第 37 卷摇 第 5 期

2015 年 5 月

北 京 林 业 大 学 学 报

JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITYVol. 37, No. 5May, 2015

DOI: 10. 13332 / j. 1000鄄鄄1522. 20140255

针叶树 GID1 同源基因分离鉴定与功能预测

张运城1 摇 周长虹2 摇 钮世辉1 摇 李摇 伟1

(1 北京林业大学生物科学与技术学院,林木育种国家工程实验室摇 2 河北省木兰围场国有林场管理局)

摘要:GID1 作为赤霉素(GA)受体蛋白,是 GA 信号通路的重要组成部分,其编码基因 GID1 在被子植物中已经被广

泛克隆,但在针叶树种中的研究十分滞后。 为了分离针叶树 GA 受体 GID1 基因并推测其功能,本研究以拟南芥

GID1s 序列为探针,在油松高质量参考转录组内筛选并鉴别出了油松 GID1 直系同源基因;基于该基因序列同源克

隆了樟子松、白皮松、赤松 GID1 基因,通过 BLAST 获得了日本落叶松、火炬松、白云杉与挪威云杉的 GID1鄄like 基

因;对针叶树 GID1 基因进行序列保守性、蛋白结构和组织表达活性分析。 结果表明:针叶树种很可能只含有一个

GID1 基因,该基因在针叶树中具有很高的保守性;虽然与被子植物 GID1 之间的序列一致性较低,但其保持 GA 亲

和活性所必需的氨基酸残基十分保守,与其下游 DELLA 蛋白相互作用的功能域与结构同样十分保守,推测其在针

叶树 GA 信号转导中具有受体功能;表达分析显示 GID1 在挪威云杉不同组织和油松雌雄球花不同发育阶段间表达

较为稳定,表明 GID1 可能广泛参与这些组织的发育过程,针叶树 GA 信号调控通路中 GA 受体的转录调控可能并

不是核心调控机制。 研究结果为 GID1 基因在针叶树生长发育过程中的分子调控机制研究奠定了基础。关键词:赤霉素; 针叶树; GID1 基因; 分离鉴定; 功能预测

中图分类号:S718郾 46摇 摇 文献标志码:A摇 摇 文章编号:1000鄄鄄1522(2015)05鄄鄄0040鄄鄄09

摇 摇 收稿日期: 2014鄄鄄07鄄鄄21摇 修回日期: 2014鄄鄄12鄄鄄08

基金项目: 国家自然科学基金项目(31370657)、“948冶国家林业局引进项目(2012鄄鄄4鄄鄄40)。第一作者: 张运城。 主要研究方向:林木生物技术。 Email:zyc104@ 126. com摇 地址:100083 北京市清华东路 35 号北京林业大学生物科学

与技术学院。责任作者: 李伟,副教授。 主要研究方向:针叶树遗传改良。 Email:bjfuliwei@ bjfu. edu. cn摇 地址:同上。本刊网址: http:蛐蛐j. bjfu. edu. cn; http:蛐蛐journal. bjfu. edu. cn

ZHANG Yun鄄cheng1; ZHOU Chang鄄hong2; NIU Shi鄄hui1; LI Wei1 . Isolation and identification ofGID1 orthologous gene in conifers and its function prediction. Journal of Beijing Forestry University(2015)37(5) 40鄄鄄48 [Ch,30 ref. ]1 National Engineering Laboratory for Tree Breeding,College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing,100083,P. R. China;2 State鄄owned Forest Farm Administration of Mulan Weichang,Hebei,068450,P. R. China.

GID1 as the gibberellins (GA) receptor is an essential component of GA signaling pathway. TheGID1 genes have been cloned widely from angiosperms,but researches on them in conifers are scarcelydocumented. We obtained and identified the orthologous gene of GID1 from Pinus tabuliformistranscriptome with AtGID1s probe sequence. Based on this sequence,the GID1 genes were cloned from P.sylvestris var. mongolica, P. bungeana and P. densiflora and the GID1鄄like genes in P. taeda, Piceaglauca,P. abies and Larix kaempferi were also obtained from public database. The conservation of aminoacid sequences,protein structures and expression levels of coniferous GID1s were analyzed. The resultshowed that there probably is only one GID1 with highly conserved sequence in conifers. Although theidentity of GID1s is low between conifers and angiosperms,they have highly similar amino acids which areessential for binding affinity to GA and quite conserved functional domains which can interact withDELLA protein. Thus, these orthologous GID1 genes may have functions of receptor. Expression analysisshowed that the GID1 had stable expressions in different organs in P. abies and in different developmentalstages of male and female cones in Pinus tabuliformis, indicating that GID1 may widely participate indevelopmental process of these tissues,and the transcriptional regulation of GID1 might not be the keyregulatory mechanism in GA signaling pathway. Our study lays a foundation for the research of molecular

摇 第 5 期 张运城等: 针叶树 GID1 同源基因分离鉴定与功能预测

mechanism of GID1 in the growth and development of conifers.Key words摇 gibberellins; conifers; GID1 gene; isolation and identification; function prediction

摇 摇 赤霉素(Gibberellins,GAs)是一种重要的双萜

类植物激素,参与植物生长发育的许多重要过程,包括种子发芽、花芽分化、叶片伸展、木质部发育

等[1鄄鄄5]。 从 20 世纪 50 年代人们发现外施赤霉素能

够明显作用于针叶树球花发育起,国内外育种工作

者利用赤霉素对多种针叶树种进行了研究,在促进

针叶树开花和诱导雌雄球花分化方面积累了大量的

经验[6鄄鄄7]。 松科树种施用 GA4、GA7等极性较小的赤

霉素,能够明显促进其开花和球果发育。 马尾松

(Pinus massoniana)施用 GA1 / 3 和 GA4 / 7 能促进其雌

雄球花发育[8],欧洲赤松(P. sylvestris)球花发育后

期施用 GA4 / 7能显著增加雌花[9],38 年生西部落叶

松(Larix occidentalis)施用 GA4 / 7可促进其开花[10]。虽然赤霉素在针叶树中已经广泛应用于育种实践工

作,但是其作用的分子机制研究却尚未开展。近年来人们对赤霉素的合成及代谢途径有了深

入的认识,其信号转导途径的研究也随着水稻

( Oryza sativa ) 中 赤 霉 素 可 溶 性 受 体 GID1(Gibberellin insensitive dwarf1)的发掘而有了突破性

进展[11鄄鄄12]。 GID1 是赤霉素信号转导的关键因子之

一,与 GA 结合后可以介导植物生长抑制因子

DELLA 蛋白的泛素化降解,产生赤霉素效应,促进

植物生长。 由于 GID1 含有激素敏感性脂肪酶

(Hormone sensitive lipase,HSL)超基因家族同源的

保守序列,因此在植物体内存在许多相似序列,但其

中只有极少数成员具有 GA 结合活性。 水稻中目前

仅发现了 1 个[11],而 Nakajima 等[13] 在鉴定拟南芥

(Arabidopsis thaliana)赤霉素受体时发现了超过 10条和 OsGID1 基因相似的序列,但部分基因编码的

氨基酸序列在和 GA 结合的关键位点发生了突变,功能验证表明只有 3 个基因具有 GA 受体功能,因而推测针叶树中 GID1 基因可能也很少。 同时针叶

树基因组庞大,测序成本较高并且与被子植物进化

距离较远,这给针叶树 GID1 直系同源基因的克隆

带来了很大困难,因此至今没有任何针叶树 GID1基因被系统研究,严重阻碍了针叶树 GA 作用机制

相关研究的进展。目前针叶树中具有功能的 GID1 基因尚未确

定,而 GID1 作为赤霉素信号转导途径的关键调控

因子之一,对针叶树中赤霉素作用的分子机制研究

具有重要意义。 为了探究针叶树中 GID1 同源基因

的数量及其是否具有受体功能,本研究以拟南芥

GID1s 序列为探针对油松转录组进行了比对,通过

系统发育分析确定 GID1 的直系同源基因。 而后又

对樟子松(P. sylvestris var. mongolica)、白皮松(P.bungeana)、赤松(P. densiflora)、火炬松(P. taeda)、白云杉(Picea glauca)、挪威云杉(P. abies)、日本落

叶松(L. kaempferi)GID1 同源基因进行克隆与序列

分析,并通过系统发育树了解 GID1 基因的进化地

位。 对挪威云杉和油松 GID1 在不同时期和不同组

织的表达量进行分析,推测其在针叶树生长发育过

程中的作用。 研究结果为 GID1 基因在针叶树生长

发育过程中的分子调控机制研究奠定了基础。

1摇 材料与方法

1郾 1摇 植物材料

本研究所用材料:油松、白皮松取自北京林业大

学校园,樟子松取自河北围场龙头山种苗场,赤松来

自山东省林业科学研究院。1郾 2摇 针叶树 GID1 同源基因的克隆与鉴定

利用 拟 南 芥 与 水 稻 GID1 的 氨 基 酸 序 列:AtGID1a ( AT3G05120 )、 AtGID1b ( AT3G63010 )、AtGID1c(AT5G27320)和 OsGID1(Os05g0407500)与油松参考转录组(NCBI 登录号:SRA056887)进行

TBLASTN 比对,每次比对保留最相似的 5 条序列,将筛选到的序列剔除重复后再与拟南芥和水稻

GID1 序列通过最大似然法 (Maximum likelihood,ML)构建进化树,获得相似性最高的 5 条序列。 将

筛选到的序列与其他针叶树转录组序列( http: / /dendrome. ucdavis. edu)和 P. taeda 基因组( http: / /loblolly. ucdavis. edu / bipod / ftp / Genome _ Data /genome / pinerefseq / Pita / v1郾 01)进行比对,判定这些

序列是否为同一基因的不同区域并进行 CDS 预测。对不包含全长 CDS 的基因序列设计特异引物,利用

特异引物分别与 pUC19 载体插入位点两端引物对

油松全长 cDNA 文库进行扩增,对上下游扩增片段

克隆测序后进行拼接。 将获得的油松 GID1 相似蛋

白序列与拟南芥全基因组进行 TBLASTN 比对,获取

拟南芥中与它们相似的蛋白序列,用 MUSCLE[14鄄鄄15]

对所得全部基因的全长蛋白序列进行多重比对,基于 JTT 模型构建 ML 系统进化树,确定 GID1 同源基

因,Bootstrap 值通过 1 000 次 bootstrap 重复获得。根据获得的 GID1 同源基因设计通用引物,

Conifer / GID1鄄F: atggcttccagcgatgattatggattcaac, Conifer /GID1鄄R:gatgaagcatttggctaaagttccggaacc,以樟子松、白皮松、赤松的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增,回

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北摇 京摇 林摇 业摇 大摇 学摇 学摇 报 第 37 卷

收片段经蓝白斑筛选后测序。 日本落叶松、火炬松、白云杉与挪威云杉序列信息从针叶树公共数据库

(http: / / dendrome. ucdavis. edu)获得。1郾 3摇 针叶树 GID1 基因的序列分析

将所得 8 种针叶树基因的氨基酸序列和江南卷

柏 ( Selaginella moellendorffii )、 小 立 碗 藓

(Physcomitrella patens)以及水稻、拟南芥等已获得

功能验证的 GID1 蛋白的氨基酸序列用 ClustalX 和

GeneDoc 进行多重比对,利用 MEGA6郾 0 基于 JTT 模

型构建 ML 系统进化树,Bootstrap 值通过 1 000 次

bootstrap 重复获得。 利用 SWISS鄄MODEL ( http: / /swissmodel. expasy. org ) 进 行 蛋 白 质 3D 模 型 模

拟[16]。GenBank ID: 白 云 杉: P. glauca GID1

(BN001190. 1 ), 日 本 落 叶 松: L. kaempferi GID1( KF515230郾 1 ), 火 炬 松: P. taeda GID1( BN001190郾 1 ), 小 立 碗 藓: PpGID1L1 ( XM _001757014郾 1)、 PpGID1L2 ( EU262749郾 1 ), 江南卷

柏:SmGID1a ( XM _002978792郾 1)、 SmGID1b ( XM _002993346郾 1)。1郾 4摇 针叶树 GID1 基因表达模式分析

挪威云杉 GID1 基因(MA_855574g0010)在不

同时期及不同组织中的表达量数据从云杉基因组数

据库的 exPlot 中获得(http: / / congenie. org / explot)。

将油松雌雄球花从表型可辨别到发育成熟分为 6 个

阶段,在北京林业大学校园内选定 3 株成熟油松,每个阶段分别采样并构建测序文库,利用 IlluminaHiseq 2000(Illumina,USA)第二代高通量测序平台

进行测序,利用 Tophat[17鄄鄄18] 计算 GID1 在每个阶段

的表 达 丰 度, 基 因 表 达 量 用 RPKM ( reads perkilobase per million reads)表征。

2摇 结果与分析

2郾 1 针叶树 GID1 同源基因克隆与鉴定

以拟南芥与水稻 GID1 的氨基酸序列为探针,在油松参考转录组中进行 BLAST,共获得了 5 个与

GID1 相似性最高的序列,并进行了全长 CDS 克隆,分别命名为 PtGID1、PtGID1鄄L1、PtGID1鄄L2、PtGID1鄄L3、PtBSU1。 但基于 BLAST 的相似性只能反映序列

的相似程度,并不能区分它们的同源关系。 为了避

免建树时因序列相似度高而筛选到非直系同源基

因,又将所得序列与拟南芥全基因组进行比对,反选

到 20 个相似性最高的基因。 基于所有基因的氨基

酸序列构建 ML 进化树(图 1),结果表明,通过反选

获得的基因能够很好地将这 5 个序列的关系区分开

来,只有 PtGID1 和水稻与拟南芥的 GID1 聚为一类,属直系同源基因,而其余 4 个基因与其进化距离

较远。

箭头指示的是在本研究中所克隆的油松 GID1 相似基因。 The arrows indicate GID1鄄like genes in P.tabuliformis in this study.

图 1摇 油松与拟南芥 GID1鄄like 基因系统发育分析

Fig. 1摇 Phylogenetic analysis of GID1鄄like genes from Pinus tabuliformis and Arabidopsis thaliana摇

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摇 第 5 期 张运城等: 针叶树 GID1 同源基因分离鉴定与功能预测

摇 摇 上述结果表明,油松全基因组中很可能只有一

个 GID1 同源基因———PtGID1。 以其序列为参考,设计通用引物,以樟子松、白皮松、赤松 DNA 为模板进

行克隆测序,结合针叶树公共数据库信息,共获得

8 种针叶树 GID1 同源基因序列。 这些同源基因全

长分别为:白皮松 1 565 bp、日本落叶松 1 582 bp、白云杉和挪威云杉 1 580 bp、油松和火炬松 1 599 bp、赤松 1 601 bp、樟子松 1 604 bp,它们都含有一个内

含子和两个外显子,白云杉和挪威云杉 GID1 编码

352 个氨基酸残基,日本落叶松 GID1 编码 355 个氨

基酸残基,其余针叶树 GID1 基因编码 357 个氨基酸

残基。2郾 2摇 针叶树 GID1 同源基因的序列分析

对 8 种针叶树的 GID1 基因进行序列比对,发现

这些基因在针叶树间十分保守。 这些基因的 DNA序列与被子植物同源基因一样均包含 1 个内含子

(图 2),剪切方式符合 GT / AG 的剪接模式。 与外显

子序列相比,不同属针叶树 GID1 内含子变异位点

相对较多,但在属内却保持着高度保守性,如油松与

挪威云杉内含子间的相似度为 85% ,而挪威云杉与

白云杉内含子序列几乎完全一致,相似度达 99% ,表明 GID1 在针叶树中可能对碱基突变非常敏感。

白色框代表碱基,黑色与灰色条框分别表示相同碱基比例为 100%与 80%序列;两个箭头间序列为 GID1 基因内含子。 The white framesindicate bases,the black and gray frames indicate the sequences with 100% and 80% similarity bases,respectively. The sequences between twoarrows indicate introns in GID1 genes.

图 2摇 8 种针叶树 GID1 基因内含子序列特征

Fig. 2摇 Characteristics of introns sequence in the GID1 of eight conifers摇

摇 摇 将 8 种针叶树的 GID1 蛋白序列和江南卷柏、小立碗藓以及水稻、拟南芥等已获得功能验证的

GID1 蛋白序列进行多重比对(图 3),结果显示,这 8种针叶树的 GID1 序列都具有激素敏感性脂肪酶活

性区域 HGG 和 GXSXG。 和水稻、拟南芥一样,构成

HSL 家族催化三联体的主要氨基酸(S、D、H)中,S、D 在这 8 种序列中是保守的,而 H 被 I 或 V 取

代[11郾 13]。 GID1 蛋白与 GA 或 DELLA 蛋白有 13 个

结合功能域,从 N 端到 C 端依次是 TWVLIS、LDR、FFHGGSF、HS、 IYD、 YRR、 DGW、 GDSSGGNI、 GNI、MF、LDGKYF、WYW 和 GFY[19]。 在 8 种针叶树中,TWVLIS 中的 W 被 F 取代,日本落叶松和云杉 LDR中的 D 被 E 取代,而其他区域都是保守的。 自发突

变证实与水稻 GID1 功能相关的 3 个氨基酸(G169、G196和 R251) [20鄄鄄21] 在 8 种针叶树 GID1 中都是保守

的。 对保持水稻 GID1 的 GAs 亲和活性必需的 17

个氨基酸残基[22]在这些序列中都得到了确认,除了

白云杉和水稻 C鄄326 位的 V 相同外,其余 7 种针叶

树该位点和 AtGID1b、AtGID1c 相同,均为 I。 这些

结果表明,针叶树 GID1 蛋白在 GA 信号转导中发挥

重要功能的氨基酸残基与被子植物一样是保守的,表明它们在 GA 作用机制中的受体功能可能是完

整的。以 8 种针叶树和已进行功能验证的部分物种

GID1 氨基酸序列构建 ML 进化树,结果如图 4 所

示,GID1 基因在进化上的分歧与这些物种进化地位

相一致,苔藓、蕨类、被子植物及裸子植物各聚为一

类。 与被子植物成员相比,针叶树 GID1 进化速度

明显更为缓慢,它们之间积累的差异比拟南芥中 3个同源基因成员间的差异还小。 GID1 在针叶树中

的这种极端保守性在进化中的意义有待进行进一步

研究。

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北摇 京摇 林摇 业摇 大摇 学摇 学摇 报 第 37 卷

*为 GID1 蛋白与 GA 或 DELLA 蛋白的结合位点,音为保持 GAs 亲和活性必需的氨基酸残基,方框为 HSL 家族蛋白的同源保守序列。 * indicates the binding sites of GA and DELLA proteins in GID1. 音indicates the residues required for GA binding.The conserved sequences of HSL family are marked by black boxes.

图 3摇 GID1 同源基因氨基酸序列比对Fig. 3摇 Alignment of amino acid sequences of GID1 homologues

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摇 第 5 期 张运城等: 针叶树 GID1 同源基因分离鉴定与功能预测

图 4摇 针叶树 GID1 蛋白与其他 GID1 蛋白的进化树分析

Fig. 4摇 Unrooted phylogenetic tree of GID1 proteins from conifers and other plants摇

2郾 3摇 针叶树 GID1 蛋白结构分析

OsGID1 和 AtGID1a 蛋白的晶体结构已经获得

了解析,与 GA 和 DELLA 蛋白作用的关键位点和结

构域都已得到阐述[22鄄鄄23]。 为推测 8 种针叶树 GID1蛋白受体功能的完整性,以 OsGID1 和 AtGID1a 蛋

白的晶体结构为模板,对油松 PtGID1 蛋白结构进行

了同源建模(图 5)。 结果表明,油松 PtGID1 主要结

构是由 8 条 茁 折叠片和 7 个 琢 螺旋组成的形似袋

状的结构,在其 N 端有两个 琢 螺旋,该结构和水稻

OsGID1 蛋白的晶体结构十分相似,并且在对 GAs的亲和与 DELLA 蛋白的识别中具有至关重要的作

用[22]。 但 PtGID1 在 N 端比 OsGID1 多出一个 琢 螺

旋(琢a),这和 AtGID1a 的结构相同[23]。 OsGID1 和

AtGID1a 的受体功能已经被证实,这也表明本研究

中 PtGID1 与 GA 潜在结合部位的结构与水稻和拟

南芥在进化上是保守的,可能具有相似的功能。2郾 4摇 针叶树 GID1 基因的表达模式分析

通过云杉基因组数据库(http: / / congenie. org)数据,对挪威云杉 GID1 基因(MA_855574g0010)在多个组织中的表达模式进行了分析,结果见图 6。云杉 GID1 在不同组织中均有表达,而且表达水平

比较稳定,在所有组织间表达量变化幅度不大,其中

在嫩枝顶端的针叶(N4)表达丰度最高,而在木质部

(W1)中表达丰度最低,两者间的表达量相比相差

最大,仅为 1郾 94 倍。 这表明这些组织的发育过程均

需要 GID1 及 GA 信号通路的参与,而生长旺盛的组

织可能需要更敏感的 GA 感受能力,这与 GA 促进

植物生长的生物学功能是一致的。研究表明 GA 在针叶树球花发育过程中具有重

要的调控作用,对油松施用 GA4 / 7 能促进雌球花发

圆球所示的是 GA 结合部位,箭头所指为 GID1 结合 GA 后的 N 端

(N鄄Ex)状态。 The sphere shows the site of GA binding, the arrowindicates the status of N鄄terminal extension (N鄄Ex) after GA binding.

图 5摇 OsGID1 蛋白结构及 PtGID1 的同源建模

(E value: 2郾 17 伊 10 - 129,QMEAN Z鄄Score: - 2郾 19)Fig. 5摇 Structure of the OsGID1 and the homology modeling of

PtGID1 (E value: 2郾 17 伊 10 - 129, QMEAN Z鄄Score: - 2. 19)摇

育[24鄄鄄25]。 为了了解 GID1 在其中的作用,我们对油

松营养芽和不同发育阶段的雌雄球花中的 GID1 表

达丰度进行了分析。 从图 7 中可以看出,PtGID1 在

油松雌雄球花发育过程中的表达和挪威云杉相似,在不同发育阶段间的表达量相比,最大倍数为

2郾 16。 在发育初期雌雄球花的相对表达量未及营养

芽的 2 倍,整个发育阶段该基因的表达水平变化幅

度不高,表明油松 GA 信号调控通路中 GA 受体的

转录调控可能并不是核心调控机制,被子植物中

GA 信号转导调控是通过 GID1 介导的 DELLA 蛋白

水平的降解实现的,这一机制可能在裸子植物与被

子植物分化之前便已经进化获得[26],GID1 在针叶

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北摇 京摇 林摇 业摇 大摇 学摇 学摇 报 第 37 卷

N1. 针叶(2 年生) Needles(2 years old); N2. 针叶(1 年生) Needles(1 years old); N3. 被感染针叶 Infected needles; N4. 顶端末梢针叶 Needles from dired twig ; N5. 繁殖枝针叶 Needles from girled twig; N6. 营养枝针叶(8 月) Needles fromvegetative shoots (Aug. ); N7. 营养枝针叶(9 月) Needles from vegetative shoots( Sept. ); N8. 早晨的针叶 Early morningneedles; N9. 夜间的针叶 Night needles; N10. 正午的针叶 Mid鄄day needles; N11. 下午的针叶 Late afternoon needles; V1. 营养枝(5 月) Vegetative shoots(May); V2. 营养枝(6 月) Vegetative shoots(June); W1. 木质部(6 月) Wood( June); W2. 木质部(8 月) Wood(Aug. ); B1. 发育初期的芽 Buds in early development season; B2. 成熟后期的芽 Buds in late developmentseason; S1. 环生枝的茎 Stem from girdled twig; S2. 营养枝的茎 Stem from vegetative shoots; P. 球果 Pineapple galls; I. 未成

熟的雄花芽 Immature male cone.图 6摇 挪威云杉 GID1鄄like 基因的相对表达量

Fig. 6摇 Relative expression level of GID1鄄like gene in Picea abies摇

树 GA 作用机制中的作用有待进一步深入研究。

VB 为营养芽,M1 ~ M6、F1 ~ F6 分别代表雄花和雌花发育的 6 个

时期。 VB indicates vegetative bud, M1 - M6 and F1 - F6 representmale and female cones at six development stages, respectively.

图 7摇 油松雌雄球花不同时期 GID1 基因的相对表达量

Fig. 7摇 Relative expression level of GID1 gene inP. tabuliformis at different stages

摇

3摇 结论与讨论

本研究首次在油松全基因组中分离鉴定出了一

个 GID1 直系同源基因,并同源克隆了部分针叶树

的 GID1 同源基因,获得的 8 种针叶树 GID1 序列间

具有高度的一致性,它们都含有 HSL 家族的 HGG和 GXSXG 结构域及与 GA 和 DELLA 蛋白相结合的

作用位点。 通过和 OsGID1 蛋白三级结构的对比表

明,PtGID1 与 OsGID1 在 GA 结合部位非常相似,但在 N 端与 AtGID1a 一样比 OsGID1 多出一个 琢 螺旋

(琢a)。 它们和羧酸酯酶结构相似,不过和其他

GID1 一样,其 N 端的 62 个氨基酸残基形成了特殊

的 N 端延伸(N鄄Ex),这对赤霉素受体的功能具有重

要作用。 以上结果表明,和被子植物一样,针叶树

GID1 基因也是由 HSL 家族基因衍化而来,其关键

结构位点和功能位点具有很高的保守性,它们的结

构和功能应该是完整的;因而推测它们可能具有和

被子植物 GID1 相似的 GA 受体功能。对挪威云杉和油松不同组织 GID1 基因的表达

模式分析表明,该基因在球花和其他组织中均有表

达,并且在两个物种中的表达都较为稳定,虽然生长

旺盛的组织略高,但变化幅度不高,表明 GID1 可能

广泛参与这些组织的发育过程,并且其没有明显的

组织特异性。 这和拟南芥、江南卷柏的表达模式相

似[13,19],但和葡萄(Vitis vinifera)、陆地棉(Gossypiumhisutum)等植物研究结果不同[27鄄鄄28],可能是由于这

些植物的 GID1s 功能分化,使其组织特异性增强造

成的。 水稻和拟南芥中 GID1 超表达会引起赤霉素

超敏感的表型,是由于 GID1 增强了植物感受 GA 的

能力。 对棉花、板栗(Castanea mollissima)等植物外

施赤霉素后 GID1 表达下调[28鄄鄄29],表明 GA 和 GID1的表达存在反馈调节。 因此推测本研究中 GID1 表

达丰度的变化可能和针叶树组织中内源赤霉素含量

的变化有关。 其表达量变化与 GA 浓度的关系以及

相关的生理作用还需要进一步研究。虽然松科树种施用 GA4、GA7 等极性较小的赤

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摇 第 5 期 张运城等: 针叶树 GID1 同源基因分离鉴定与功能预测

霉素能够明显促进其开花和球果发育的现象一直吸

引着育种学家的注意,但其作用的分子机制却并不

清楚。 GID1 基因作为赤霉素信号通路的可溶性受

体,是赤霉素作用的关键调控因子之一。 对辐射松

(Pinus radiata)内源 GAs 含量的测定结果显示,GA3

在营养芽和雄花芽中含量虽然相对较高但比较稳

定,而 GA4则差异明显,特别是雄球花芽中含量变化

最大,这也表明 GA4 可能和它们的发育调节有

关[30]。 在鉴定拟南芥 AtGID1s 基因时, Nakajima等[13]发现在供试的活性 GAs 中,AtGID1s 和 GA4的

亲和力最高,并推测可能是由于 GA4是拟南芥中主

要的内源 GAs,并且是其活性较高的原因。 因此

GA4调节松科树种发育可能和 GA 信号通路对其敏

感性有关。参 考 文 献

[ 1 ] MUTASA鄄GOTTGENS E,HEDDEN P. Gibberellin as a factor infloral regulatory networks [ J] . Journal of Experimental Botany,

2009,60(7):1979鄄鄄1989.[ 2 ] PIMENTA L M, KNOP N, LANGE T. Stamen鄄derived bioactive

gibberellin is essential for male flower development of Cucurbitamaxima L. [ J] . Journal of Experimental Botany,2012,63 (7):

2681鄄鄄2691.[ 3 ] OGAWA M, HANADA A, YAMAUCHI Y, et al. Gibberellin

biosynthesis and response during Arabidopsis seed germination

[J] . Plant Cell,2003,15(7): 1591鄄鄄1604.[ 4 ] GABRIELE S, RIZZA A, MARTONE J, et al. The Dof protein

DAG1 mediates PIL5 activity on seed germination by negativelyregulating GA biosynthetic gene AtGA3ox1 [J] . The Plant Journal,

2010,61( 2): 312鄄鄄323.[ 5 ] 李哲馨,钮世辉,高琼,等. 赤霉素调控木质部发育的细胞学研

究[J] . 北京林业大学学报,2014,36(2):68鄄鄄73.LI Z X,NIU S H,GAO Q,et al. Cytological study of gibberellinregulated xylem development [ J ] . Journal of Beijing Forestry

University, 2014,36(2):68鄄鄄73.[ 6 ] 盛楚兴. 针叶树的阶段转变及成花诱导研究现状[ J] . 北京林

业大学学报,1986,8(1):110鄄鄄123.SHENG C X. The current researches on developmental phasetransitions and floral induction in conifers[ J] . Journal of Beijing

Forestry University, 1986,8(1):110鄄鄄123.[ 7 ] PHARIS R P, WEBBER J E, ROSS S D. The promotion of

flowering in forest trees by gibberellin A4 / 7 and cultural treatments:a review of the possible mechanisms [ J] . Forest Ecology and

Management,1987,19(1):65鄄鄄84.[ 8 ] 江玲,周燮,王章荣,等. 马尾松雌雄球花的形成与赤霉素和脱

落酸及细胞分裂素的关系[ J] . 南京林业大学学报:自然科学

版,1998,22 (3):61鄄鄄65.JIANG L,ZHOU X,WANG Z R,et al. Relationship between theformation of male or female strobili and the levels of GAs,ABA,CTKs in Masson pine[ J] . Journal of Nanjing Forestry University:

Natural Science Edition,1998,22(3):61鄄鄄65.

[ 9 ] ALMQVIST C. Timing of GA4 / 7 application and the flowering ofPinus sylvestris grafts in the greenhouse [ J] . Tree Physiology,

2003,23(6):413鄄鄄418.[10] SHEARER R C,STOEHR M U,WEBBER J E,et al. Seed cone

production enhanced by injecting 38鄄year鄄old Larix occidentalis

Nutt. with GA4 / 7[J] . New Forests,1999,18(3):289鄄鄄300.[11] UEGUCHI鄄TANAKA M, ASHIKARI M, NAKAJIMA M, et al.

Gibberellin insensitive dwarf 1 encodes a soluble receptor for

gibberellin[J] . Nature,2005,437:693鄄鄄698.[12] UEGUCHI鄄TANAKA M, NAKAJIMA M, MOTOYUKI A, et al.

Gibberellin receptor and its role in gibberellin signaling in plants

[J] . Annual Review of Plant Biology,2007,58:183鄄鄄198.[13] NAKAJIMA M,SHIMADA A,TAKASHI1 Y,et al. Identification

and characterization of Arabidopsis gibberellin receptors[ J] . The

Plant Journal,2006,46(5):880鄄鄄889.[14] EDGAR R C. Muscle: a multiple sequence alignment method with

reduced time and space complexity [ J ] . BMC Bioinformatics,2004,5(1):113.

[15] EDGAR R C. Muscle: multiple sequence alignment with highaccuracy and high throughput[ J] . Nucleic Acids Research,2004,

32(5):1792鄄鄄1797.[16] ARNOLD K, BORDOLI L, KOPP J, et al. The swiss鄄model

workspace: a web鄄based environment for protein structure

homology modeling[J] . Bioinformatics,2006,22(2):195鄄鄄201.[17] KIM D,SALZBERG S L. Tophat鄄fusion: an algorithm for discovery

of novel fusion transcripts [ J] . Genome Biology,2011, 12 (8):R72.

[18] TRAPNELL C, PACHTER L, SALZBERG S L. Tophat:discovering splice junctions with RNA鄄Seq [ J] . Bioinformatics,

2009,25(9):1105鄄鄄1111.[19] HIRANO K,NAKAJIMA M,ASANO K,et al. The GID1鄄mediated

gibberellin perception mechanism is conserved in the lycophyteSelaginella moellendorffii but not in the bryophyte Physcomitrella

patens[J] . The Plant Cell,2007,19(10):3058鄄鄄3079.[20] HIRANO K, UEGUCHI鄄TANAKA M, MATSUOKA M. GID1鄄

mediated gibberellin signaling in plants [ J ] . Trends in Plant

Science,2008,13(4):192鄄鄄199.[21] UEGUCHI鄄TANAKA M, NAKAJIMA M, KATOH E, et al.

Molecular interactions of a soluble gibberellin receptor, GID1,witha rice DELLA protein,SLR1,and gibberellin[ J] . The Plant Cell,

2007,19(7):2140鄄鄄2155.[22] SHIMADA A, UEGUCHI鄄TANAKA M, NAKATSU T, et al.

Structural basis for gibberellin recognition by its receptor GID1

[J] . Nature,2008,456:250鄄鄄253.[23] MURASE K, HIRANO Y, SUN T P, et al. Gibberellin鄄induced

DELLA recognition by the gibberellin receptor GID1[ J] . Nature,

2008,456:459鄄鄄464.[24] SHENG C, WANG S. Effect of applied growth regulators and

cultural treatments on flowering and shoot growth of Pinustabulaeformis[J] . Canadian Journal of Forest Research,1990,20

(6):679鄄鄄685.[25] ZHAO P,FAN J,ZHANG S,et al. Effects of gibberellins A4 / 7,6鄄

benzylaminopurine and chlormequat chloride on the number ofmale and female strobili and immature cones in Chinese pine

74

北摇 京摇 林摇 业摇 大摇 学摇 学摇 报 第 37 卷

(Pinus tabuliformis) with foliar sprays [ J] . Journal of Forestry

Research,2011,22(3):353鄄鄄359.[26] WANG Y,DENG D. Molecular basis and evolutionary pattern of

GA鄄GID1鄄DELLA regulatory module [ J] . Mol Genet Genomics,

2014,289(1):1鄄鄄9.[27] 金良,葛晖,陈尚武,等. 2 个葡萄 GID( gibberellin insensitive

dwarf)基因的克隆与表达 [ J] . 中国农业大学学报,2013,

18(4):64鄄鄄70.JIN L,GE H,CHEN S W,et al. Cloning and expression analysis oftwo grape GID(gibberellin insensitive dwarf) genes[ J] . Journal of

China Agricultural University,2013,18(4):64鄄鄄70.[28] 董静,尹梦回,杨帆,等. 棉花赤霉素不敏感矮化 GID1 同源基

因的克隆和表达分析 [ J] . 作物学报,2009,35 (10 ):1822鄄鄄

1830.DONG J, YIN M H, YANG F, et al. Cloning and expressionprofiling of gibberellin insensitive dwarf GID1 homologous genes

from cotton[ J] . Acta Agronomica Sinica,2009,35(10):1822 鄄鄄

1830.[29] 李兴亮,郭献平,沈元月,等. 板栗赤霉素缺陷型短雄花序芽变

的初步鉴定及 CmGID1 基因的表达分析[ J] . 园艺学报,2011,

38(7):1251鄄鄄1258.LI X L,GUO X P,SHEN Y Y,et al. Preliminary identification ofGAs鄄deficient short male catkin mutant and expression analysis ofCmGID1 in Castanea mollissima [ J] . Acta Horticulturae Sinica,

2011,38(7):1251鄄鄄1258.[30] FERNANDEZ H,FRAGA M,BERNARD P,et al. Quantification of

GA1,GA3,GA4,GA7, GA9,and GA20 in vegetative and male conebuds from juvenile and mature trees of Pinus radiata [ J] . Plant

Growth Regulation,2003, 40(3):185鄄鄄188.

(责任编辑摇 赵摇 勃摇 董晓燕

责任编委摇 苏晓华摇 诸葛强)

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