Upload
francesca-gould
View
135
Download
7
Embed Size (px)
DESCRIPTION
实 验 项目 流感病毒的分离与鉴定. 医学检验实验教学中心. 实验目的. 1. 掌握流感病毒的分离方法和鉴定方法 2. 通过临床病例诊断,引导学生实验技术,总结归纳做病原学诊断 采集哪些标本的方法以及进行病原学检测的方法,做出临床诊断。. 标本采集与送检. 病毒的分离鉴定. 电镜技术. 血清学试验. 分子生物学技术. 病毒感染的检查方法. 一、标本采集与送检. (一)供分离病毒、检出核酸及抗原的标本. 原则: 1. 尽早采取:发病初期 2. 部位适宜:由感染部位采取 3. 冷藏速送:装有冰块或干冰的容器内. (二)检测特异性抗体 的标本 - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
实 验 项目流感病毒的分离
与鉴定
医学检验实验教学中心
实验目的
1. 掌握流感病毒的分离方法和鉴定方法
2. 通过临床病例诊断,引导学生实验技术,总结归纳做病原学诊断 采集哪些标本的方法以及进行病原学检测的方法,做出临床诊断。
病毒感染的检查方法
电镜技术
血清学试验
分子生物学技术
病毒的分离鉴定标本采集与送检
一、标本采集与送检
原则: 1. 尽早采取:发病初期
2. 部位适宜:由感染部位采取
3. 冷藏速送:装有冰块或干冰的容器内
(一)供分离病毒、检出核酸及抗原的标本
(二)检测特异性抗体 的标本 采集双份血清, 4-20℃保存
病毒材料采集与检验结果的关系
采取标本的时期 检查病毒及其成分 测定抗体
潜伏期及前驱期
刚发病或急性期
恢复期及康复期
较难查见
最多查见
很难查见
未增多
未增多或增多不明显
明显增多
(常超过 4倍)
病毒分离是诊断病毒感染的金标准,一旦阳性,即可确诊。
不适用于快速诊断,操作复杂,实验成本高,阳性检出率低等
有时不得不分离病毒,例如发现了一种新的病毒病,必须分离病毒进行研究,或者分离株的鉴定对流行病学有很大作用(如流感病毒),或者需要培育疫苗,或者希望获得天然弱毒株等。
二、常规分离与鉴定
(一)病毒分离
标本采集
杀灭杂菌(青链霉素)
接种
鉴定病毒种型
易感动物 出现病状
鸡胚 病变或死亡
细胞培养 细胞病变
三大方法
流感病毒的分离与鉴定 标本采集 早期 鼻咽拭子 病人血清
鸡胚的结构与生理 鸡胚是由三个胚层发育起来
的,即外胚层,中胚层和内胚层,它们构成胚胎的组织与器官。
(约 10 日龄鸡胚的结构见图)
鸡胚接种 (一) 9~11 日龄鸡胚
(二)孵卵箱
(三)检卵灯、开卵钻和卵盘
(四)其它
(一)活胚检查
1. 血管:活胚可见清晰的血管,有时可见血管搏动,死胚血管模糊成淤血带或淤血块。
2. 胎动:活胚可见明显的自然运动,尤其在转动胚胎时,死胚见不到任何胎动,胚胎发红像出血样,有的呈现黑块。
3. 血管网是否丰满:发育好的鸡胚可见密布丰满的血管网,也就是绒毛尿囊膜,死胚则见不到这一现象。
(二)接种途径
1. 尿囊腔接种:该途径一般用于流感、新城鸡瘟病毒和腮腺炎的适应和传代。
2. 羊膜腔接种:这途径主要用于临床材料(如患者的鼻洗液及咽漱液)分离病毒。
3. 卵黄囊接种:该接种途径主要用于抗流感病毒药物实验。
4. 绒毛尿囊膜—壳块培养法:该法可用于流感病毒滴定、中和试验和药物实验。
注意事项
鸡胚为一活的有机体,因此要严格无菌操作,同时动作要仔细,以免造成物理死亡。接种后 24 小时内死亡应不计结果。
接种时应注意的问题?
收获鸡胚尿囊液 (见讲义) 血球凝凝试验
血球凝集抑制试验
细胞培养方法分离流感病毒鉴定
利用狗肾细胞培养观察CPE。常见的细胞形态学变化为细胞变圆、坏死、溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能形成包涵体。
正常细胞 病变细胞
免疫荧光技术检测
照片有本实验室提供
RT-PCR 检测流感病毒
RT-PCR 对流感病毒 H3N2-IFV HA基因的检测
电子显微镜检查流感病毒
病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借助电子显微镜进行检查。对于目前尚难培养而形态又非常典型的病毒,可直接从感染组织或分泌液,或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子显微镜检查,直接观察病毒粒子。
透射电子显微镜
负染技术
负染是指通过重金属盐在样品四周的堆积而
加强样品外周的电子密度,使样品显示负的
反差,衬托出样品的形态和大小。
铜网
样品
滤纸
染液(常用磷钨酸)
1-2 分钟后电镜观察
流感病毒形态
负染法的优缺点:
优点:快速简易( 10-20min );分辨率高;
图象清晰地病毒结构
缺点:敏感性低,要求病毒量在 107以上;
所有样品应处于悬浮状态
问题和讨论 某患者,突然发病,有畏寒、发热、头疼、
肌痛、厌食、乏力、鼻塞、流涕、咽痛和咳嗽等症状。热度可高达 39C,WBC 增高不明显。
( 1 )请你做出临床诊断; ( 2 ) 做病原学诊断应采集哪些标本?如何
进行病原学检测?