (глукозе), у првим сатима након додавања

- дисање ће бити мера одговора, самим тим и мера укупне биомасе

- брзина раста бактерија може бити мерена брзином уграђивања 3Н-тимидина у ДНК и 14С-леуцина у протеине

- ово се ради током релативно кратке инкубације (1 сат)

- праћење оба параметра у једном експерименту омогућује истовремено праћење синтезе и ДНК и протеина

17


- садржај ДНК код бактерија је константнији од садржаја протеина

- због тога је инкорпорација тимидина боље мерило за брзину раста

- ћелије синтетишу више протеина него ДНК

- због тога је инкорпорација леуцина за ред величине већа од инкорпорације тимидина, лакше се мери и поузданија је при малим брзинама раста

18


- само бактерије инкорпорирају тимидин, али све бактерије не инкорпорирају 3Н-тимидин

- све бактерије инкорпорирају леуцин, али леуцин могу да инкорпорирају и други организми

- како су обе методе појединачно непоуздане, користе се симултано

19


- потенцијална брзина минерализације азота и угљеника може да се одреди симултано, инкубацијом у току шест недеља, при 20 °С, и при влази од 50% у односу на максимално могућну

- брзина минерализације се рачуна на основу повећања количине минералног азота након шесте и након прве недеље од почетка експеримента

- важно: резултат у првој недељи се не узима у обзир

- брзина минерализације угљеника се рачуна на основу количине издвојеног СО2 између прве и шесте недеље

- у неким маринским земљиштима, која садрже велике количине СаСО3,

мерење издвојеног СО2 није поуздано

- рачуна се потрошња О2, рачунајући да један мол О2 потрошеног

одговара једном молу развијеног СО2

- наравно, О2 потрошен за нитрификацију се одузима

20


5.6. Хемијске технике за одређивање микробиолошког диверзитета

- метод отиска липидног маркера (signature lipid biomarker, SLB) је најшире коришћен стриктно хемијски метод за проучавање заједница микроорганизама

- липиди у микроорганизама се налазе у ћелијским зидовима, али и у залихама које микроорганизми стварају у време интензивне исхране

- SLB може да, у својој најсавршенијој форми, пружи врло различите податке о заједницама микроорганизама

- липиди могу да буду екстраховани, фракционисани и анализирани GC-јем

- како анализа свих фракција липида захтева време, обично се само неке анализирају

- једна од таквих фракција, фосфолипиди, се не налазе у залихама које микроорганизми стварају, ни у мртвих ћелијама

- налазе се искључиво у ћелијских зидовима живих ћелија

21


- већина студија користила масне киселине фосфолипида како би се испитивала микробиолошка структура

- иако појединачне киселине нису често карактеристичне за организам или групу организама, могу бити коришћене као биохемијски маркери

- доминирају у појединим таксономским групама и константних су концентрација

22


- мерење концентрација фосфолипидних масних киселина екстрахованих из земљишта може да пружи податке о заједницама микроорганизама

- показаће структуру, као и који су микроорганизми доминантни

- неће дати квантитативну информацију о броју врста/организама

- мерење укупне биомасе преко укупне количине фосфолипидних масних киселина или подгрупе одређених дало добре резултате

- добра корелација са другим методама за утврђивање укупне биомасе

- састав фосфолипидних масних киселина зависи и од типа земљишта, присутне вегетације, климе и начина управљања земљиштем

- укупно узевши, ипак добра и осетљива метода

- често указује на стрес док друге га методе још не показују

- добра метода за мониторинг због једноставности, брзине и могућности за стандардизацију и аутоматизацију

- потребно још радити на развоју интерпретације резултата

23


5.7. Генетске технике за одређивање микробиолошког диверзитета

- различите методе су развијене како би се одредила генетска различитост

- ДНК је екстрахован из узорака земљишта, седимената и вода

- Добијени ДНК је мултипликован PCR-ом и раздвајан коришењем DGGE (denaturating gradient gel electrophoesis)

- ДНК фрагменти једнаке дужине се ставе на гел на коме постоји градијент денатуризационог агенса

- током електрофорезе ДНК фрагменти се крећу кроз растући градијент денатуризационог агенса

- у зависности од састава ДНК, фрагменти стварају траку на месту одређене концентрације денатуризационог агенса

- број ДНК трака зависи од броја генотипова специфичних бактерија

- интензитет траке зависи од количине ДНК, тј. количине врсте

- друге технике се такође користе

24


25


- temperature gradient gel electrophoresis (TGGE)

- температурни градијент у полиакриламидном гелу денатурише

- након тога исти приступ као пре, анализирају се траке и њихов интензитет, уз фотографисање и анализу фотографија

- аmplified ribosomal DNA restriction analуsis (АRDRA)

- након PCR-а се користи дигестија рестрикционим ензимом, па електрофореза на агарозном гелу

- АRDRA показује квалитативне разлике између заједница, али није у стању да пружи податке о броју јединки

26


27


5.8. Физиолошке технике за одређивање микробиолошког диверзитета

- физиолошки приступ анализи микробиолошке популације је заснован на способности заједница да метаболишу различита С-једињења

- различита органска једињења, од 31 до чак 95, истовремено појединачно служила као извор угљеника

- мерила се брзина прераде једињења

- промене у брзини или природи прераде угљеникових једињења означавају промене у метаболизму, а ове могу бити последица стреса

- резултат зависи од густине колонија, тј. од броја бактерија које прерађују једињења

- препоручљиво да се, када се раде поређења, користи исти број колонија као у студијама са чијим се резултатима врше поређења

28


5.9. Референтне вредности

- особине микроорганизама не зависе само од антропогеног стреса, већ и од карактеристика земљишта

- зависе од рН, садржаја органске супстанце, глине и алумосиликата, количине органске супстанце која може послужити као храна

- због тога је неопходно имати слепу пробу, тј. узорак који је изложен свим утицајима који утичу на заједницу, осим антропогеног стреса

- уколико то није могуће, покушава се да се земљишни систем опише, ради репродуцибилности и тумачења резултата, кроз неке друге величине

- специфично дисање, тј. количина развијеног СО2 по јединици биомасе

или однос Сбиомаса/Соргански

- овакви стандарди описују земљишни систем, али не могу да реше проблем недостатка слепе пробе

29


5.9. Одређивање повезаности између загађења и теренских резултата

- до сада описане технике дају могућеност да се одреди квалитативни аспекти екосистема

- проблем је, међутим, да се сазна узрок тог квалитета

- да ли је квалитет или његова промена узрокован стресом?

- који је стрес, и да ли је антропогени стрес у питању?

- могуће сазнати статистичком анализом, ако постоји довољна количина података

- једна од могућих последица је да се заједница која је изложена прилагоди тако што ће повећати своју толерантност

- то је могуће на више начина, физиолошком или генетском адаптацијом, губитком најосетљивијег дела заједнице, реколонизацијом локације толерантним јединкама

- pollution induced community tollerance (PICT)

30


- корисно за испитивање ефекта загађивача на терену

- праћењем промена толерантности се долази до података о реалном утицају који је изазвао повећање толеранције

- PICT боље дефинише каузалност него други класичне анализе

31


5.10. Неки аспекти практичне примене

- који је ефекат загађивача?

- који је укупан ефекат загађивача, начина коришћења земљишта и других узрока стреса на заједницу микроорганизама?

- коришћење различитих техника доказало да тешки метали утичу на заједнице микроорганизама

- повећање концентрације утиче на дисање у шумским земљиштима, али нема једнозначних резултата за пољопривредна земљишта

- генерално, дисање није довољно добар биоиндикатор, јер нема мерљивих промена при концентрацијама испод ЕУ лимита

- уграђивање 3Н-тимидина дефинитиво осетљивије према загађивању него промена биомасе или брзина дисања код земљишта и вода

- што се тиче гљива, различити истраживачи дају конфузне закључке

- неки тврде да су мање, други да су више осетљиви од бактерија

32


- када је CuSO4 додаван земљишту при рН 5,0, већ при 10 mg Cu/kg

примећен је пад брзине уграђивања 3Н-тимидина

- бактеријска биомаса и брзина дисања су се смањивали при знатно већим концентрацијама (100-1000 mg Cu/kg)

- брзина раста у овом случају бољи индикатор од биомасе или дисања

- експеримент са три различите локације и песковитим земљиштима

- једно загађено Cu (максимум 160 mg Cu/kg), друго са Ni и Cr (2.800 и 430 mg/kg), треће са Zn (10.000 mg/kg)

- на земљишту загађеном Cu, брзине како уградње 3Н-тимидина, као и 14С-леуцина су значајно пале у односу на земљиште са природном концентрацијом већ од 25 mg/kg

- уградња 3Н-тимидина опада при концентрацијама које су ниже од тренутне максимално дозвољeне концентрације у ЕУ (140 mg/kg)

- већина других параметара, биомаса бактерија и гљива, протозоа и нематода, брзина дисања и N-минерализација такође опадају са растом концентрације Cu

33


- разлике међутим нису статистички значајне, поново је пад брзине раста бактерија најосетљивији биоиндикатор

- код земљишта загађеног Ni и Cr, брзина раста бактерија, али и бактеријска биомаса опадају са повећањем концентрације метала

- као и у случају бакра, брзине 3Н-тимидина, као и 14С-леуцина су значајно пале, при чему је брзина 3Н-тимидина више опала

- генерално, повећане концентрације метала инхибирају синтезу ДНК више него синтезу протеина

- код земљишта контаминираног Zn, сви параметри, поготово везани за број и масу микроорганизама, али и брзина минерализације C су били знатно нижи него код земљишта које је ремедирано

Documents

Биоиндикатори- предавање 2 5 . Микроорганизми као биоиндикатори